JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Аннотация

Для изучения молекулярных путей, болезни Паркинсона (PD) и разработки новых терапевтических стратегий, научные исследователи полагаются на животных моделях. Идентификация PD-ассоциированных генов привело к разработке генетических моделей PD. Наиболее трансгенные модели α-SYN мыши развивать постепенное α-SYN патологии, но не могут отображать четкую потерю дофаминергическая клеток и допамин зависит от поведенческих проблем. Этот барьер был преодолен путем прямого нацеливания черной субстанции с вирусными векторами избыточно экспрессирующих PD-ассоциированных генов. Локальная доставка гена с использованием вирусных векторов обеспечивает привлекательный способ выразить трансгенов в центральной нервной системе. Конкретные области мозга могут быть ориентированы (например , черной субстанции), экспрессия может быть индуцирована в обстановке взрослых и высокие уровни экспрессии могут быть достигнуты. Кроме того, можно использовать различные векторные системы на основе различных вирусов. Протокол описывает все важные шаги для выполнения вирусного вектораинъекции в черной субстанции у крысы разработать вирусный вектор на основе альфа-синуклеина животной модели болезни Паркинсона.

Введение

Для изучения патофизиологии PD и для разработки новых терапевтических стратегий, существует настоятельная потребность в животных моделях, которые близко напоминают невропатологии, физиологии и двигательных симптомов человека PD. Чем выше прогностическая ценность, тем лучше мы можем перевести новые методы лечения от животных моделей для пациентов.

Обнаружение альфа-синуклеина (α-SYN) в качестве первого гена парк в 1997 году привело к разработке первых генетических моделей PD. Многие трансгенные мыши сверхэкспрессией человека дикого типа (WT) или мутантного (A30P, A53T) α-SYN были получены за последнее десятилетие. Уровни α-син сверхэкспрессии оказались решающими в развитии патологии. Кроме того , штамм мыши, наличие или отсутствие эндогенного альфа-син и будет ли полная длина или укороченная форма выражается, играет определенную роль (подробный обзор Маген и Chesselet 1). Сверхэкспрессия как WT и нескольких клинических мутантов человека &# 945; -SYN у трансгенных мышей вызывает патологическое накопление альфа-син и нейронной дисфункции 2-6. Тем не менее, до сих пор наиболее трансгенные модели α-син мышь не удалось отобразить четкие потери дофаминергическая клеток и допамин-зависимых поведенческих дефицитов.

Этот барьер был преодолен путем прямого нацеливания черной субстанции (SN) с вирусными векторами избыточно экспрессирующих альфа-син. Вирусные векторы являются производными от вирусов, которые могут легко инфицировать клетки, вводят генетический материал в их геном хозяина и заставить клетки-хозяина для репликации вирусного генома с целью получения новых вирусных частиц. Вирусы могут быть сконструированы для не-тиражирование вирусных векторов, которые сохраняют свою способность проникать в клетки и ввести гены. При удалении части вирусного генома, и заменяя их генами, представляющие интерес, применение вектора приведет к одной круглой инфекции без репликации в клетке-хозяине, в целом обозначенный как '' трансдукции. Вирусные векторы сиспользоваться как для избыточной экспрессии и молчанием генов. Выраженная трансген может быть репортером белок (например , зеленый флуоресцентный белок или люциферазы светляков) 7, терапевтический белок для генной терапии приложений 8-10 или, как мы сосредоточимся в этой статье, это болезнь , связанных с белком , используемым для моделирования заболевания 11 -14.

Вирусный вектор-опосредованной доставки генов обеспечивает альтернативный способ выразить трансгенов в ЦНС с несколькими преимуществами. Использование локальной доставки трансгена, специфические области мозга могут быть направлены. Кроме того, экспрессия трансгенов может быть вызван во взрослую жизнь уменьшая риск появления компенсаторных механизмов в процессе развития. Кроме того, модели могут быть созданы в различных видов и штаммов. И, наконец, различные трансгены могут быть легко объединены. С помощью вирусных векторов, уровни экспрессии высокого трансгенные может быть достигнуто, что может иметь решающее значение, так как начало заболевания и тяжесть часто зависит от уровня Переэксression.

Было разработано несколько векторных систем, основанных на различных вирусов. Выбор векторной системы зависит от размера представляющего интерес гена, необходимого продолжительности экспрессии гена, клетки-мишени и вопросы биологической безопасности. Для получения стабильного переноса генов в головном мозге, лентивирусов (LV) и рекомбинантный адено-ассоциированный Viral (Раав) векторов в настоящее время считаются векторные системы выбора, так как они приводят к эффективному и долгосрочному экспрессии генов в мозге грызунов. Для конкретного нацеливания дофаминергических нейронов (DN) в SN, Раав векторы постепенно outcompeted векторы ЛЖ из-за их более высоких титрах и эффективности трансдукции DN.

Лучшие модели , основанные на грызунах α-SYN , доступные в настоящее время были разработаны на основе комбинированного подхода с использованием более новых AAV серотипов (Раав 1, 5, 6, 7, 8) и оптимизированы векторные конструкции, титры и чистота 15,16. Вектор титра, а также чистота вектор непосредственно влияетфенотипический результат модели. Чрезмерные векторные титры или недостаточно очищенные векторные партии могут приводить к неспецифической токсичностью. Поэтому соответствующие управляющие векторы являются обязательными. Значительные инвестиции время в вирусный вектор производства, укрупнения и процедуры очистки также доказали важное значение для получения воспроизводимых и высококачественные векторные партии.

протокол

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с директивой Европейского сообщества Совета от 24 ноября 1986 года (86/609 / EEC) и утверждено биоэтическом комитетом университета Левена (Бельгия) по.

1. Рекомбинантный AAV Получение и очистка

Примечание: вектор производства и очистки Раав проводили Левен вирусный вектор сердечника (LVVC) , как описано выше 17.

  1. В кратком изложении, субконфлюентные низкий трансфекции (<50) проход прилипшие НЕК 293T клеток с использованием 25 кД линейный полиэтиленимин 150 раствор NaCl, трансфекция нмоль и три различных плазмид в соотношении 1: 1: 1 Добавление к среде 2% фетальной телячьей сыворотки. После 24 ч инкубации при 37 ° С в 5% CO 2, замените носитель свежей DMEM , среда 2% фетальной телячьей сыворотки.
    Примечание: Плазмиды включают конструкции для серотипа AAV7, передача ААВ плазмидой, кодирующей человеческий A53T мутант α-син под контролем CMVie усиливается SYNAPSin1 промотор и pAdvDeltaF6 аденовирусная плазмиды - хелпера 17.
  2. Заготавливают среда через 5 дней после кратковременной трансфекции и концентрируют с помощью фильтрации 17 с тангенциальным потоком.
  3. Очищают векторных частиц Раав из концентрированной среды с использованием Иодиксанол ступенчатый градиент 17.
  4. Использование стандартных методов ПЦР в реальном времени для определения геномных копий (GC). В этом протоколе, вектора титром 3,0 E11 GC / мл использовали для разработки модели крысы на основе α-SYN для PD 17.

2. стереотаксической инъекции Раав альфа-SYN Вектор в SN Крысы (Рисунок 2)

  1. Дом восемь недель самок крыс линии Вистар весом 200-250 г при нормальном 12 ч цикле свет / темнота со свободным доступом к гранулированной пище и водопроводной воде.
  2. Submit крысе внутрибрюшинного (IP) анестезия, содержащий смесь кетамина (60 мг / кг) и медетомидин (0,4 мг / кг). После того, как крыса под наркозом и не реагируеткогда сдавливая различные лапами, администрировать микро-транспондера подкожно на спине крысы для дальнейшего распознавания с помощью микро-транспондера имплантер. Проверьте, если микро-транспондера правильно установлен и может быть считан считывающим устройством.
  3. Вырезать волосы на верхней части головы. Нанесите местный анестетик как на кожу головы и ушей. Выполните остальную часть хирургической процедуры в соответствии с ламинарным потоком с использованием асептических методов.
  4. Поместите крыс в стереотаксической рамы головки, используя два уха бара, рот и нос бар. Накройте тело крысы с бумажным одеялом, чтобы избежать снижения температуры тела. Нанести глазную смазку, чтобы предотвратить глаз от высыхания.
  5. Лечить кожи головы с jodium 1% в изопропаноле 70% и сделайте небольшой надрез по средней линии головы. Аккуратно соскрести мембраны на черепе и промыть физиологическим раствором. Пусть череп высохнуть в течение нескольких минут. Соблюдайте черепных швов и две опорные точки: темени и лямбда.
  6. Для того, чтобы впрыснуть Раав вектор в SN, определяют координаты в направлении брегмы (переднезаднем: 5,3 мм; медиолатеральной: 2,0 мм и дорсовентральный: 7.2 мм, рассчитанные из ТМО).
    Примечание: Трехмерные координаты для каждой интересующей области можно вычислить с помощью стереотаксической атлас мозга крысы, применяя брегма в качестве анатомической точки отсчета.
  7. Заполните 10 мкл микроинъекции шприц (30 калибр 20 мм) с Раав вектором и поместить его в стереотаксической инструмент, связанный с моторизованным микроинъекции насосом. Регулировка громкости, выпуская каплю вектора и устранить в поливалентной моющего средства рН 9 (например , RBS).
  8. Визуально проверьте, если головка крепится прямо в раме головки и оценить лево-правой оси. Тщательно визуально определить переднезадней и медиолатеральной координаты брегмы и Lambda и измерить их высоту с помощью иглы 30 мм калибра 20 в дорсовентральной руку стереотаксической рамы.
    1. Разрешить утраaximum разница 0,3 мм в высоте между брегмы и Lambda. Поместите иглу обратно на брегмы и применять переднезаднем и медиолатеральной координаты, перемещая переднезаднем и медиолатеральной руку стереотаксической рамы.
  9. На месте инъекции, измеряют высоту черепа и убедитесь, что она не отличается более чем на 0,3 мм от высоты брегмы. Просверлите отверстие в черепе диаметром около 2 мм. Измерьте высоту Дура, это будет служить ориентиром для применения дорсовентральной координат. В качестве альтернативы вычитать фиксированную толщину для черепа (0,9 мм).
  10. Проникнуть твердую мозговую оболочку с использованием 26 иглы калибра и поглощать кровь с стерильной салфеткой. Подождите, пока все кровотечение не остановилось, прежде чем продолжить.
  11. Медленно вставьте 10 мкл микроинъекции шприц предварительно загруженным с вектором раствора в мозг к заранее определенной глубины (дорсовентральный координат). Подождите 1 мин с иглой в месте. Вводят 3 мклвекторного раствора (3,0 E11 геномных копий / мл (средний вектор доза) или 1,0 Е12 GC / мл (высокий вектор доза) rAAV2 / 7 & alpha; SYN или EGFP управления вектором) с использованием моторизованных микроинъекции насос с пропускной способностью 0,25 мкл / минимум
  12. После инъекции держать иглу на месте в течение еще 5 мин, а затем медленно удалить его. Вышивание кожу головы при помощи покрытого плетеного полиэфира 3.0, дезинфицируют 1% jodium в 70% изопропилового спирта и осторожно удалить животное от стереотаксической инструмента. Сначала ослабьте бар нос и рот, а затем два уха бара.
  13. Для обратного анестезии, инъекции крысе внутрибрюшинно 0,5 мг / кг атипамезола и помещают крысу в чистую клетку на нагревательной пластине 38 ° С, пока он не просыпается. Накройте крыса с бумажным одеялом, чтобы предотвратить падение температуры тела.
  14. Обеспечить легкий доступ к пище и воде в течение первых часов. Монитор крысы в ​​течение первых нескольких дней. При необходимости применять обезболивание.
    Примечание: Там нет необходимости удалять стежки из тон череп. Через 1-2 недели череп полностью отремонтированы и stiches отсоединился.

3. Оценка rAAV2 / 7 α-SYN Введенные Крысы с использованием неинвазивных ПЭТ, поведенческие тесты и иммуногистохимического анализа

  1. Для того, чтобы следить за кинетики нигростриатальных дофаминергической нейродегенеративные неинвазивным с течением времени в отдельных животных, количественно переносчика дофамина (DAT) связывания с использованием малых животных позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ) и трассирующими ПДР Transporter , например , [18 F] -FECT 16 ,
  2. Чтобы проверить, является ли достаточным уровень дофаминергической нейродегенерации, чтобы побудить двигательных нарушений у крыс, крыс подвергают испытанию цилиндра для оценки спонтанного использования передних конечностей.
    1. Поместите крысу в 20 см шириной ясно стеклянный цилиндр и видеокассета поведение во время вертикальных движений вдоль стены и посадки после тыла. Оценка количества контактов, сделанных каждой лапой в общей сложности 20контакты. Для получения подробного описания критериев подсчета очков см Schallert и др. 18 Экспресс количество обесцененных передних конечностей контактов (например , левая передняя лапа) в процентах от общего числа контактов (передних конечностей левый плюс правый лапой).
      Примечание: Не имеет поражений у контрольных крыс с использованием обеих лап в равной степени должны набрать около 50% в этом испытании.
  3. Выполните иммуногистохимического (IHC) анализа для оценки уровня экспрессии трансгена и потери дофаминергическая клеток.
    1. На разных конце стадии, жертвуют крыс с передозировкой пентобарбитала натрия (60 мг / кг, внутрибрюшинно) и выполнить внутрисердечной перфузию с холодным физиологическим раствором с последующей обработкой 4% параформальдегида в PBS 19. Сосредоточение мозг в течение ночи при температуре 4 ° С и разрезают толщиной 50 мкм Коронарные срезы мозга с помощью вибрирующий микротом.
    2. Выполнение IHC окрашивания на свободно плавающих участках с использованием антител против альфа-син и тирозингидроксилазе анализировать уровни экспрессии α-син и ЛеVel нейродегенерации 16.

Результаты

Общая схема эксперимента изображена на рисунке 1

Раав 2/7-опосредованной избыточная экспрессия A53T альфа-SYN индуцирует допамина-зависимого дефициты двигателя.
Чтобы проверить , является ли достаточным , чтобы вызв?...

Обсуждение

Есть несколько важных шагов в рамках протокола. Вектор титра, а также чистота вектор непосредственно влияет на фенотипическое исход модели. Чрезмерные векторные титры или недостаточно очищенные векторные партии могут приводить к неспецифической токсичностью. Таким образом, использо...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что не существует никакого фактического или потенциального конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Йорис Ван Asselberghs и Энн Ван Santvoort за отличную техническую помощь. Исследование финансировалось ИВТ-Vlaanderen (ИВТ SBO / 80020), в FWO Фландрии (G.0768.10), программой EC-FP6 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), проект MEFOPA FP7 RTD (Health -2009-241791), программа FP7 "InMind" (ЗДОРОВЬЕ-F2-2011-278850), Ку-Лёвен (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), а также MJFox Foundation (Целевая проверка 2010). А. Ван дер Перрен и С. Casteels являются постдокторской фламандского фонда научно-исследовательских работ. К. Ван Laere является старшим клинический сотрудник фламандского фонда научных исследований.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Female 8 weeks old Wistar ratsJanvier/200-250 g
Ketamine (Nimatek)Eurovet animal health804132
Medetomidine (Dormitor)Orion-Pharma/ Janssen Animal Health1070-499
 Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gelAstrazeneca0137-547
TerramycinePfizer0132-472
Buprénorphine (Vetergesic)Ecuphar2623-627
Jodium 1% isopropanolVWR0484-0100
stereotactic head frameStoeling/
Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2)Hamilton/ Filter Service7803-07
atipamezole (Antisedan)Orion-Pharma/Elanco1300-185
rAAV A53T α-SYN vectorLVVC, KU Leuven/https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
sodium pentobarbital (Nembutal)Ceva Santé0059-444
microtomeMicromHM650
rabbit polyclonal synuclein AbChemicon50381:5,000
rabbit polyclonal TH AbChemicon1521:1,000
Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomographSiemens/ Concorde Microsystems/
radioligand: 18F-FECTIn house/
L-dopa: Prolopa 125Roche6 mg/kg i.p.
DMEM, GlutamaxLife TechnologiesN° 31331-093
Foetal bovine serumLife TechnologiesN° 10270-106
25 kD linear polyethylenimine (PEI)Polysciences/
OptiPrep Density Gradient Medium: IodixanolSigmaD1556-250ML
OptimenLife TechnologiesN° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth EditionElsevier/

Ссылки

  1. Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
  2. Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
  3. Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
  4. Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
  5. Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
  6. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
  7. Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
  8. Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
  9. Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
  10. Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
  11. Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
  12. Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
  13. Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
  14. Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
  15. Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
  16. Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
  17. Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
  18. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  19. Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
  20. Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
  21. Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
  22. Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle?. Neuron. 35, 219-222 (2002).
  23. LeVine, H. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
  24. Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

108

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены