Sintesi di nanoparticelle d'oro liposomi Integrated Photo-reattiva e la misurazione del loro microbolle cavitazione su impulso laser di eccitazione

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo di preparazione semplice per nanoparticelle di oro integrato liposomi foto-reattivo con i materiali disponibili commercialmente. Viene inoltre illustrato come misurare il processo di cavitazione di microbolle dei liposomi sintetizzati sul trattamento di laser pulsato.

Abstract

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Introduzione

La possibilità di innescare il rilascio del farmaco utilizzando stimoli esterni è un modo interessante per consegnare la droga a mode spazio-, temporo e dosaggio controllato con specificità massimizzata e minimi effetti avversi. Tra una vasta gamma di sistemi esogeni stimoli-reattiva (luce, campo magnetico, ultrasuoni, radiazioni a microonde), piattaforme di luce-triggered sono attraenti, a causa della loro non invasività, semplicità e adattabilità negli ambulatori. ¹ Ricerche approfondite negli ultimi dieci anni ha fornito una varietà di tecnologie di piattaforma, come l'oro responsabile nel vicino infrarosso-luce (Au) nanocages rivestiti con polimeri intelligenti, ² foto-labile, nanoparticelle polimeriche (NP) coniugati con ^farmaci, 3 e nanovesicles porphysome auto-assemblati. ⁴ Tuttavia , queste tecnologie sono ancora in fase di sviluppo preclinico, e richiedono una comprensione chiara e ottimizzazione dei parametri legati al processo di avvio e controtolare il rilascio del farmaco.

Uno dei metodi più semplici e facilmente accessibili per la preparazione di un tale sistema è quello di integrare le Au NP con liposomi termicamente sensibili ^5,6, entrambi i quali sono ampiamente disponibili sul mercato e sono stati ampiamente studiati in studi preclinici e clinici, anche. Nonostante la limitazione dell'attivazione del tessuto profondo di Au NP alla loro lunghezza d'onda plasmonica, se confrontato con nanostrutture vicino infrarosso attivato Au (ad esempio, nanocages), questo sistema mantiene ancora una grande promessa se ​​usato nei piccoli animali o per la consegna di attualità negli esseri umani. ⁷ ci sono alcuni primi sforzi in combinando Au NP con liposomi per il rilascio di luce-attivato. ^8-11 Mentre la maggior parte di essi riguardano sulla novità dei materiali, problemi di accessibilità e scalabilità devono essere affrontati. Inoltre, i rapporti sui meccanismi di rilascio che utilizzano questi nanovettori sono ancora limitate.

Qui, la fabbricazione di foto-sensibileliposomi, allo stesso tempo carichi di farmaci e idrofili Au NP è stata descritta. Calceina viene utilizzato come composto modello per valutare l'efficienza di incapsulamento e il profilo di rilascio del sistema. Inoltre, in questo sistema, luce assorbita da Au NP dissipa il microambiente circostante sotto forma di calore, con conseguente aumento della temperatura locale. Microbolle d'aria vengono generati durante il riscaldamento laser e causano distruzione meccanica dei liposomi (Figura 1). Il meccanismo della cavitazione microbolle è confermato da misurazioni idrofoni.

Protocollo

1. Preparazione

1. Clean 100 ml rotonde palloni a fondo con acqua regia (1 parte di acido nitrico concentrato (HNO ₃₎ e 3 parti di acido cloridrico concentrato (HCl)) e lavare i flaconi con acqua deionizzata. Autoclavare beute e asciugare in un forno ad aria calda a 100 ° C per 15 min. Avvolgere e conservare i flaconi sterili fino al momento dell'uso.
2. Sterilizzare il set di mini-estrusore portatile utilizzando il 70% di etanolo.
3. Accendere l'evaporatore rotante e impostare la temperatura del bagno di acqua calda e la torre di raffreddamento a 37 ° C e 4 ° C rispettivamente.
4. Preparare 60 mM calceina soluzione madre sciogliendo 374 mg di calceina in 10 ml di 0,1 mM tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Regolare il pH a 7,4 con 1 M di idrossido di sodio (NaOH).

2. Sintesi di liposomi

1. Rimuovere i lipidi (1,2-Dipalmitoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoil-2-idrossi-SN -glycero-3-phosphochoLinea (MPPC) e 1, 2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanol-quali ammine N - [carbossi (polietilene glicole) -2000] (sale di ammonio) (DSPE-PEG2000)) dal congelatore (-20 ° C) e li scongelare a temperatura ambiente.
2. Pesare 15,9 mg DPPC, 1,3 mg MPPC, e 2,8 mg di DSPE-PEG2000. li Sciogliere insieme in 2 ml di cloroformio.
3. Trasferire la soluzione cloroformica al pallone a fondo rotondo sterile ed evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a pressione ridotta, per formare un sottile strato lipidico secca,.
4. Idratare lo strato lipidico a 45 ° C con 2 ml di soluzione acquosa per 30 minuti contenente 1,95 ml 60 mM calceina preparato al punto 1.4 e 50 microlitri Au NPs (3,36 × 10 ¹⁶ particelle / ml).
5. Preriscaldare il blocco di riscaldamento a 45 ° C. Mettere un filtro a membrana di policarbonato 200 nm tra i supporti del filtro e montare il set di mini-estrusore. Controllare la potenziale fuoriuscita con acqua deionizzata.
6. Riempire una delle siringhe con 1 ml di soluzione di liposomi dal punto 2.4 e Extrude l'esempio facendo passare la soluzione alla siringa all'altra estremità del assemblare mini-estrusore. Ripetere 11 volte.
7. Eseguire i liposomi sintetizzati attraverso una colonna di dissalazione PD-10 per rimuovere le libere Au NP, lipidi e calceina con PBS come eluente secondo il protocollo del produttore.
8. Conservare i campioni in provette sterili a 4 ° C e utilizzare in 2 giorni.

3. Calceina uscita da liposomi con riscaldamento

1. Calcolare la molarità lipidico della soluzione di riserva sommando le molarità di DPPC, MPPC, e DSPE-PEG2000 al punto 2.2. Diluire la soluzione di liposomi magazzino di 5 concentrazione di lipidi mm con 0,1 mM tampone PBS (pH 7,4). Trasferire i campioni in una provetta da centrifuga (2 ml).
2. Collocare la provetta in un bagno di acqua calda, e aumentare gradualmente la temperatura da 25 a 70 ° C. Aumentare la temperatura ad una velocità di 1 ° C / min qui.
3. Raccogliere aliquote (10 microlitri) in diversi punti di temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 e 70 ° C).
4. Aggiungere 10 ml di 2% Triton X-100 a 2 ml aliquota della soluzione liposomiale per digerire i liposomi per 10 minuti a RT e realizzare la completa liberazione di calceina.
5. Trasferire 200 microlitri della soluzione liposomiale per ciascun pozzetto della micropiastra a 96 pozzetti e misurare l'intensità di fluorescenza dei campioni raccolti utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre. I eccitazione e di emissione di calceina sono rispettivamente 480 e 515 nm.
6. Prendendo l'intensità di fluorescenza dei campioni Triton X-100 trattate come rilascio 100%, calcolare la percentuale di calceina rilasciato ad ogni punto temporale, utilizzando la formula:
   
   Ft è l'intensità di fluorescenza della soluzione in un determinato punto nel tempo. F _{i e} F _{X Le} normalizzati intensità di fluorescenza iniziale e finale della soluzione, rispettivamente.

4. Calceina Relocazione da liposomi con laser pulsato

1. Trasferire soluzione liposomi 100 ml di una cuvetta di quarzo e collocarlo in un supporto cuvetta. Utilizzare un Nd: YAG con durata dell'impulso di 6 nsec a 532 nm di lunghezza d'onda come fonte di luce. Utilizzare i seguenti parametri Laser - Frequenza di ripetizione: 1 Hz; Densità di energia del laser: 1 mJ / cm ^2; Diametro del fascio: 0,5 mm.
2. Guida il fascio laser collimato attraverso la cuvetta in modo che la luce passa attraverso la soluzione di liposomi e raccogliere aliquote dopo vari impulsi.
3. Aggiungere 10 ml di 2% Triton X-100 a 2 ml aliquota della soluzione liposomiale per digerire i liposomi per 10 minuti a RT e realizzare la completa liberazione di calceina.
4. Considerando calceina è sensibile alla luce e potrebbe essere sbiancato durante l'esperimento laser, pre-misurare l'effetto sbiancante del laser impulsato in soluzione calceina per normalizzare i dati dal rilascio liposoma.
   1. In particolare, esporre soluzione calceina (60 mm) a impulsi laser with frequenza di 1 Hz per variare i numeri di impulsi (0, 25, 50 e 100). Misurare l'intensità di fluorescenza della calceina con eccitazione e di emissione di 480 nm e 515, rispettivamente, prima e dopo l'esposizione laser.
   2. Calcolare la quantità di sbiancamento (intensità di fluorescenza di calceina prima di intensità di esposizione del laser / fluorescenza della calceina dopo il numero di impulsi specifico). Utilizzare questo fattore di normalizzazione dei valori ottenuti da campioni di liposomi moltiplicando l'intensità di fluorescenza dei liposomi con il fattore.
5. Misurare l'intensità di fluorescenza del campione raccolto utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre alla lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione a 480 e 515 nm, rispettivamente.
6. Prendendo l'intensità di fluorescenza dei campioni Triton X-100 trattate come rilascio 100%, calcolare la percentuale di calceina rilasciato ad ogni numero di impulsi, utilizzando la formula:
   
   Ft è l'intensità di fluorescenza della soluzione ad un dato numero di impulsi dopo la normalizzazione. F _{i e} F _{X Le} normalizzati intensità di fluorescenza iniziale e finale della soluzione, rispettivamente.

5. Determinazione degli impulsi di pressione

1. Mettere 100 ml di campione su un vetrino microscopico e impostare la messa a fuoco del laser sul campione.
2. Immergere un idrofono ago (1 mm di diametro e 450 sensibilità nV / Pa) nella soluzione.
   Attenzione: L'idrofono non deve essere illuminata dalla luce laser per evitare il danno.
3. Irradiare il campione con il laser pulsato con numero variabile di impulsi (0-100) e l'energia di impulso (20-160 μJ / impulso).
4. Registrare i segnali di pressione utilizzando un oscilloscopio digitale.

Risultati

I liposomi sono stati preparati utilizzando una tecnica film sottile idratazione convenzionale con DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000 in un rapporto molare di 86: 10: 4 o 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml ¹² Le dimensioni Au NP è critica per determinare la luce per riscaldare l'efficienza di conversione durante il seguente esperimento eccitazione laser. Minore è la dimensione di Au NP, maggiore è l'efficienza di trasduzione. ¹³ Così 5 nm Au NP, i più piccoli campioni da...

Discussione

idratazione film sottile è il metodo convenzionale per la preparazione di liposomi. Solventi organici (cloroformio in questo caso) sono stati usati per primo dissolvere i lipidi e poi rimosso in un evaporatore rotante a 37 ° C per generare un sottile film lipidico sul pallone. Questo film lipidico venne idratato con la soluzione acquosa contenente 60 mM calceina e 5 nm Au NP. Durante il processo di idratazione, la temperatura è stata mantenuta a circa 50 ° C e il pallone viene agitato costantemente ruotando il pallo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	850355P	Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	855675P	Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	880120P	Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles	Sigma Aldrich	752568-100mL	5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein	Sigma Aldrich	C0875-10g	60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water	Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100	Sigma, Life Sciences	X-100	To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor	Buchi (Switzerland)	R 210	Used for Lipososme preparation
Heating bath	Buchi (Switzerland)	B 491	Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller	Buchi (Switzerland)	V-850	Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump	Buchi (Switzerland)	V-700	Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller	Polyscience		Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610000	Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610017	Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm	Whatmann	800281	Used for extrusion of liposomes
Filter Support	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610014	Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium	GE Healthcare, Life sciences	17-0851-01	Used to purify the liposomes
Centrifuge	Sigma Laboratory Centrifuges	3K30	Used to concentrate the liposomal solution
Rotor	Sigma	19777-H	Used to concentrate the liposomal solution
Zetasizer	Nano ZS Malvern		Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-2450	Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer	Molecular Devices	SpectraMax M5	Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser	NewWave Research		532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone	ONDA	HNR-1000	1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope	LECORY - Wave Runner 64Xi-A		Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals