פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים

Summary

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Abstract

על מנת ללמוד את המסלולים המולקולריים של מחלת פרקינסון (PD) ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, חוקרים מדעיים להסתמך על מודלים של בעלי חיים. זיהוי של גנים הקשורים PD הוביל פיתוח מודלים PD גנטי. רוב הדגמים עכבר מהונדס α-SYN לפתח פתולוגיה הדרגתית α-SYN אך אינם מצליחים להציג הפסד התא דופאמין ברור וגירעונות התנהגותי תלויים דופמין. המשוכה הזאת נתקפה טיווח ישיר של nigra substantia עם וקטורים ויראליים overexpressing גנים הקשורים PD. למסירת גן מקומית באמצעות וקטורים ויראליים מספקת דרך אטרקטיבית להביע transgenes במערכת העצבים המרכזית. איזורים מסוימים במוח יכולים להיות ממוקדים (למשל nigra substantia), ביטוי יכול להיגרם בסביבה המבוגרת ורמות ביטוי גבוהות יכולות להיות מושגת. יתר על כן, מערכות וקטור שונות המבוססות על וירוסים שונים ניתן להשתמש. הפרוטוקול מתאר את כל שלבים המכריעים לבצע וקטור ויראליזריקת nigra substantia של החולדה לפתח מודל חית אלפא-synuclein מבוסס וקטור ויראלי לטיפול במחלת הפרקינסון.

Introduction

כדי לחקור את פתופיזיולוגיה של PD ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, יש צורך דחוף במודלים של בעלי החיים כי דומה בנוירופתולוגיה, סימפטומי פיזיולוגית מנוע של PD אדם. את הערך המנבא הגבוה יותר, כך ניטיב יכול לתרגם טיפולים חדשים מ במודלים של בעלי חיים לחולים.

הגילוי-synuclein אלפא (α-SYN) כמו גן PARK לראשונה ב -1997 הוביל לפיתוח של מודלי PD הגנטיים הראשונים. עכברים מהונדסים רבים overexpressing wild-type אדם (WT) או מוטציה (A30P, A53T) α-SYN נוצרו בעשור האחרון. רמות ביטוי יתר α-SYN הוכיחו להיות מכריע בהתפתחות של הפתולוגיה. גם זן העכבר, קיומו או אי קיומו של אנדוגני α-SYN והאם באורך מלא או בגרסה מקוצרת מתבטא, ממלא תפקיד (סקירה מפורטת על ידי מגן Chesselet ^1). התבטאות יתר של שניהם WT וכמה מוטציות קליניות של אדם &# 945; -SYN בעכברים טרנסגניים גורם הצטברות פתולוגית של α-SYN וחוסר תפקוד עצבי ^2-6. עם זאת, עד במודלים של עכברים α-SYN עכשיו המהונדסים ביותר לא הצליחו להציג פסד תא דופאמין ברור וגירעונות התנהגותי תלוי דופמין.

המשוכה הזאת נתקפה טיווח ישיר של nigra substantia (SN) עם וקטורים ויראליים overexpressing α-SYN. וקטורים ויראליים נגזרים וירוסים שיכולים להדביק תאים בקלות, מציגים את החומר גנטי לתוך הגנום המארח שלהם ולהכריח את התא המארח לשכפל את הגנום הנגיפי על מנת לייצר חלקיקי נגיף חדשים. וירוסים יכולים להיות מהונדסים שאינם משכפלים וקטורים ויראליים כי לשמור על יכולתם לחדור לתאים ולהציג גנים. על ידי מחיקת חלקים של הגנום הויראלי והחליף על ידי הגנים של עניין, יישום של הווקטור יגרום זיהום סיבוב בודד ללא שכפול בתוך התא המארח, המיועד בדרך כלל כמו 'תמרה'. ג וקטורים ויראלייםלשמש ביטוי יתר שניהם להשתקת גנים. את הגן הביע יכול להיות חלבון כתב (חלבון פלואורסצנטי ירוק למשל או בלוציפראז גחלילית) ^7, חלבון טיפולי עבור יישומי ריפוי גנטי ^8-10 או, כפי נתמקד במאמר זה, חלבון הקשור למחלות המשמש מודלי מחלה ^{11 -14.}

למסירה גן וקטור בתיווך ויראלי מספק דרך חלופית להביע transgenes של מערכת העצבים המרכזית עם מספר יתרונות. באמצעות משלוח transgene מקומי, איזורים מסוימים במוח יכולים להיות ממוקדים. יתר על כן, ביטוי transgene יכול להיגרם במהלך הבגרות בהפחתת הסיכון מנגנוני פיצוי במהלך הפיתוח. כמו כן, ניתן ליצור מודלי מיני זנים שונים. ולבסוף, transgenes השונה ניתן לשלב בקלות. באמצעות וקטורים ויראליים, רמות ביטוי transgene גבוהה יכולה להיות מושגת, אשר עשוי להיות חיוני מאז תחילת וחומרת המחלה תלויה לעתים קרובות על רמת overexpression.

מערכות וקטור כמה מבוססות על וירוסים שונים פותחו. הבחירה של מערכת הווקטור תלוי בגודל של הגן של עניין, את משך הזמן הנדרש של ביטוי גנים, תא המטרה ובעיות בטיחות ביולוגית. עבור העברת גנים יציבה במוח, lentiviral (LV) ו ויראלי adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) וקטורים נחשבים כיום מערכות וקטור בחירה שכן הם להוביל ביטוי גנים יעיל לטווח ארוך במוח המכרסם. עבור מיקוד ספציפי של נוירונים דופאמינרגיים (DN) של SN, וקטורי rAAV יש outcompeted וקטורי LV בהדרגה בגלל טיטר ויעילות התמרה הגבוהה שלהם של DN.

המודלים המכרסמים הכי הטובים מבוסס α-SYN הזמינים כרגע פותחו מתוך גישה משולבת באמצעות קפסיד AAV החדש (1 rAAV, 5, 6, 7, 8) ו אופטימיזציה בונה וקטור, טיטר, וטוהר ^15,16. כייל וקטור וכן טוהר וקטור משפיע ישירותהתוצאה פנוטיפי של המודל. titers וקטור מוגזמת או קבוצות וקטור מטוהרים מספיק עלול לגרום לרעילות הלא ספציפית. לכן, וקטורי בקרה נאותים הכרחיים. השקעת זמן ניכרת בייצור, upscaling וקטור ויראלי, ואת הליכי הטיהור גם הוכיחה חיונית להשיג יצוות וקטור איכות לשחזור גבוה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם להוראת מועצת הקהילות האירופיות מיום 24 בנובמבר 1986 (86/609 / EEC) ואושרו על ידי הוועדה ביו-האתית של אונ' הלובן (בלגיה).

1. רקומביננטי AAV הפקה וטיהור

הערה: הייצור וטיהור וקטור rAAV בוצע על ידי Core וקטור ויראלי לובן (LVVC) כפי שתואר לעיל ^17.

1. בקצרה, transfect subconfluent נמוך (<50) מעבר חסיד תאים HEK 293T באמצעות polyethylenimine ליניארי 25kD 150 פתרון transfection ננומטר NaCl ושלושה פלסמידים שונים על יחס של 1: 1: 1 ב DMEM בינוני 2% בסרום שור העובר. לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס 5% CO _2, להחליף את המדיום עם סרום שור עובר 2% DMEM בינוני טרי.
   הערה: פלסמידים כוללים בונה עבור סרוטיפ AAV7, הפלסמיד העברת AAV קידוד מוטצית A53T האדם α-SYN בשליטה של ​​CMVie משופר synapsהאמרגן in1 ואת הפלסמיד עוזר adenoviral pAdvDeltaF6 ^17.
2. קציר 5 ימים בינוני לאחר transfection חולף ולהתרכז באמצעות סינון תזרים משיק ^17.
3. לטהר את חלקיקי וקטור rAAV מהמדיום המרוכז באמצעות שיפוע צעד iodixanol ^17.
4. להשתמש בטכניקות מקובלות של PCR בזמן אמת עבור עותק גנומי (GC) ונחישות. בפרוטוקול זה, כייל וקטור של 3.0 GC E11 / מ"ל שימש לפיתוח מודל עכברוש מבוסס α-SYN עבור ¹⁷ PD.

2. הזרקת stereotactic של α-SYN rAAV וקטור ב SN של עכברוש (איור 2)

1. חולדות Wistar נקבה בת שמונה שבועות בית במשקל של כ 200-250 גרם תחת מחזור אור רגיל 12 hr / כהה עם גישה חופשית למזון pelleted ו מי ברז.
2. שלח את החולדה הזרקה (IP) הרדמה המכיל תערובת של קטמין (60 מ"ג / ק"ג) ו medetomidine (0.4 מ"ג / ק"ג). לאחר העכברוש הוא מורדם אינו מגיבכאשר לסחוט את הכפות שונים, לנהל מתחת לעור מיקרו-משדר על גב של עכברוש להכרה נוספת באמצעות implanter מיקרו-טרנספונדר. בדוק אם טרנספונדר מייקרו ממוקם כראוי וניתן לקרוא על ידי מכשיר הקריאה.
3. חותכים את השיער על גבי הקרקפת. החל בהרדמה מקומית משני הקרקפת והאוזניים. בצע את שאר הליך כירורגי תחת זרימה למינרית תוך שימוש בטכניקות aseptic.
4. מניח את החולדות בתוך מסגרת ראש stereotactic באמצעות שני ברי אוזניים, פה ובר אף. מכסים את הגוף של החולדה בשמיכה נייר כדי למנוע ירידה בחום הגוף. החל סיכה עינית כדי למנוע את העיניים מפני התייבשות.
5. לחטא את הקרקפת עם 1% jodium ב isopropanol 70% ולעשות חתך קטן קו האמצע של הקרקפת. בעדינות לגרד ממנו את הקרומים על הגולגולת ולשטוף עם מי מלח. תן יבש הגולגולת במשך כמה דקות. שים את התפרים הגולגולת ואת שתי נקודות התייחסות: גבחת ו למבדה.
6. כדי להזריק את וקטור rAAV לתוך SN, להגדיר את הקואורדינטות כלפי גבחת (anteroposterior: 5.3 מ"מ; mediolateral: 2.0 מ"מ ו dorsoventral: 7.2 מ"מ שנמדדות דורה).
   הערה: שלוש הקואורדינטות הממדיות עבור כל אזור של אינטרס יכולות להיות מחושבות באמצעות אטלס stereotaxic של מוח העכברוש, החלת גבחת כנקודת התייחסות אנטומיים.
7. ממלאים מזרק microinjection 10 μl (30 מד 20 מ"מ) עם וקטור rAAV ולמקם אותו המכשיר stereotaxic מחובר עם משאבה microinjection ממונע. לשלוט בעוצמת הקול על ידי שחרור טיפת וקטור ולחסל בתוך pH חומר ניקוי ניקוי רב ערכי 9 (למשל RBS).
8. ראייה לבדוק אם הראש מקובע ישר בפריים הראש ולהעריך את ציר ימין-שמאל. בזהירות חזותית להגדיר את הקואורדינטות anteroposterior ו mediolateral עבור גבחת ו למבדה ו למדוד את גובהם באמצעות מחט מ"מ 30 מד 20 בזרוע dorsoventral של מסגרת stereotactic.
   1. אפשר לפנות בוקרaximum הבדל 0.3 מ"מ גובה בין גבחת ו למבדה. מניחים את המחט חזרה על גבחת ולהחיל את anteroposterior קואורדינטות mediolateral ידי הזזת anteroposterior והזרוע mediolateral של מסגרת stereotactic.
9. במקום ההזרקה, למדוד את גובהם של הגולגולת ולהבטיח שזה לא שונה יותר מ -0.3 מ"מ מגובה של גבחת. לקדוח חור בגולגולת בקוטר של כ -2 מ"מ. מדדו את הגובה של דורה, זה ישמש כנקודת התייחסות ליישם את dorsoventral לתאם. לחלופין לחסר בעובי קבוע עבור הגולגולת (0.9 מ"מ).
10. לחדור הדורה באמצעות מחט מד 26 ו לספוג את הדם עם רקמה סטרילית. חכו עד שכל דימום הפסיק לפני שתמשיך.
11. לאט להכניס את המזרק microinjection 10 μl טעון מראש עם פתרון וקטור לתוך המוח לעומק שנקבע מראש (dorsoventral לתאם). מתן 1 דקות עם המחט במקום. להזריק 3 μlשל פתרון וקטור (מיליליטר / עותקים בגנום 3.0 E11 (מנת וקטור בינונית) או 1.0 מיליליטר E12 GC / (מנת וקטור גבוהה) של וקטור מלא מרמת rAAV2 / 7 α-SYN או eGFP) באמצעות משאבת microinjection הממונעת עם תפוקה של 0.25 μl / דקות.
12. לאחר הזרקה, לשמור את המחט במקום במשך 5 דקות אחרות לפני הסרתו לאט. לתפור את הקרקפת בעזרת קלוע פוליאסטר מצופה 3.0, לחטא עם 1% jodium ב 70% isopropanol בעדינות להסיר את החיה מן מכשיר stereotactic. ראשית לשחרר את הבר האף והפה, ואחר כך את שני ברים אוזניים.
13. להיפוך הרדמה, להזריק עכברוש intraperitoneally עם 0.5 מ"ג / ק"ג atipamezole ומניחים החולדה בכלוב נקי על צלחת חימום של 38 מעלות צלזיוס עד שהוא מתעורר. מכסים את החולדה בשמיכה נייר כדי למנוע ירידה בחום הגוף.
14. לספק גישה קלה מזון ומי השעות הראשונות. צג החולדה עבור הימים הראשונים. במידת הצורך ליישם שיכוך כאבים.
    הערה: אין צורך להסיר את התפרים מ tהוא גולגולת. לאחר 1-2 שבועות הגולגולת תתוקן לחלוטין ואת stiches תשתחרר.

3. הערכה מרמת rAAV2 / 7 חולדות מוזרקות α-SYN שימוש לא פולשני הדמית PET, בדיקות התנהגותיות וניתוח immunohistochemical

1. כדי להמשיך את קינטיקה של ניוון עצבי דופאמין nigrostriatal הלא פולשני לאורך זמן בחיות הפרט, לכמת נשא דופמין (DAT) מחייב באמצעות טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים קטן-חיה (PET) נותב של Transporter DA למשל ^[18 F] -FECT ¹⁶ .
2. המחקר היה לבדוק האם רמת מוחיי דופאמין היא מספיק כדי לגרום לקויות מוטוריות בחולדות, לייחד חולדות במבחן הגליל להעריך שימוש forelimb ספונטני.
   1. מניח את החולדה בתוך 20 סנטימטרי רוחב זכוכית שקוף גליל ווידאוטייפ ההתנהגות במהלך תנועות אנכיות לאורך הקיר והנחיתה לאחר אחורי. ציון מספר אנשי הקשר שנעשה על ידי כל בכפו עבור סכום כולל של 20אנשי קשר. לקבלת תיאור מפורט של קריטריוני הניקוד לראות Schallert et al. ¹⁸ לבטא את מספר אנשי קשר forelimb הלקוי (בכפו למשל משמאל) כאחוז קשר forelimb הכולל (משמאל בתוספת התקינה בכפו).
      הערה: חולדות שליטה ללא lesioned באמצעות שני הכפות באותה מידה צריכות להבקיע סביב 50% במבחן הזה.
3. בצע immunohistochemical (IHC) ניתוח כדי להעריך את רמת הביטוי transgene ואובדן התא דופאמין.
   1. בשלבים קצה שונים, להקריב את החולדות עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital (60 מ"ג / ק"ג, IP) ולבצע זלוף intracardial עם מי מלח קר ואחריו paraformaldehyde 4% ב PBS ^19. לקבע את המוח לילה ב 4 ° C ופצע 50 מיקרומטר חלקים במוח העטרה עבה באמצעות microtome רוטט.
   2. בצע מכתים IHC על סעיפים "פנויות" באמצעות נוגדנים כנגד α-SYN ו טירוזין hydroxylase לנתח רמות הביטוי α-SYN ואת level מוחיים ^16.

תוצאות

התכנית הכוללת של הניסוי מתוארת באיור 1

rAAV 2 / ביטוי יתר בתיווך 7 של A53T α-SYN גורם גירעונות מנוע תלוי דופמין.
מחקר היה לבדוק האם רמת ביטוי יתר α-SYN היא מספיק כדי לגרום לקויות מוט?...

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. כייל וקטור וכן טוהר וקטור השפיע באופן ישיר על התוצאה פנוטיפי של המודל. titers וקטור מוגזמת או קבוצות וקטור מטוהרים מספיק עלול לגרום לרעילות הלא ספציפית. לכן, השימוש של אצוות וקטור באיכות גבוהה וקטורי בקרה נאותים הוא הכרחי. יתר על כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female 8 weeks old Wistar rats	Janvier	/	200-250 g
Ketamine (Nimatek)	Eurovet animal health	804132
Medetomidine (Dormitor)	Orion-Pharma/ Janssen Animal Health	1070-499
Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel	Astrazeneca	0137-547
Terramycine	Pfizer	0132-472
Buprénorphine (Vetergesic)	Ecuphar	2623-627
Jodium 1% isopropanol	VWR	0484-0100
stereotactic head frame	Stoeling	/
Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2)	Hamilton/ Filter Service	7803-07
atipamezole (Antisedan)	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T α-SYN vector	LVVC, KU Leuven	/	https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
sodium pentobarbital (Nembutal)	Ceva Santé	0059-444
microtome	Microm	HM650
rabbit polyclonal synuclein Ab	Chemicon	5038	1:5,000
rabbit polyclonal TH Ab	Chemicon	152	1:1,000
Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph	Siemens/ Concorde Microsystems	/
radioligand: 18F-FECT	In house	/
L-dopa: Prolopa 125	Roche		6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
Foetal bovine serum	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD linear polyethylenimine (PEI)	Polysciences	/
OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition	Elsevier	/