Élaboration d'un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d'un vecteur viral adéno-associé recombinant

Résumé

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Résumé

Afin d'étudier les voies moléculaires de la maladie de Parkinson (PD) et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, les chercheurs scientifiques reposent sur des modèles animaux. L'identification des gènes PD-associé a conduit à l'élaboration de modèles PD génétiques. La plupart des modèles transgéniques de souris α-SYN développer progressivement la pathologie α-SYN, mais ne parviennent pas à afficher une perte de cellules dopaminergiques claire et des déficits comportementaux dopamine-dépendante. Cet obstacle a été surmonté par le ciblage direct de la substantia nigra avec des vecteurs viraux surexprimant les gènes PD-associés. la livraison de gènes local en utilisant des vecteurs viraux fournit un moyen attrayant pour exprimer des transgènes dans le système nerveux central. Des régions cérébrales spécifiques peuvent être ciblés (par exemple , le locus niger), l' expression peut être induite dans le cadre des adultes et des niveaux d'expression élevés peuvent être atteints. En outre, des systèmes de vecteurs différents en fonction de différents virus peuvent être utilisés. Le protocole décrit toutes les étapes cruciales pour effectuer un vecteur virall'injection dans la substance noire de rat pour développer un modèle animal vecteur viral à base d'alpha-synucléine dans la maladie de Parkinson.

Introduction

Pour étudier la physiopathologie de PD et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il y a un besoin urgent de modèles animaux qui ressemblent étroitement les symptômes neuropathologie, physiologie et moteur de PD humaine. La valeur prédictive plus élevée, mieux nous pouvons traduire de nouvelles thérapies de modèles animaux pour les patients.

La découverte de l'alpha-synucléine (α-SYN) comme premier gène PARK en 1997 a conduit au développement des premiers modèles pharmacodynamiques génétiques. Beaucoup de souris transgéniques surexprimant humain de type sauvage (WT) ou mutant (A30P, A53T) α-SYN ont été générés au cours de la dernière décennie. Les niveaux d'α-SYN surexpression se sont révélés être crucial dans le développement de la pathologie. Aussi la souche de souris, la présence ou l' absence de endogène α-SYN et si la longueur totale ou une forme tronquée est exprimée, joue un rôle (examen détaillé par Magen et Chesselet ^1). La surexpression à la fois de type sauvage et des mutants de plusieurs cliniques humains et# 945; SYN chez des souris transgéniques induit l' accumulation pathologique de α-SYN et un dysfonctionnement neuronal ^2-6. Cependant, jusqu'à ce que les modèles les plus maintenant transgéniques de souris α-SYN échoué à afficher une perte de cellules dopaminergiques claire et des déficits comportementaux dopamine-dépendante.

Cet obstacle a été surmonté par le ciblage direct de la substantia nigra (SN) avec des vecteurs viraux surexprimant α-SYN. Les vecteurs viraux sont dérivés de virus qui peuvent infecter des cellules facilement, d'introduire du matériel génétique dans leur génome hôte et la force de la cellule hôte de répliquer le génome viral afin de produire de nouvelles particules virales. Les virus peuvent être modifiés pour des vecteurs non répliquants viraux qui conservent leur capacité à pénétrer dans les cellules et introduire des gènes. En supprimant des parties du génome viral et de les remplacer par des gènes d'intérêt, l'application du vecteur résultera en une seule infection ronde sans se répliquer dans la cellule hôte, désigné comme «transduction». vecteurs viraux cun être utilisé pour les deux surexpression et le silençage génique. Le transgène exprimé peut être une protéine rapporteur (par exemple des protéines vert fluorescent ou la luciférase de luciole) ^7, une protéine thérapeutique pour des applications de thérapie génique ^8-10 ou, comme nous allons nous concentrer dans ce papier, une protéine liée à la maladie utilisé pour la modélisation de la maladie ^{11 -14.}

la livraison de gènes médiée par un vecteur viral constitue un autre moyen d'exprimer des transgènes dans le SNC avec plusieurs avantages. Utilisation de la prestation de transgène locale, des régions cérébrales spécifiques peuvent être ciblés. En outre, l'expression du transgène peut être induite à l'âge adulte pour diminuer le risque de mécanismes de compensation au cours du développement. En outre, les modèles peuvent être créés en différentes espèces et souches. Et enfin, les différents transgènes peuvent facilement être combinés. En utilisant des vecteurs viraux, des niveaux élevés d'expression du transgène peut être atteint, ce qui peut être crucial puisque l'apparition et la gravité de la maladie dépendent souvent du niveau de OVEREXPression.

Plusieurs systèmes de vecteurs à base de virus ont été développés. Le choix du système de vecteur dépend de la taille du gène d'intérêt, la durée requise de l'expression génique, la cellule cible et des problèmes de biosécurité. Pour un transfert de gène stable dans le cerveau, lentivirus (LV) et du virus adéno-associé recombinant (rAAV) des vecteurs sont maintenant considérés comme des systèmes de vecteurs de choix car ils conduisent à une expression de gène efficace et à long terme dans le cerveau des rongeurs. Pour le ciblage spécifique des neurones dopaminergiques (DN) de la SN, vecteurs rAAV ont progressivement surpassés vecteurs LV en raison de leurs titres plus élevés et l'efficacité de transduction de DN.

Les modèles de rongeurs à base meilleures α-SYN actuellement disponibles ont été élaborées à partir d' une approche combinée en utilisant les nouveaux sérotypes d'AAV (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) et optimisé des constructions de vecteur, des titres, et la pureté ^15,16. Le titre du vecteur, ainsi que la pureté du vecteur influence directementle résultat phénotypique du modèle. Les titres de vecteur excessifs ou lots de vecteurs insuffisamment purifiés peuvent entraîner une toxicité non spécifique. Par conséquent, les vecteurs de contrôle appropriés sont indispensables. investissement de temps considérable dans la production de vecteur, upscaling, et les procédures de purification virale ont également révélé essentiel pour obtenir des lots de vecteurs reproductibles et de qualité.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées conformément aux Communautés européennes Directive du Conseil du 24 Novembre 1986 (86/609 / CEE) et approuvés par le Comité de bioéthique de l'Université de Louvain (Belgique).

1. AAV recombinant Production et purification

Remarque: la production du vecteur rAAV et la purification a été effectuée par le Leuven vecteur viral de base (LVVC) comme décrit précédemment ^17.

1. En bref, transfecter subconfluent faible (<50), le passage des cellules HEK 293T adhérentes au moyen d'un 25kD linéaire polyéthylènimine 150 de solution de transfection nM de NaCl et trois plasmides différents dans un rapport de 1: 1: 1 dans du milieu DMEM 2% de sérum bovin foetal. Après 24 heures d'incubation à 37 ° C dans 5% de CO _2, remplacer le milieu par du milieu DMEM frais 2% de sérum de fœtus bovin.
   Nota: Les plasmides comprennent les produits d'assemblage pour le sérotype VAA7, le plasmide de transfert de l'AAV codant pour le mutant A53T humain α SYN sous le contrôle de l'CMVIE renforcée synapspromoteur in1 et pAdvDeltaF6 adénoviral plasmide auxiliaire ^17.
2. Récolter les 5 moyennes jours après transfection transitoire et on concentre en utilisant une filtration à flux tangentiel ^17.
3. Purifier le vecteur rAAV particules du milieu concentré en utilisant un iodixanol étape gradient ^17.
4. Utilisez des techniques standard de PCR en temps réel pour la copie génomique (GC) détermination. Dans ce protocole, un titre de vecteur de 3,0 E11 GC / ml a été utilisée pour développer un modèle de rat en fonction α-SYN pour PD ^17.

2. Injection stéréotactique de rAAV α-SYN dans le vecteur SN du rat (figure 2)

1. Maison huit semaines vieux rats Wistar femelles pesant environ 200-250 g sous 12 h cycle lumière / obscurité normale avec un accès libre à la nourriture et à granulés l'eau du robinet.
2. Soumettre le rat par voie intrapéritonéale (ip) une anesthésie contenant un mélange de kétamine (60 mg / kg) et de médétomidine (0,4 mg / kg). Une fois que le rat est anesthésié et ne réagit pasquand serrant les différentes pattes, administrer une voie sous-cutanée micro-transpondeur sur le dos du rat pour une reconnaissance supplémentaire en utilisant un implanteur micro-transpondeur. Vérifiez si le micro-transpondeur est positionné correctement et peut être lu par le dispositif de lecture.
3. Couper les cheveux sur le dessus du cuir chevelu. Appliquer un anesthésique local à la fois sur le cuir chevelu et les oreilles. Effectuer le reste de la procédure chirurgicale sous un flux laminaire en utilisant des techniques aseptiques.
4. Placez les rats dans un cadre de tête stéréotaxique utilisant deux barres d'oreilles, une bouche et une barre de nez. Recouvrir le corps du rat avec une couverture en papier pour éviter une baisse de la température corporelle. Appliquer un lubrifiant oculaire pour empêcher les yeux de sécher.
5. Désinfecter le cuir chevelu avec jodium 1% dans de l'isopropanol 70% et faire une petite incision sur la ligne médiane du cuir chevelu. racler délicatement pour enlever les membranes sur le crâne et rincer avec une solution saline. Laissez le crâne sec pendant plusieurs minutes. Observer les sutures crâniennes et les deux points de référence: bregma et Lambda.
6. Pour injecter le vecteur rAAV dans le SN, définir les coordonnées vers bregma (antéropostérieur: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm et dorso-ventral: 7,2 mm calculées à partir de la dure-mère).
   Remarque: Les coordonnées tridimensionnelles pour chaque région d'intérêt peuvent être calculées à l'aide d'un atlas stéréotaxiques du cerveau de rat, en appliquant Bregma comme point de référence anatomique.
7. Remplir une seringue de microinjection 10 ul (30 gauge 20 mm) avec un vecteur de rAAV et le placer dans l'instrument stéréotaxique relié à une pompe à micro-injection motorisée. Contrôlez le volume en libérant une goutte de vecteur et d' éliminer dans un détergent de nettoyage polyvalent pH 9 (par exemple RBS).
8. vérifier visuellement si la tête est fixée directement dans le cadre de la tête et d'évaluer l'axe gauche-droite. Soigneusement définir visuellement les coordonnées antéropostérieur et médio pour bregma et Lambda et mesurer leur hauteur à l'aide d'une aiguille de calibre 30 à 20 mm dans le bras dorso-ventral du cadre stéréotaxique.
   1. Autoriser amaximum de 0,3 mm de différence de hauteur entre bregma et Lambda. Placez l'aiguille sur bregma et appliquer la face et coordonnées médio en déplaçant le antéropostérieur et le bras mediolateral du cadre stéréotaxique.
9. A l'endroit de l'injection, mesurer la hauteur du crâne et veiller à ce qu'elle ne diffère pas de plus de 0,3 mm de la hauteur du bregma. Percer un trou dans le crâne avec un diamètre d'environ 2 mm. Mesurer la hauteur de la dure, cela va servir de référence pour appliquer la dorso-ventral de coordonnées. Vous pouvez soustraire une épaisseur fixe pour le crâne (0,9 mm).
10. Pénétrer la dure en utilisant une aiguille de calibre 26 et d'absorber le sang avec un tissu stérile. Attendre jusqu'à ce que tout saignement a cessé avant de poursuivre.
11. Insérez lentement la microinjection seringue de 10 ul pré-chargé avec une solution de vecteur dans le cerveau à la profondeur prédéterminée (dorso-ventral de coordonnées). Attendre 1 min avec l'aiguille en place. Injecter 3 pide la solution de vecteur (3,0 E11 génome copies / ml (dose de vecteur moyen) ou 1,0 E12 GC / ml (dose élevée de vecteur) de rAAV2 / 7 α-SYN ou eGFP vecteur de contrôle) en utilisant la pompe de microinjection motorisé avec un débit de 0,25 ul / min.
12. Après l'injection, maintenir l'aiguille en place pendant 5 min avant de le retirer lentement. Piquez le cuir chevelu en utilisant enduit polyester tressé 3.0, désinfecter avec 1% jodium dans 70% d'isopropanol et retirez délicatement l'animal de l'instrument stéréotaxique. Tout d'abord desserrer la barre de nez et la bouche, puis les deux barres d'oreilles.
13. Pour inverser l'anesthésie, injecter le rat par voie intrapéritonéale avec 0,5 mg / kg atipamezole et placer le rat dans une cage propre sur une plaque de chauffage de 38 ° C jusqu'à ce qu'il se réveille. Couvrir le rat avec une couverture en papier pour empêcher une chute de la température corporelle.
14. Fournir un accès facile à la nourriture et de l'eau pendant les premières heures. Surveiller le rat pendant les premiers jours. Si nécessaire, appliquer une analgésie.
    Remarque: Il n'y a pas besoin d'enlever les points de suture de til crâne. Après 1-2 semaines, le crâne est complètement réparé et les stiches se détacher.

3. Évaluation des rAAV2 / 7 α-SYN Rats injecté à l'aide non-invasive PET Imaging, Tests du comportement et de l'analyse immunohistochimique

1. Pour faire suite à la cinétique de dopaminergique nigro neurodégénérescence effractive non au fil du temps chez les animaux individuels, quantifier transporteur de la dopamine (DAT) de liaison utilisant la tomographie petits animaux tomographie par émission (PET) et un traceur de DA Transporter par exemple ^[18 F] -Fect ¹⁶ .
2. Pour examiner si le niveau de dopaminergique neurodégénérescence est suffisante pour induire une déficience motrice chez les rats, les rats soumettre à l'épreuve de la bouteille pour évaluer l'utilisation de forelimb spontanée.
   1. Placez le rat dans une largeur de 20 cm clair cylindre de verre et de filmer le comportement lors des mouvements verticaux le long du mur et à l'atterrissage après une arrière. Note le nombre de contacts établis par chaque patte pour un total de 20Contacts. Pour une description détaillée des critères de notation voir Schallert et al. ¹⁸ exprimer le nombre de contacts forelimb avec facultés affaiblies (par exemple des pattes avant gauche) en pourcentage de contacts de forelimb totaux ( de gauche , plus forepaw droite).
      Remarque: les rats témoins non lésés à l'aide de deux pattes aussi devraient marquer environ 50% dans ce test.
3. Effectuer histochimie (IHC), une analyse immunohistochimique pour évaluer le niveau d'expression du transgène et la perte de cellules dopaminergiques.
   1. A différents stades finaux, sacrifiez les rats avec une dose excessive de pentobarbital sodique (60 mg / kg, ip) et effectuer une perfusion intracardiaque avec du sérum physiologique froid suivi de 4% de paraformaldehyde dans du PBS ^19. Fixer les cerveaux nuit à 4 ° C et couper 50 um sections coronales de cerveau épais en utilisant un microtome vibrant.
   2. Effectuer la coloration IHC sur les sections flottantes utilisant des anticorps contre α-SYN et de la tyrosine hydroxylase pour analyser les niveaux d'expression α-SYN et le chiervel de neurodégénérescence ^16.

Résultats

Le schéma d' ensemble de l'expérience est représenté sur la figure 1

surexpression de rAAV 07/02 à médiation A53T α-SYN induit des déficits moteurs dopamine-dépendante.
Pour examiner si le niveau d'α-SYN surexpression est suffisante pour induire une déficience motrice chez les rats, nous avons soumis les rats à l'épreuve du ...

Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. Le titre du vecteur, ainsi que la pureté du vecteur influence directement le résultat phénotypique du modèle. Les titres de vecteur excessifs ou lots de vecteurs insuffisamment purifiés peuvent entraîner une toxicité non spécifique. Par conséquent, l'utilisation de lots de vecteurs de haute qualité et des vecteurs de contrôle appropriés est indispensable. En outre, le positionnement exact de la tête du rat dans le cadre stéréotaxique et une déterm...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female 8 weeks old Wistar rats	Janvier	/	200-250 g
Ketamine (Nimatek)	Eurovet animal health	804132
Medetomidine (Dormitor)	Orion-Pharma/ Janssen Animal Health	1070-499
Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel	Astrazeneca	0137-547
Terramycine	Pfizer	0132-472
Buprénorphine (Vetergesic)	Ecuphar	2623-627
Jodium 1% isopropanol	VWR	0484-0100
stereotactic head frame	Stoeling	/
Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2)	Hamilton/ Filter Service	7803-07
atipamezole (Antisedan)	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T α-SYN vector	LVVC, KU Leuven	/	https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
sodium pentobarbital (Nembutal)	Ceva Santé	0059-444
microtome	Microm	HM650
rabbit polyclonal synuclein Ab	Chemicon	5038	1:5,000
rabbit polyclonal TH Ab	Chemicon	152	1:1,000
Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph	Siemens/ Concorde Microsystems	/
radioligand: 18F-FECT	In house	/
L-dopa: Prolopa 125	Roche		6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
Foetal bovine serum	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD linear polyethylenimine (PEI)	Polysciences	/
OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition	Elsevier	/