Synthèse de l'or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation

Résumé

Ce protocole décrit un procédé de préparation simple pour nanoparticules d'or intégré liposomes photosensibles avec les matériaux disponibles dans le commerce. Il montre également comment évaluer le processus de cavitation de microbulles des liposomes de synthèse sur le traitement de laser pulsé.

Résumé

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Introduction

La possibilité de déclencher la libération du médicament en utilisant des stimuli externes est un moyen attrayant de livrer les médicaments dans la mode spatio, temporalité et de dosage contrôlé avec une spécificité maximale et peu d'effets indésirables. Parmi un large éventail de systèmes exogènes de stimuli-sensibles (lumière, champ magnétique, les ultrasons, rayonnement micro-ondes), les plates-formes légères déclenché sont attrayants, en raison de leur non-invasif, la simplicité et l'adaptabilité dans les cliniques. ¹ recherches approfondies dans la dernière décennie a fourni une variété de technologies de plate-forme, tels que l'or responsable proche infrarouge-lumière (UA) nanocages revêtus de polymères intelligents, ^2, des nanoparticules polymériques photo-labile (IP) conjugués à des ^{médicaments, 3 et} nanovésicules de porphysome auto-assemblées. ⁴ Cependant , ces technologies sont encore au stade de développement préclinique, et nécessitent une bonne compréhension et l'optimisation des paramètres intervenant dans le processus de lancement et de suitelaminage de la libération du médicament.

L'un des plus simples et facilement accessibles des méthodes pour la préparation d'un tel système est d'intégrer Au IP avec des liposomes thermosensibles ^5,6, les deux qui sont largement disponibles sur le marché et ont été largement étudiés dans les essais précliniques et cliniques, même. Malgré la limitation de l'activation des tissus profonds de Au IP à leur longueur d'onde plasmonique, par rapport à l'UA nanostructures proche infrarouge activé (par exemple, nanocages), ce système tient toujours très prometteur lorsqu'il est utilisé dans de petits animaux ou pour l'administration topique chez l'homme. ⁷ Il y a des premiers efforts en combinant au IP avec des liposomes pour la libération lumière déclenché. ^8-11 Alors que la plupart d'entre eux se concentrent sur ​​la nouveauté des matériaux, les problèmes d'accessibilité et d'évolutivité doivent être abordées. En outre, des rapports sur les mécanismes de libération à l'aide de ces nanocarriers sont encore limitées.

Ici, la fabrication de photo-sensibleliposomes, simultanément chargés de médicaments et hydrophiles Au NPS a été décrit. Calcéine est utilisé comme composé modèle pour évaluer l'efficacité d'encapsulation et le profil de libération du système. En outre, dans ce système, la lumière absorbée par les IP Au dissipe au microenvironnement entourant sous forme de chaleur, ce qui entraîne une augmentation de la température locale. Microbulles d'air sont générées au cours du chauffage au laser et provoquer la rupture mécanique des liposomes (figure 1). Le mécanisme de la cavitation des microbulles est confirmée par des mesures d'hydrophones.

Protocole

1. Préparation

1. Nettoyer rond de 100 ml des flacons de fond à l'aide de l'eau régale (1 partie d'acide nitrique concentré (HNO ₃₎ et 3 parties d'acide chlorhydrique concentré (HCl)) et laver les flacons avec de l'eau DI. Autoclave les flacons et les sécher dans un four à air chaud à 100 ° C pendant 15 min. Envelopper et stocker les flacons stériles jusqu'à utilisation.
2. Stériliser l'ensemble mini-extrudeuse à main en utilisant 70% d'éthanol.
3. Tourner à l'évaporateur rotatif et régler la température du bain d'eau chaude et de la tour de refroidissement à 37 ° C et 4 ° C, respectivement.
4. Préparer 60 mM calcéine solution mère en dissolvant 374 mg de calcéine dans 10 ml de 0,1 mM tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4). Ajuster le pH à 7,4 en utilisant M d'hydroxyde de sodium (NaOH) une solution.

2. Synthèse des liposomes

1. Éliminer les lipides (1,2-sn-glycéro Dipalmitoyl--3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphocholigne (MPPC) et 1, 2-distéaroyl sn-glycéro-3-phosphoethanol-amine N - [carboxy (polyéthylèneglycol) -2000] (sel d'ammonium) (DSPE-PEG2000)) du congélateur (-20 ° C) et les dégeler à la température ambiante.
2. Peser 15,9 mg de DPPC, 1,3 mg MPPC, et 2,8 mg DSPE-PEG2000. Dissoudre ensemble dans 2 ml de chloroforme.
3. Transférer la solution de chloroforme dans le ballon à fond rond stérile et on évapore le solvant en utilisant un évaporateur rotatif sous pression réduite, pour former une couche mince et sec de lipides.
4. Hydrater la couche lipidique à 45 ° C avec 2 ml d'une solution aqueuse contenant de 30 min 1,95 ml 60 mM calcéine préparé à l'étape 1.4 et 50 ul Au IP (3,36 × 10 ¹⁶ particules / ml).
5. Préchauffer le bloc chauffant à 45 ° C. Placez un filtre à membrane de polycarbonate de 200 nm entre les supports de filtres et d'assembler l'ensemble mini-extrudeuse. Vérifiez la fuite potentielle avec de l'eau DI.
6. Remplir une des seringues de 1 ml d'une solution de liposomes de l'étape 2.4 et EXTRUde l'échantillon en faisant passer la solution à la seringue à l'autre extrémité de l'assemblage de mini-extrudeuse. Répétez 11 fois.
7. Exécuter les liposomes de synthèse à travers une colonne de dessalage PD-10 pour retirer les libres Au IP, des lipides et la calcéine en utilisant comme éluant du PBS selon le protocole du fabricant.
8. Stocker les échantillons dans des tubes stériles à 4 ° C et utiliser dans les 2 jours.

3. calcéine sortie de liposomes avec chauffage

1. Calculer la molarité lipidique de la solution mère en additionnant les molarités de DPPC, MPPC et DSPE-PEG2000 dans l'étape 2.2. Diluer la solution liposome boursier pour mM concentration 5 des lipides en utilisant un tampon mM PBS 0,1 (pH 7,4). Transférer les échantillons dans un tube de centrifugeuse (2 ml).
2. Placer le tube dans un bain d'eau chaude, et d'élever la température progressivement de 25 à 70 ° C. Augmenter la température à une vitesse de 1 ° C / min ici.
3. Collecter des aliquotes (10 ul) à différents points de température (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 et 70 ° C).
4. Ajouter 10 ul de 2% de Triton X-100 à 2 ml d'une solution aliquote liposomale pour digérer les liposomes pendant 10 min à température ambiante et à obtenir une libération complète de calcéine.
5. Transférer 200 pl de la solution liposomale à chaque puits de la microplaque à 96 puits et on mesure l'intensité de fluorescence des échantillons prélevés à l'aide d'un lecteur de microplaques à fluorescence. Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission de calcéine sont 480 et 515 nm, respectivement.
6. Prenant l'intensité de fluorescence des Triton X-100 échantillons traités comme libération de 100%, calculer le pourcentage de la calcéine libérée à chaque point de temps, en utilisant la formule:
   
   Pi est l'intensité de fluorescence de la solution à un instant donné. F _{i et} F _x sont les intensités de fluorescence normalisée initiale et finale de la solution, respectivement.

4. calcéine Relocation de liposomes avec laser pulsé

1. Transférer la solution de liposome 100 ul dans une cuvette en quartz et le placer dans un support de cuvette. Utilisez un Nd pulsé: YAG avec une durée d'impulsion de 6 ns à 532 nm de longueur d'onde que la source de lumière. Utilisez le suivant Paramètres Laser - Taux de répétition: 1 Hz; La densité d'énergie du laser: 1 mJ / cm ^2; Diamètre du faisceau: 0,5 mm.
2. Guider le faisceau laser collimaté à travers la cuvette de telle sorte que la lumière traverse la solution de liposomes et de recueillir des aliquotes après diverses impulsions.
3. Ajouter 10 ul de 2% de Triton X-100 à 2 ml d'une solution aliquote liposomale pour digérer les liposomes pendant 10 min à température ambiante et à obtenir une libération complète de calcéine.
4. Considérant calcéine est sensible à la lumière et peut être blanchi pendant l'expérience laser, pré-mesurer l'effet de blanchiment de laser pulsé sur la solution de calcéine pour normaliser les données de liposome de presse.
   1. Plus précisément, exposer solution de calcéine (60 mM) à impulsions wi lasere fréquence de 1 Hz pour faire varier le nombre d'impulsions (0, 25, 50 et 100). Mesurer l'intensité de la fluorescence de calcéine avec excitation et d'émission des longueurs d'onde de 480 et 515 nm, respectivement, avant et après l'exposition au laser.
   2. Calculer la quantité de blanchiment (intensité de fluorescence de la calcéine avant intensité laser exposition / de fluorescence de la calcéine après le nombre d'impulsions spécifique). Utiliser ce facteur pour normaliser les valeurs obtenues à partir d'échantillons de liposomes en multipliant l'intensité de fluorescence des liposomes avec le facteur.
5. Mesurer l'intensité de la fluorescence de l'échantillon prélevé à l'aide d'un lecteur de microplaques à fluorescence à des longueurs d'ondes d'excitation et d'émission à 480 et 515 nm, respectivement.
6. Prenant l'intensité de fluorescence des Triton X-100 échantillons traités comme libération de 100%, calculer le pourcentage de la calcéine libérée à chaque nombre d'impulsions, en utilisant la formule:
   
   Ft est l'intensité de fluorescence de la solution à un nombre d'impulsions donné après normalisation. F _{i et} F _x sont les intensités de fluorescence normalisée initiale et finale de la solution, respectivement.

5. Mesure des impulsions de pression

1. Placer 100 ml de l'échantillon sur une lame de microscope et définir le focus du laser sur l'échantillon.
2. Plongez un hydrophone d'aiguille (1 mm de diamètre et 450 nV / Pa sensibilité) dans la solution.
   Attention: L'hydrophone ne doit pas être éclairée par la lumière laser pour éviter le dommage.
3. Irradier l'échantillon avec le laser à impulsions avec un nombre variable d'impulsions (0-100) et l'énergie d'impulsion (20 à 160 pJ / impulsion).
4. Enregistrer les signaux de pression à l'aide d'un oscilloscope numérique.

Résultats

Les liposomes ont été préparés en utilisant une technique mince d'hydratation de film conventionnelle avec DPPC, MPPC et DSPE-PEG2000 selon un rapport molaire de 86: 10: 4 ou 7,95: 0,65. 1,39 mg / ml ¹² La taille de Au IP est essentiel de déterminer la lumière pour chauffer l'efficacité de conversion lors de l'expérience de l'excitation laser suivant. Plus la taille de Au IP, plus élevé est l'efficacité de transduction. ¹³ Ainsi 5 nm A...

Discussion

hydratation de la couche mince est la méthode classique de préparation des liposomes. solvants organiques (chloroforme dans ce cas) ont été utilisés d'abord pour dissoudre les lipides et ensuite éliminés dans un évaporateur rotatif à 37 ° C pour produire un film mince de lipides sur le flacon. Ce film lipidique a été hydraté avec la solution aqueuse contenant 60 mM calcéine et 5 nm Au IP. Au cours du processus d'hydratation, la température a été maintenue à environ 50 ° C et le ballon a été ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	850355P	Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	855675P	Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	880120P	Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles	Sigma Aldrich	752568-100mL	5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein	Sigma Aldrich	C0875-10g	60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water	Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100	Sigma, Life Sciences	X-100	To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor	Buchi (Switzerland)	R 210	Used for Lipososme preparation
Heating bath	Buchi (Switzerland)	B 491	Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller	Buchi (Switzerland)	V-850	Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump	Buchi (Switzerland)	V-700	Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller	Polyscience		Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610000	Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610017	Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm	Whatmann	800281	Used for extrusion of liposomes
Filter Support	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610014	Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium	GE Healthcare, Life sciences	17-0851-01	Used to purify the liposomes
Centrifuge	Sigma Laboratory Centrifuges	3K30	Used to concentrate the liposomal solution
Rotor	Sigma	19777-H	Used to concentrate the liposomal solution
Zetasizer	Nano ZS Malvern		Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-2450	Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer	Molecular Devices	SpectraMax M5	Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser	NewWave Research		532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone	ONDA	HNR-1000	1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope	LECORY - Wave Runner 64Xi-A		Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals