パルスレーザー励起時の金ナノ粒子の統合フォト応答性リポソームとそのマイクロバブルキャビテーションの測定の合成

要約

このプロトコルは、市販の材料で光応答性リポソームを統合し、金ナノ粒子のための簡単​​な製造方法を説明します。また、パルスレーザーの治療の際に合成されたリポソームのマイクロバブルキャビテーションプロセスを測定する方法を示しています。

要約

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

概要

外部刺激を用いた薬物放出をトリガーする可能性が最大化された特異性と最小限の副作用で、spatial- temporal-および用量制御ファッションで薬物を送達するための魅力的な方法です。外因性の刺激応答システム（光、磁場、超音波、マイクロ波放射）の広い範囲の中で、光トリガ型プラットフォームは、診療所での非侵襲性、シンプルさと適応性に起因して、魅力的である。過去10年間に¹広範な研究薬^、3および自己組織porphysomeのnanovesiclesと結合したスマートポリマー^、2光不安定性、ポリマーナノ粒子（NPS）で被覆された近赤外光を担当する金（Au）などのプラットフォーム技術、ナノケージのさまざまなを提供してきました^。4しかし、 、これらの技術は、開発の前臨床段階にまだある、と開始および続きのプロセスに関与するパラメータの明確な理解と最適化が必要薬物放出をローリング。

このようなシステムを製造するための最も簡単かつ容易にアクセスできる方法の一つは、市場で広く入手可能であり、広範囲に前臨床、さらには臨床試験で研究されてきたどちらも熱感受性リポソーム^5,6と金のNPを統合することです。近赤外活性化のAuナノ構造体（ 例えば、ナノケージ）と比較すると小さな動物またはヒトにおける局所送達のために使用される場合、それらのプラズモン波長でのAu NPの深部組織の活性化の限界にもかかわらず、このシステムは、依然として非常に有望です。 ⁷光点弧のリリースのためにリポソームとのAuのNPを組み合わせることでいくつかの初期の努力があります^{。8月11日に} 、それらのほとんどは材料の新規性に焦点を当てながら、アクセシビリティとスケーラビリティの問題に対処する必要があります。また、これらのナノキャリアを使用して、放出機構に関する報告はまだ限られています。

ここで、光応答性の製作同時に薬物や親水性のAuのNPが装填されたリポソームは、記載されています。カルセインは、カプセル化効率及びシステムの放出プロフィールを評価するために、モデル化合物として使用されます。また、このシステムでは、金のNPによって吸収された光は、局所的な温度の上昇をもたらす、熱の形で周囲の微小環境に消散します。空気の微小気泡は、レーザー加熱時に生成されたリポソーム（ 図1）の機械的破壊を引き起こしています。マイクロバブルキャビテーションのメカニズムは、ハイドロホンの測定によって確認されます。

プロトコル

1.準備

1. 王水（濃硝酸（HNO _3）を1部、濃縮塩酸（HCl）の3部）を使用してクリーンな100mlの丸底フラスコに、DI水でフラスコを洗浄します。フラスコをオートクレーブし、15分間100℃の熱風オーブン中でそれらを乾燥させます。ラップし、使用するまで無菌フラスコを格納します。
2. 70％エタノールを用いてハンドヘルドミニ押出機のセットを滅菌します。
3. 回転蒸発器をオンにして、それぞれ37℃と4℃の湯浴と冷却塔の温度を設定します。
4. 10 mlの0.1 mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）中のカルセインの374ミリグラムを溶解することによって原液をカルセイン60mMのを準備します。 1 M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を用いてpHを7.4に調整します。

リポソームの2.合成

1. 脂質を除去（1,2- Dipalmitoyl- のsn -glycero-3ホスホコリン（DPPC）、1-パルミトイル-2-ヒドロキシSN -glycero-3-phosphochoライン（MPPC）及び1、2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanol -アミンN - [カルボキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩）（DSPE-PEG2000））冷凍庫から（-20°C）そしてRTにそれらを解凍。
2. 15.9 mgのDPPC、1.3 mgのMPPC、および2.8 mgのDSPE-PEG2000を秤量します。 2ミリリットルのクロロホルムにそれらを一緒に溶かします。
3. 滅菌した丸底フラスコにクロロホルム溶液を移し、薄い、乾燥した脂質層を形成するために、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させます。
4. 2ミリリットルでステップ1.4および50μlの金のNP（3.36×10 ¹⁶粒子/ ml）で調製した1.95ミリリットルの60mMカルセインを含む30分間の水溶液を45℃での脂質層を水和。
5. 45°Cに加熱ブロックを予熱。フィルタ支持体間200nmのポリカーボネートメンブレンフィルターを置き、ミニ押出機のセットを組み立てます。 DI水との潜在的な漏れをチェックします。
6. ステップ2.4​​とextruからリポソーム溶液1ミリリットルと注射器のいずれかを記入組み立てミニ押出機のもう一方の端にシリンジに溶液を通過させることにより、サンプルド。 11回繰り返します。
7. 製造業者のプロトコルに従って溶離液としてPBSを使用して自由にAuのNP、脂質およびカルセインを除去するために、PD-10脱塩カラムを経て合成リポソームを実行します。
8. 4℃で滅菌チューブ内のサンプルを保管し、2日後に使用します。

ヒーターを有するリポソームから3カルセインリリース

1. ステップ2.2でDPPC、MPPC、およびDSPE-PEG2000のモル濃度を追加することにより、原液の脂質モル濃度を計算します。 0.1 mMのPBS緩衝液（pH7.4）を使用して、5 mMの脂質濃度にリポソーム原液を希釈します。遠心管（2ミリリットル）にサンプルを転送します。
2. 湯浴中でチューブを置き、25から70℃まで徐々に温度を上昇させます。ここでは1℃/分の速度で温度を上げます。
3. 異なる温度点（27、32、37、39、41でアリコート（10μl）を収集し、43、45、52、57、62、67及び70℃）。
4. RTで10分間リポソームを消化し、カルセインの完全な放出を達成するためにリポソーム溶液の2％トリトンX-100〜2ミリリットルのアリコート10μlのを追加します。
5. 96ウェルマイクロプレートの各ウェルにリポソーム溶液200μlを移し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて収集されたサンプルの蛍光強度を測定します。カルセインの励起および発光波長は、それぞれ480および515 nmです。
6. 100％放出としてトリトンX-100処理されたサンプルの蛍光強度を取って、数式を使用して、各時点で放出されたカルセインの割合を計算します。
   
   FTは、所与の時点での溶液の蛍光強度です。 F _iとF _xは、それぞれ溶液の正規化された最初と最後の蛍光強度です。

4.カルセイン再パルスレーザーを用いたリポソームからリース

1. 石英キュベットに100μlのリポソーム溶液を移し、キュベットホルダーに入れてください。光源として波長532nmでの6ナノ秒のパルス持続時間を持つ：YAGレーザーパルスのNdを使用してください。次のレーザーパラメータを使用してください - 繰り返しレート：1 Hzの。レーザーエネルギー密度：1ミリジュール/ ^cm 2で、ビーム径0.5 mmです。
2. 光はリポソーム溶液を通過するように、キュベットを介して平行レーザビームを案内し、様々なパルスの後に一定分量を収集します。
3. RTで10分間リポソームを消化し、カルセインの完全な放出を達成するためにリポソーム溶液の2％トリトンX-100〜2ミリリットルのアリコート10μlのを追加します。
4. カルセインを考慮すると、光に敏感であり、レーザー実験中に漂白することができ、リポソームのリリースからデータを正規化するために、カルセイン液にパルスレーザーの漂白効果を事前に測定します。
   1. 具体的には、カルセイン溶液（60 mM）のパルスレーザのwiへを公開パルス数（0、25、50および100）を変化させるための1ヘルツの番目の周波数。前とレーザー露光した後、それぞれ480および515 nmでの励起および発光波長のカルセインの蛍光強度を測定します。
   2. 漂白の量（レーザー露光/特定のパルス数の後にカルセインの蛍光強度の前にカルセインの蛍光強度）を計算します。因子を有するリポソームの蛍光強度を乗算することにより、リポソーム試料から得られた値を正規化するためにこの係数を使用。
5. それぞれ480および515 nmでの励起および発光波長で蛍光マイクロプレートリーダーを使用して採取された試料の蛍光強度を測定します。
6. 100％放出としてトリトンX-100で処理した試料の蛍光強度を取って、それぞれのパルス数で放出カルセインの割合を計算し、式を用いて。
   
   Ftが正規化後の所定のパルス数での溶液の蛍光強度です。 F _iとF _xは、それぞれ溶液の正規化された最初と最後の蛍光強度です。

圧力インパルスの5測定

1. 顕微鏡スライド上に100μlの試料を置き、サンプルにレーザの焦点を設定します。
2. 溶液中に針ハイドロホン（直径1mmおよび450はnV / Paの感度）を浸し。
   注意：ハイドロホンは、損傷を避けるために、レーザー光を照射することはできません。
3. 様々なパルス数（0-100）とパルスエネルギー（20から160μJ/パルス）でパルスレーザーを試料に照射します。
4. デジタルオシロスコープを使用して圧力信号を記録します。

結果

10：4または7.95：リポソームは86のモル比でDPPC、MPPCおよびDSPE-PEG2000を有する従来の薄膜水和法を用いて調製した0.65：1.39 mg / mlで¹²のAu NPのサイズは、光を決定することが重要です以下のレーザー励起実験中の変換効率を加熱します。金NPのサイズ、より高いが、変換効率である^。13したがって5nmの金のNP小さく、ベンダーからの最小のサンプルは、カプ?...

ディスカッション

薄膜水和は、リポソームを調製するための従来の方法です。有機溶媒（この場合はクロロホルム）まず、脂質を溶解するために使用し、次いでフラスコに脂質薄膜を生成するために、37℃でロータリーエバポレーターで除去しました。この脂質膜は、60mMのカルセインと5nmの金のNPを含有する水溶液で水和しました。水和プロセスの間、温度を約50℃に維持し、フラスコを常にフラスコを回転さ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	850355P	Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	855675P	Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	880120P	Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles	Sigma Aldrich	752568-100mL	5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein	Sigma Aldrich	C0875-10g	60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water	Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100	Sigma, Life Sciences	X-100	To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor	Buchi (Switzerland)	R 210	Used for Lipososme preparation
Heating bath	Buchi (Switzerland)	B 491	Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller	Buchi (Switzerland)	V-850	Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump	Buchi (Switzerland)	V-700	Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller	Polyscience		Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610000	Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610017	Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm	Whatmann	800281	Used for extrusion of liposomes
Filter Support	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610014	Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium	GE Healthcare, Life sciences	17-0851-01	Used to purify the liposomes
Centrifuge	Sigma Laboratory Centrifuges	3K30	Used to concentrate the liposomal solution
Rotor	Sigma	19777-H	Used to concentrate the liposomal solution
Zetasizer	Nano ZS Malvern		Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-2450	Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer	Molecular Devices	SpectraMax M5	Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser	NewWave Research		532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone	ONDA	HNR-1000	1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope	LECORY - Wave Runner 64Xi-A		Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals