Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Resumo

Este protocolo descreve um método de preparação simples para nanopartículas de ouro integrado lipossomas foto-sensível com os materiais disponíveis no mercado. Também mostra como medir o processo de cavitação microbolhas dos lipossomas sintetizados mediante o tratamento de laser pulsado.

Resumo

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Introdução

A possibilidade de desencadear a liberação de drogas usando estímulos externos é uma forma atraente para entregar a droga em modas espaço-, temporal- e controlado-dosagem com especificidade maximizada e os efeitos adversos mínimos. Entre uma vasta gama de sistemas exógenos estímulos responsivos (luz, campo magnético, ultra-som, radiação de microondas), plataformas de luz disparado são atraentes, devido à sua não-invasivo, simplicidade e adaptabilidade nas clínicas. ¹ Extensas pesquisas na última década tem proporcionado uma variedade de tecnologias de plataforma, como o ouro responsável near-infrared-luz (AU) nanocages revestido com polímeros inteligentes, ^2, nanopartículas poliméricas foto-lábil (PN) conjugados com ^drogas, 3 e nanovesículas porphysome auto-organizadas. ⁴ Entretanto , estas tecnologias estão ainda nas fases pré-clínicas de desenvolvimento, e requerem uma compreensão clara e optimização dos parâmetros relativos ao processo de iniciação e controlando a libertação do fármaco.

Um dos métodos mais simples e facilmente acessíveis para a preparação de um tal sistema é integrar Au NPs com lipossomas termicamente sensíveis ^5,6, ambas as quais estão amplamente disponíveis no mercado e têm sido amplamente investigados em ensaios pré-clínicos e clínicos mesmo. Apesar da limitação da activação de tecidos profundos de Au NPs no seu comprimento de onda plasmónico, quando comparado com nanoestruturas Au-do infravermelho próximo activado (por exemplo, nanocages), este sistema ainda é muito promissora quando usada em pequenos animais ou para entrega tópica em seres humanos. ⁷ Há alguns esforços iniciais em combinar Au NPs com lipossomas para a liberação de luz disparado. ^8-11 Enquanto a maioria deles concentrar-se na novidade de materiais, questões de acessibilidade e escalabilidade precisam ser abordadas. Além disso, os relatórios sobre mecanismos de liberação usando estes nanocarriers ainda são limitados.

Aqui, a fabricação de foto-sensívellipossomas, simultaneamente carregadas com drogas hidrófilas e Au NPs foi descrito. A calceina é utilizado como um composto modelo para avaliar a eficiência da encapsulação e o perfil de libertação do sistema. Além disso, neste sistema, a luz absorvida por Au NPs dissipa para o microambiente envolvente sob a forma de calor, o que resulta em um aumento na temperatura local. Microbolhas de ar são gerados durante o aquecimento a laser e causar ruptura mecânica de lipossomas (Figura 1). O mecanismo da cavitação microbolhas é confirmado por medições de hidrofones.

Protocolo

1. Preparação

1. Limpos redondo de 100 ml, utilizando balões de fundo água régia (1 parte de ácido nítrico concentrado _(HNO3) e 3 partes de ácido clorídrico concentrado (HCl)) e lava-se os frascos com água DI. Autoclave os frascos e secá-los num forno de ar quente a 100 ° C durante 15 min. Enrole e armazenar os frascos estéreis até à sua utilização.
2. Esterilizar o conjunto de mini-extrusora de mão usando 70% de etanol.
3. Ligue o evaporador rotativo e ajustar a temperatura do banho de água quente e a torre de arrefecimento a 37 ° C e 4 ° C, respectivamente.
4. Preparar 60 mM de solução mãe de calceína através da dissolução de 374 mg de calceína em 10 ml de 0,1 mM de tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Ajustar o pH para 7,4 utilizando hidróxido de sódio M solução de 1 (NaOH).

2. Síntese de Lipossomas

1. Remover os lípidos (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-palmitoil-2-hidroxi- sn-glicero-3-phosphochoA linha (CPMP) e 1, 2-sn-glicero-distearoyl--3-phosphoethanol aminas N - [carboxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amónio) (DSPE-PEG2000)) a partir do congelador (-20 ° C) e descongelar-los até à TA.
2. Pesar 15,9 mg de DPPC, 1,3 mg MPPC, e 2,8 mg DSPE-PEG2000. Dissolve-los em conjunto em 2 mL de clorofórmio.
3. Transferir a solução de clorofórmio para o balão de fundo redondo esterilizadas e evapora-se o solvente, utilizando o evaporador rotativo, sob pressão reduzida, de modo a formar uma camada fina de lípidos, seca.
4. Hidratar a camada de lípidos a 45 ° C com solução aquosa de 2 ml durante 30 minutos 1,95 ml contendo 60 mM de calceína preparado no passo 1.4 e 50 ul Au NPs (3,36 x 10 ¹⁶ partículas / ml).
5. Pré-aquecer o bloco de aquecimento a 45 ° C. Colocar um filtro de membrana de policarbonato de 200 nm entre os suportes de filtro e montar o conjunto de mini-extrusora. Verifique a potenciais fugas com água DI.
6. Encha uma das seringas com 1 ml de solução de lipossomas a partir do passo 2.4 e EXTRUde a amostra fazendo passar a solução para a seringa na outra extremidade da montagem de mini-extrusor. Repetir 11 vezes.
7. Executar os lipossomas sintetizados através de uma coluna de dessalinização PD-10 para remover os livres Au NPs, lípidos e calceína utilizando PBS como eluente, de acordo com o protocolo do fabricante.
8. Armazenar as amostras em tubos estéreis a 4 ° C e usar em 2 dias.

3. Calce�a lançamento de lipossomas com Aquecimento

1. Calcular a molaridade lipídica da solução somando os molaridades de DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000 na etapa 2.2. Dilui-se a solução de estoque de concentração de lípido de lipossoma 5 mM utilizando 0,1 mM de tampão PBS (pH 7,4). Transferir as amostras para um tubo de centrifugação (2 ml).
2. Colocar o tubo num banho de água quente, e aumentar a temperatura, gradualmente, de 25 a 70 ° C. Aumentar a temperatura a uma taxa de 1 ° C / min aqui.
3. Recolha alíquotas (10 ml) em diferentes pontos de temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 e 70 ° C).
4. Adicionar 10 ul de 2% de Triton X-100 a 2 ml da solução lipossomal aliquota para digerir os lipossomas durante 10 min à RT e para conseguir a libertação completa de calceína.
5. Transferir 200 ul da solução lipossomal a cada poço em microplacas de 96 poços e medir a intensidade de fluorescência das amostras recolhidas utilizando um leitor de microplacas de fluorescência. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de calceína são 480 e 515 nm, respectivamente.
6. Tomando a intensidade de fluorescência das amostras de Triton X-100 tratadas como 100% de libertação, calcular a percentagem de calceína libertada em cada ponto do tempo, utilizando a fórmula:
   
   Ft é a intensidade de fluorescência da solução a um dado ponto de tempo. F F _{I e X} são as intensidades de fluorescência normalizados iniciais e finais da solução respectivamente.

4. Calce�a Relocação de lipossomas com laser pulsado

1. Transferir a solução de lipossoma 100 ul para uma cuvete de quartzo e introduzi-los num suporte de cuvete. Usar um laser de Nd pulsadas: YAG com uma duração de pulso de 6 ns a 532 nm de comprimento de onda como a fonte de luz. Utilize os seguintes parâmetros laser - Taxa de repetição: 1 Hz; Densidade de energia do laser: 1 mJ / cm ^2; Diâmetro do feixe: 0,5 mm.
2. Orientar o feixe laser colimado através da cuvete de tal modo que a luz passa através da solução de lipossomas e recolher alíquotas após vários impulsos.
3. Adicionar 10 ul de 2% de Triton X-100 a 2 ml da solução lipossomal aliquota para digerir os lipossomas durante 10 min à RT e para conseguir a libertação completa de calceína.
4. Considerando calceína é sensível à luz e pode ser branqueada durante o experimento de laser, pré-medir o efeito de branqueamento de laser pulsado em solução calceína para normalizar os dados de libertação de lipossomas.
   1. Especificamente, expor solução de calceína (60 mM) para wi laser pulsadoth frequência de 1 Hz por um número variável de pulso (0, 25, 50 e 100). Medir a intensidade de fluorescência da calceina com excitação e emissão de comprimentos de onda de 480 e 515 nm, respectivamente, antes e depois da exposição à radiação laser.
   2. Calcular a quantidade de branqueamento (intensidade de fluorescência da calceina antes intensidade do laser exposição / fluorescência da calceina depois o número de impulsos específica). Use este factor para normalizar os valores obtidos a partir de amostras de lipossomas, multiplicando a intensidade de fluorescência dos lipossomas com o factor.
5. Medir a intensidade de fluorescência da amostra recolhida utilizando um leitor de microplacas de fluorescência a comprimentos de onda de excitação e emissão de 480 e 515 nm, respectivamente.
6. Tomando a intensidade de fluorescência das amostras de Triton X-100 tratadas como 100% de libertação, calcular a percentagem de calceína libertada a cada número de pulsos, usando a fórmula:
   
   Ft é a intensidade de fluorescência da solução a um determinado número de impulsos após a normalização. F F _{I e X} são as intensidades de fluorescência normalizados iniciais e finais da solução respectivamente.

5. Medição dos impulsos de pressão

1. Colocar 100 ml da amostra numa lâmina de microscópio e definir o foco do laser sobre a amostra.
2. Imergir um hidrofone agulha (1 mm de diâmetro e 450 a sensibilidade NV / Pa) para dentro da solução.
   Cuidado: A hidrofone não deve ser iluminada pela luz do laser para evitar o dano.
3. Irradiar a amostra com o laser pulsado com números variados de pulso (0-100) e energia de pulso (20-160 μJ / pulso).
4. Registam-se os sinais de pressão utilizando um osciloscópio digital.

Resultados

Os lipossomas foram preparados usando uma técnica de hidratação de película fina convencionais com DPPC, CPMP e DSPE-PEG2000 numa razão molar de 86: 10: 4 ou 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml ¹² O tamanho de Au NPs é crítico para determinar a luz para aquecer a eficiência de conversão durante a experiência seguinte de excitação de laser. Quanto menor o tamanho de Au PN, maior é a eficiência de transdução. Assim ¹³ 5 nm Au NPs, as amostras mais pequenas do fo...

Discussão

hidratação do filme fino é o método convencional para a preparação de lipossomas. Os solventes orgânicos (clorofórmio neste caso) foram primeiro utilizados para dissolver os lipidos e, em seguida, removido num evaporador rotativo a 37 ° C, para gerar uma película fina de lípidos no frasco. Este filme de lípido foi hidratada com a solução aquosa contendo 60 mM de calceína e 5 nm Au NPs. Durante o processo de hidratação, a temperatura foi mantida a cerca de 50 ° C e o frasco foi constantemente agitada po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	850355P	Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	855675P	Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	880120P	Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles	Sigma Aldrich	752568-100mL	5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein	Sigma Aldrich	C0875-10g	60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water	Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100	Sigma, Life Sciences	X-100	To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor	Buchi (Switzerland)	R 210	Used for Lipososme preparation
Heating bath	Buchi (Switzerland)	B 491	Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller	Buchi (Switzerland)	V-850	Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump	Buchi (Switzerland)	V-700	Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller	Polyscience		Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610000	Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610017	Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm	Whatmann	800281	Used for extrusion of liposomes
Filter Support	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610014	Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium	GE Healthcare, Life sciences	17-0851-01	Used to purify the liposomes
Centrifuge	Sigma Laboratory Centrifuges	3K30	Used to concentrate the liposomal solution
Rotor	Sigma	19777-H	Used to concentrate the liposomal solution
Zetasizer	Nano ZS Malvern		Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-2450	Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer	Molecular Devices	SpectraMax M5	Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser	NewWave Research		532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone	ONDA	HNR-1000	1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope	LECORY - Wave Runner 64Xi-A		Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals