Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

Zusammenfassung

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Zusammenfassung

Um die molekularen Mechanismen der Parkinson-Krankheit (PD) und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu untersuchen, setzen wissenschaftliche Forscher an Tiermodellen. Die Identifizierung von PD-assoziierten Genen hat zu der Entwicklung von genetischen PD Modelle geführt. Die meisten transgenen α-SYN Mausmodelle entwickeln schrittweise α-SYN Pathologie aber nicht klar dopaminergen Zellverlust und Dopamin-abhängige Verhaltensdefiziten anzuzeigen. Diese Hürde wurde durch direkte Ausrichtung der Substantia nigra mit viralen Vektoren überexprimiert, PD-assoziierten Gene zu überwinden. Lokale Genübertragung mittels viraler Vektoren bietet eine attraktive Möglichkeit, Transgene in das zentrale Nervensystem zu exprimieren. Spezifischen Hirnregionen ausgerichtet werden können (zB der Substantia nigra), kann die Expression im adulten Einstellung und hohe Expressionsniveaus erreicht werden kann induziert werden. Ferner können verschiedene Vektor-Systeme auf der Basis verschiedener Viren verwendet werden. Das Protokoll legt alle entscheidenden Schritte, um einen viralen Vektor auszuführenInjektion in der Substantia nigra der Ratte einen viralen Vektor-basierte alpha-Synuclein-Tiermodell für die Parkinson-Krankheit zu entwickeln.

Einleitung

Um die Pathophysiologie von PD studieren und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, besteht ein dringender Bedarf an Tiermodellen, die eng an die Neuropathologie ähneln, Physiologie und motorischen Symptome der menschlichen PD. Je höher der prädiktive Wert ist, desto besser können wir neue Therapien von Tiermodellen für die Patienten zu übersetzen.

Die Entdeckung von alpha-Synuclein (α-SYN) als erstes PARK-Gen 1997 führte zu der Entwicklung der ersten genetischen PD-Modellen. Viele transgene Mäuse, die menschliche Wildtyp (WT) oder eine Mutante (A30P, A53T) α-SYN wurden in den letzten zehn Jahren erzeugt überexprimieren. Die Gehalte an α-SYN-Überexpression haben sich bei der Entwicklung der Pathologie von entscheidender Bedeutung zu sein. Auch die Mausstamm, das Vorhandensein oder Fehlen von endogenem α-SYN und ob die in voller Länge oder eine verkürzte Form exprimiert wird , spielt eine Rolle (detaillierte Überprüfung durch Magen und Chesselet ^1). Die Überexpression von sowohl WT und mehreren klinischen Mutanten des menschlichen &# 945; -syn in transgenen Mäusen induziert pathologischen Akkumulation von α-SYN und neuronale Dysfunktion ^2-6. Doch bis jetzt sind die meisten transgenen α-SYN Maus-Modellen keine klaren dopaminergen Zellverlust und Dopamin-abhängige Verhaltensdefiziten anzuzeigen.

Diese Hürde wurde durch direkte Ausrichtung der Substantia nigra (SN) mit viralen Vektoren überexprimiert, α-SYN überwinden. Virale Vektoren sind aus Viren stammen, die Zellen leicht infizieren können, stellen genetischem Material in ihren Wirtsgenom und zwingen die Wirtszelle das virale Genom, um zu replizieren, um neue Viruspartikel produzieren. Viren können zu nicht-replizierenden viralen Vektoren konstruiert werden, die ihre Fähigkeit behalten, in Zellen einzudringen und Gene einzuführen. Durch Teile des viralen Genoms zu löschen und sie durch die Gene von Interesse ersetzt, die Anwendung des Vektors in einer einzigen Runde Infektion ohne Replikation in der Wirtszelle führen, die allgemein als "Transduktion" bezeichnet. Virale Vektoren cein sowohl für die Überexpression und gene silencing verwendet werden. Das exprimierte Transgen ein Reporterprotein (zB grün fluoreszierende Protein oder Glühwürmchen - Luciferase) ^7, ein therapeutisches Protein für Gentherapie - Anwendungen sein können ^8-10 oder, wie wir in diesem Papier konzentrieren wird, um ein krankheitsbedingtes Protein für Krankheitsmodelle verwendet ^{11 -14.}

Virusvektor-vermittelte Genabgabe bietet eine alternative Möglichkeit Transgenen im ZNS mit mehreren Vorteilen auszudrücken. Mit lokalen Transgen Lieferung, können bestimmte Hirnregionen ausgerichtet sein. Ferner kann die Transgenexpression im Erwachsenenalter die Gefahr der Kompensationsmechanismen während der Entwicklung abnimmt induziert werden. Außerdem können Modelle in unterschiedlichen Arten und Stämme erstellt werden. Und schließlich können verschiedene Transgene leicht kombiniert werden. Verwendung von viralen Vektoren können hohe Transgen-Expressionsniveaus erreicht werden, was wichtig sein könnte, da der Beginn der Erkrankung und der Schwere auf der Ebene der ÜBERBEL häufig abhängigression.

Mehrere Vektorsysteme basieren auf verschiedenen Viren entwickelt worden. Die Wahl des Vektorsystems hängt von der Größe des Gens von Interesse, die erforderliche Dauer der Genexpression, die Zielzelle und die biologische Sicherheit Probleme. Zur stabilen Gentransfer in das Gehirn, lentivirale (LV) und rekombinantem adeno-assoziierter viraler (rAAV) -Vektoren sind nun die Vektorsysteme der Wahl angesehen, da sie auf effiziente und langfristige Genexpression im Nagetier Gehirn führen. Für spezifische Targeting der dopaminergen Neuronen (DN) des SN, rAAV Vektoren sind Vektoren LV allmählich outcompeted wegen ihrer höheren Titern und Transduktionseffizienz von DN.

Die besten α-SYN Basis Nagetiermodellen derzeit haben aus einem kombinierten Einsatz mit neueren AAV - Serotypen (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) und optimierte Vektorkonstrukte, Titer und Reinheit ^15,16 entwickelt. Der Vektor-Titer sowie der Vektor Reinheit direkt beeinflusstdas phänotypische Ergebnis des Modells. Übermäßige Vektor-Titer oder unzureichend gereinigte Vektor Chargen können in nicht-spezifische Toxizität führen. Daher sind geeignete Kontrollvektoren unverzichtbar. Erhebliche Zeitinvestitionen in den viralen Vektor Produktion, Upscaling und Reinigungsverfahren wurden ebenfalls als wesentlich erwiesen reproduzierbare und qualitativ hochwertige Vektor-Chargen zu erhalten.

Protokoll

Alle Tierversuche sind in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 24. November 1986 (86/609 / EWG) und genehmigt durch das Bioethical Komitee der Universität Leuven (Belgien) durchgeführt.

1. Rekombinante AAV Herstellung und Reinigung

Hinweis: rAAV - Vektor Produktion und Reinigung wurde durchgeführt von der Leuven viraler Vektor Core (LVVC) , wie zuvor ¹⁷ beschrieben.

1. Kurz gesagt, transfizieren subkonfluenten niedrig (<50) Passage anhaftenden HEK 293T-Zellen ein 25 kD Lineares Polyethylenimin 150 nM NaCl Transfektionslösung und drei verschiedene Plasmide in einem Verhältnis von 1: 1: 1 in DMEM-Medium, 2% fötales Rinderserum. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 ° C in einem 5% CO _2, ersetzen Sie das Medium durch frisches DMEM - Medium 2% fötales Rinderserum.
   Hinweis: Die Plasmide, die die Konstrukte für die AAV7 Serotyp enthalten, verbesserte das AAV-Transfer-Plasmid die menschliche A53T Mutante α-SYN unter der Kontrolle des CMVie kodieren synapsin1 - Promotor und der pAdvDeltaF6 adenoviralen Helferplasmid ^17.
2. Ernten Sie das Medium 5 Tage nach der transienten Transfektion und konzentrieren sich mit Tangentialstromfiltration ^17.
3. Reinige die rAAV - Vektorpartikel aus dem konzentrierten Medium eine Iodixanol Stufengradienten mit ^17.
4. Verwenden von Standardtechniken der Echtzeit-PCR für die genomische Kopie (GC) Bestimmung. In diesem Protokoll wurde ein Vektor - Titer von 3,0 E11 GC / ml verwendet , um ein α-SYN basierend Rattenmodell für ¹⁷ PD zu entwickeln.

2. Stereotactic Injektion von rAAV α-SYN Vektor in der SN der Ratte (Figur 2)

1. Haus acht Wochen alt weiblichen Wistar-Ratten, die etwa 200 bis 250 g unter einem normalen 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu pelle Nahrung und Leitungswasser mit einem Gewicht.
2. Werfen die Ratte intraperitoneal (ip) Narkose eine Mischung von Ketamin enthält (60 mg / kg) und Medetomidin (0,4 mg / kg). Sobald die Ratte betäubt und nicht reagiertwenn die verschiedenen Pfoten quetschen, zu verwalten für die weitere Anerkennung einen Mikrotransponder subkutan der Ratte auf der Rückseite einen Mikrotransponder implanter verwenden. Prüfen, ob der Mikrotransponder richtig positioniert ist und durch das Lesegerät ausgelesen werden.
3. Schneiden Sie die Haare auf der Oberseite der Kopfhaut. Tragen Sie eine lokale Betäubung sowohl auf der Kopfhaut und den Ohren. Führen Sie den Rest des chirurgischen Eingriffs unter einer laminaren Strömung unter aseptischen Bedingungen.
4. Legen Sie die Ratten in einem stereotaktischen Kopfrahmen mit zwei Ohr Bars, einen Mund und eine Nase bar. Bedecken Sie den Körper der Ratte mit einem Papiertuch einen Abfall der Körpertemperatur zu vermeiden. Anwenden eines okularen Gleitmittel, die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern.
5. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit jodium 1% in Isopropanol 70% und machen einen kleinen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut. Kratzen Sie vorsichtig die Membranen auf dem Schädel entfernt und Spülen mit Kochsalzlösung. Lassen Sie den Schädel trocken für einige Minuten. Beachten Sie die Schädelnähte und die beiden Bezugspunkte: Bregma und Lambda.
6. Um den rAAV-Vektor in den SN injizieren, definieren die Koordinaten in Richtung Bregma (von vorne nach hinten: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm und dorsoventrale: 7,2 mm von der Dura berechnet).
   Hinweis: Die dreidimensionalen Koordinaten für jede Region von Interesse berechnet werden kann, eine stereotaktischen Atlas des Rattengehirns mit, Bregma als anatomischen Bezugspunkt der Anwendung.
7. Füllen Sie eine 10 & mgr; l Mikroinjektionsspritze (30 Gauge 20 mm) mit rAAV-Vektor und legen Sie sie in der stereotaktischen Instrument mit einem motorisierten Mikroinjektionspumpe angeschlossen. Kontrollieren Sie die Lautstärke , indem Sie einen Tropfen Vektor Freigabe und in einem polyvalenten Reinigungsmittel pH 9 (zB RBS) zu beseitigen.
8. Optisch prüfen, ob der Kopf gerade in der Kopfrahmen befestigt ist und die Links-Rechts-Achse zu bewerten. Sorgfältig visuell die von vorne nach hinten und mediolateral Koordinaten für Bregma und Lambda definieren und deren Höhe eine 30-Gauge-20 mm-Nadel in dorsoventraler Arm des stereotaktischen Rahmen mit messen.
   1. Erlauben Uhraximale von 0,3 mm Höhenunterschied zwischen Bregma und Lambda. Legen Sie die Nadel wieder auf Bregma und wenden die von vorne nach hinten und mediolateral Koordinaten durch die von vorne nach hinten und die mediolateral Arm des stereotaktischen Rahmen bewegen.
9. Am Ort der Injektion, messen die Höhe des Schädels und sicherzustellen, dass er nicht mehr als 0,3 mm von der Höhe des Bregma unterscheidet. Bohren Sie ein Loch in den Schädel mit einem Durchmesser von etwa 2 mm. Messen Sie die Höhe der Dura, dies dient als Referenz der dorsoventrale anzuwenden koordinieren. Alternativ subtrahieren für den Schädel einer festen Dicke (0,9 mm).
10. Dringen die Dura eine 26-Gauge-Nadel und das Blut mit einem sterilen Gewebe absorbieren. Warten Sie, bis alle Blutungen, bevor Sie fortfahren gestoppt hat.
11. einfügen langsam die 10 & mgr; l Mikroinjektionsspritze mit Vektor-Lösung in das Gehirn auf die vorgegebene Tiefe vorbelastet (dorsoventrale Koordinate). Warten Sie 1 min mit der Nadel an Ort und Stelle. Injizieren 3 ulder Vektorlösung (3,0 E11 Genomkopien / ml (mittlerer Vektor Dosis) oder 1,0 E12 GC / ml (high Vektor Dosis) von rAAV2 / 7 α-SYN oder eGFP Kontrollvektor) des motorisierten Mikroinjektionspumpe mit einem Durchsatz von 0,25 & mgr; l unter Verwendung von / Minute
12. Nach der Injektion, halten Sie die Nadel an Ort und Stelle für eine weitere min 5, bevor es langsam zu entfernen. Nähen Sie die Kopfhaut mit beschichteten geflochtenen Polyester 3.0, desinfizieren mit 1% jodium in 70% Isopropanol und sanft das Tier aus dem Gerät zu entfernen Stereotaxie. Lösen Sie zuerst die Nase und den Mund Bar, dann die beiden Ohr Bars.
13. Um die Anästhesie umkehren, injizieren die Ratte intraperitoneal mit 0,5 mg / kg Atipamezol und legen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig auf einer Heizplatte von 38 ° C, bis er aufwacht. Decken Sie die Ratte mit einem Papiertuch einen Abfall der Körpertemperatur zu verhindern.
14. Bieten Sie einfachen Zugang zu Nahrung und Wasser für die ersten Stunden. Überwachen Sie die Ratte für die ersten paar Tage. Bei Bedarf anwenden Analgesie.
    Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit, die Maschen von t zu entfernen,er Schädel. Nach 1-2 Wochen wird der Schädel vollständig repariert und die Stiche lösen.

3. Bewertung der rAAV2 / 7 α-SYN injizierten Ratten mit nicht-invasiven PET-Bildgebung, Verhaltenstests und immunhistochemischen Analyse

1. Um die Kinetik der nigrostriatale dopaminergen Neurodegeneration nicht-invasiv im Laufe der Zeit in den einzelnen Tieren verfolgen, zu quantifizieren Dopamin - Transporter (DAT) Bindung unter Verwendung von Kleintier - Positronen - Emissions - Tomographie (PET) und einen Tracer des DA - Transporter zB ^[18 F] -Fect ¹⁶ .
2. Um zu untersuchen, ob die Höhe der dopaminergen Neurodegeneration ausreicht motorischen Beeinträchtigungen bei den Ratten zu induzieren, die Ratten zu dem Zylinder Test unterziehen, um spontane forelimb Gebrauch zu bewerten.
   1. Legen Sie die Ratte in einer Breite von 20 cm Klarglaszylinder und Video das Verhalten bei vertikalen Bewegungen entlang der Wand und der Landung nach einem hinten. Ergebnis die Anzahl der Kontakte von jedem forepaw für insgesamt 20 gemachtKontakte. Ausführliche Beschreibung der Bewertungskriterien siehe Schallert et al. ¹⁸ Express die Anzahl der beeinträchtigten forelimb Kontakte (zB linke forepaw) als Prozentsatz der gesamten forelimb Kontakte (links und rechts forepaw).
      Hinweis: Nicht-lädierten Kontrollratten beide Pfoten mit ebenso sollte etwa 50% in diesem Test punkten.
3. Führen Sie immunhistochemischen (IHC) Analyse der Ebene der Transgen-Expression und dopaminergen Zellverlust zu bewerten.
   1. Zu verschiedenen Endstadien opfern die Ratten mit einer Überdosis von Natriumpentobarbital (60 mg / kg, ip) und eine intrakardiale Perfusion mit kalter Kochsalzlösung mit 4% Paraformaldehyd in PBS ¹⁹ gefolgt zuführen. Fixieren Sie die Gehirne über Nacht bei 4 ° C und schnitt 50 um dicke koronale Hirnschnitten einen vibrierenden Mikrotom.
   2. Führen Sie IHC-Färbung auf frei schwebenden Abschnitte Antikörper gegen α-SYN und Tyrosin-Hydroxylase unter Verwendung des Ausdrucks α-SYN Ebenen zu analysieren und die level der Neurodegeneration ^16.

Ergebnisse

Das Gesamtkonzept des Experiments ist in Abbildung 1 dargestellt

2 rAAV / 7-vermittelte Überexpression von A53T α-SYN induziert Dopamin-abhängige motorische Defizite.
Um zu untersuchen , ob die Höhe der α-SYN - Überexpression ausreichend ist , motorischen Beeinträchtigungen bei Ratten zu induzieren, wir die Ratten zur Zylindertest unterzogen , um spontane forelimb Verwendung

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb des Protokolls. Der Vektor-Titer sowie der Vektor Reinheit beeinflusst direkt die phänotypische Ergebnis des Modells. Übermäßige Vektor-Titer oder unzureichend gereinigte Vektor Chargen können in nicht-spezifische Toxizität führen. Daher ist die Verwendung von hochwertigen Vektor Chargen und geeignete Kontrollvektoren unverzichtbar. Ferner wird die genaue Positionierung des Kopfes der Ratte in den stereotaktischen Rahmen und die genaue Bestimmung der Koordinaten essenti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female 8 weeks old Wistar rats	Janvier	/	200-250 g
Ketamine (Nimatek)	Eurovet animal health	804132
Medetomidine (Dormitor)	Orion-Pharma/ Janssen Animal Health	1070-499
Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel	Astrazeneca	0137-547
Terramycine	Pfizer	0132-472
Buprénorphine (Vetergesic)	Ecuphar	2623-627
Jodium 1% isopropanol	VWR	0484-0100
stereotactic head frame	Stoeling	/
Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2)	Hamilton/ Filter Service	7803-07
atipamezole (Antisedan)	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T α-SYN vector	LVVC, KU Leuven	/	https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
sodium pentobarbital (Nembutal)	Ceva Santé	0059-444
microtome	Microm	HM650
rabbit polyclonal synuclein Ab	Chemicon	5038	1:5,000
rabbit polyclonal TH Ab	Chemicon	152	1:1,000
Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph	Siemens/ Concorde Microsystems	/
radioligand: 18F-FECT	In house	/
L-dopa: Prolopa 125	Roche		6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
Foetal bovine serum	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD linear polyethylenimine (PEI)	Polysciences	/
OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition	Elsevier	/