גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

Summary

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Abstract

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

בפגיעות עצבים, גדמי הפרוקסימלי ועצב דיסטלי מנועים לעתים קרובות מן ההתכנסות ישירה של fascicles עצב בשל באתר הנגע ^1-2. בדרך כלל, קטעי האקסון מורכבים הורה מאוד ומיושר צרורות של אקסונים, המהווים רשתות מורכבות של קישוריות. עם זאת, התחדשות של עצבים היא תהליך כאוטי עקב יישור האקסון מאורגן היטב ^3-4. לכן, כדי ליצור כמות מספקת של התחדשות אקסונים כי לגשר על אתר הנגע, יש צורך להשרות יישור אקסונלית מאורגן היטב. בנוסף, פגיעה במיאלין מלווה פציעות עצב בשל מות התאים myelinating במקום הפציעה. מאז demyelination מאוד פוגע קיבולת המוליך לשרוד אקסונים, טיפולי מיקוד demyelination או קידום מיאלין מחדש הם משמעותיים עבור התאוששות תפקודית לאחר פגיעה עצבית ^5. לכן המטרה של פרוטוקול זה היא להמחיש גישה הנדסית מטפלת בשני נושאים אלושל התחדשות של עצבים.

אנאיזוטרופיה Surface, אשר מוגדרת כהבדל, כאשר נמדדו לאורך צירים שונים, בתוך התכונות הפיסיקליות או מכאניות של חומר, יושמה להשפיע יישור תא, צמיחה, והגירת ^6-7. בנוסף טופוגרפיה, ישנן שיטות אחרות כדי לגרום אנאיזוטרופיה. בעבר, חקרנו אנאיזוטרופיה משטח המושרה על ידי מראש מתיחה סטטית מכני של פולי-דימתיל-siloxane (PDMS) קרום. התאוריה של "סופר עיוות קטן המוטל על גדול" חזתה כי הנוקשות היעילות התאים לחוש בכיוון נמתח נבדלו בכיוון ניצב, וההבדל הזה נוקשות יעילות הוא בשל שטח אנאיזוטרופיה ^8. בתאי גזע mesenchymal (MSCs) בתרבית על קרום מראש נמתח PDMS מסוגלים לחוש את אנאיזוטרופיה ידי משיכת משטח פעיל וכתוצאה מכך, ליישר בכיוון מראש נמתח ^9. באופן דומה, ar משטח איזוטרופיאייסינג ממשטח מראש נמתח מכני משפיע על יישור, כמו גם צמיחה myelination של גנגליון השורש הגבי (DRG) אקסונים ^10. כאן אנו מספקים פרוטוקול גרימת אנאיזוטרופיה השטח על מצע PDMS מראש נמתח סטטי כדי לשפר התחדשות האקסון ^10.

כדי לעורר יישור האקסון, תכונות טופולוגי עם דפוסים רצויים, דיווח על מנת לספק הדרכת קשר באמצעות סיבים מיושרים וערוצים ^6,11-12, הודגמו כדי להקל יישור האקסון ^11,13. עם זאת, דיווח טכניקות גרימת יישור האקסון באמצעות תכונות טופולוגי, כגון סיבים, ערוצי דפוסים, לא הצליח להאריך ולהגדיל את העובי של אקסונים. לעומת זאת, הדרגתי מכאני מתיחה הוביל יישור האקסון לכיוון המתיח עם אקסונים ארוך ועבה כי גדל עם הגודל של המתיחה ^14. עם זאת, כולל התקן מנוע מופעל vivo אינואפשרי. לעומת זאת, אנאיזוטרופיה סטטי מושרה מראש נמתחת היא פחות מסובכת ויכולה להיות משולבת יותר בקלות לתוך עיצובי פיגום בעתיד ליישומי in vivo.

בפרוטוקול זה, מערכת תרבית תאים טרום נמתח סטטי משמש לגרום אנאיזוטרופיה משטח ללא תכונות טופולוגי. מערכת ההתרבות נמתח מראש מורכב קרום PDMS, מסגרת stretchable ובמה מתיחה, ואז הממברנה מקובע המסגרת בסדר גודל למתוח מראש מוחל על הבמה המתיחה. טרי מבודד נוירונים DRG מתורבת על פני השטח טרום נמתח עד 21 ימים מנוטרים ליישור ועובי האקסון. כתוצאה מכך, תאי שוואן (SCS) שיתוף תרבותי עם אקסונים המיושרים מנוטרים עבור מעטפת המיאלין. על ידי שילוב אנאיזוטרופיה משטח המושרה מראש למתוח הצלחנו לשפר התא יישור-בידול האקסון יישור-צמיחה של MSCs ונוירונים DRG ^9-10, בהתאמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים עבור בידוד של תאים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת מישיגן.

1. הכנת שטח אניזוטרופי טרום נמתח

1. מערבבים 10: 1 פתרון של הבסיס סוכן ריפוי ויוצקים את התערובת לתוך צלחת בתרבית רקמה (12 ס"מ קוטר). השתמש 4,900 בסיס מ"ג ו -490 מ"ג סוכן ריפוי עבור תערובת crosslinking הכולל.
2. לשמור את תערובת ג'ל תחת ואקום במשך 20 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
3. מניחים את התערובת ג'ל בתנור ריפוי לילה בשעה 60 ° C.
4. לאחר מרפא קרום PDMS, לטיפול פני השטח עם פלזמה חמצן באמצעות מערכת ניקוי פלזמה / תחריט 3 דקות ב 165 mTorr ו -65 זרימת SCCM של O _2.
5. חותכים חתיכה של קרום מלבני (5 × 3.5 ס"מ) מצלחת, בעת היותו מודע באיזה צד הוא שטופלו בחמצן, לוודא בצד שטופלו חמצן הוא פונה כלפי מעלה ולתקן על מסגרת מתיחה. מניח את המסגרת על מתיחה הבמה למתוח באופן שווה על ידי סיבוב הכפתור על הבמה עד שהוא מגיע 10 התארכות% (או כמה למתוח שנקבע מראש אחרים; התארכות ניתן לקרוא ישירות מהבמה מתיחה) ב ⁹ ציר זמן ארוך יותר. תקן את המתיחה על ידי הידוק הברגים על המסגרת.
6. הסר את המסגרת מהבמה. ודא פני השטח קרום יבש ונקי אבק, ולאחר מכן למקם בתא סיליקון על הממברנה ומאפשר הצד הדביק של החדר לצרף בחוזקה הממברנה.
   הערה: תא סיליקון מספק גם עבור שמירה על המדיום הסלולרי על הממברנה PDMS. עיצוב המכשיר מוצג באיור 1.
7. לעקר את פני השטח עם UV למשך 10 דקות.
8. הוסף 1 מ"ל פולי- L- ליזין (PLL) (0.01% ב בופר פוספט) אל פני השטח PDMS בתוך החדר, בתוך 6 שעות של טיפול פלזמה דגירה במשך שעה 2 ב 37 ° C לפני זריעת נוירונים DRG. זה משפר מצורף תא.

le "> 2. בידוד של DRG

1. כן בינוני צמיחה סטנדרטי עבור נוירונים DRG.
2. לפני הבידוד, חיטוי ציוד בידוד מכשור לאספקת מים. הוסף 5 מ"ל של חיץ בידוד לתוך אחד טוב של צלחת 6-היטב, ומניחים את הצלחת על קרח. הכן 10 מ"ל של מדיום דיסוציאציה על ידי הוספת 1 מ"ל של collagenase (500 U / ml) עד 9 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA (1 מ"ג / מ"ל), לסנן הפתרונות עם מסנן 0.22 מיקרומטר ומניחים על קרח.
3. משתמש בו עשרה כדי שתים עשרה 5 - '7 ימים ישנות חולדות Sprague-Dawley עבור הבידוד. רסס את הגורים עם 75% isopropanol, ולהקריב על ידי עריפת ראש.
4. לחתוך את העור שמעל חוט השדרה מהחלק האחורי להסיר את כל רקמה עודפת סביב עמוד השדרה. תחת זכוכית מגדלת כירורגית עם האורות במקום כירורגית על, לבצע את החתך הראשון מהצוואר ואז חתך אחד לאורך עמוד השדרה משני הצדדים עם מספריים. לנתק את עמוד השדרה מהגוף של הגורים ולהסיר את השרירים העודפים. לאחר מכן, להשתמש במספריים לחתוך לאורך לוןציר גרם של פינצטה השדרה ושימוש כדי לפתוח את עמוד השדרה לגמרי ולחלץ את השדרה cord.Remove קצה מן פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר להעברת DRGs עם חיץ בידוד לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי.
5. באמצעות פינצטה בסדר, להסיר את גנגליון מכיס העצם ולאסוף כ -10 - 16 DRG משני הצדדים. חתוך את שורשי העצבים ולהעביר את הגרעינים למאגר בידוד קר כקרח.
6. הסר את טיפ פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר להעברת DRGs עם חיץ בידוד לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי. לאחר הניתוק הכימי, צנטריפוגה הגרעינים ב 900 XG ו -4 C ° למשך 5 דקות.
7. תנו רקמות ליישב לתחתית של התחתית ובעדינות להסיר את החיץ בידוד על גבי ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום דיסוציאציה לתוך הצינור.
8. דגירת הרקמות הגזורות במדיום דיסוציאציה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 תוך רעד הצינור כל 5 - 10 דקות.
9. לאחרהדיסוציאציה, צנטריפוגות כימיים הגרעינים ב 900 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
10. הסר את supernatant מחדש להשעות הגלולה ב 10 מיליליטר תקשורת צמיחה סטנדרטית מערבולת.
11. צנטריפוגה תאים ניתקו כמצוין בסעיף 2.9 שוב.
12. הסר את supernatant, מחדש להשעות הגלולה ב 12 מיליליטר של תקשורת מערבולת צמיחה הסטנדרטית.

3. תרבות של DRG על משטח טרום נמתח

1. לפני זריעת התאים, להסיר את פתרונות PLL מהאולם לשטוף את המשטח PDMS עם יבש מים ואוויר סטרילי.
2. לאחר בדיקה חוזרת של השעיית תאים, תיתן את הסט ההשעיה עבור 1 - 2 דקות, כדי לאפשר את הפסולת כדי ליישב לתחתית של התחתית. הוסף 1.5 מ"ל של תרחיף תאים לתוך תא למתוח לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
3. כדי לחסל ותאי גלייה, ב 1 יום במבחנה (DIV), להוסיף 10 μl (או 15 μl) תערובת של soluti המניות fluoro-2 deoxy-uridine ו uridine (FDU-U)על (ראה טבלה של חומרים) זה טוב. לאחר 7 שעות, להחליף בינוני עם מדיום גידול רגיל טרי מצמיד את התקן התרבות טרום נמתח באינקובטור 37 ° C עם 5% CO _2.
4. בתקופת תרבית תאים (2 - 3 שבועות), לשנות את התקשורת בכל יומיים על ידי החלפת מחצית בינונית בילה עם מדיום חדש. הערה: לאחר culturing על המשטחים נמתחים unstretched עבור 2 שבועות, גיל מטוהרים מתווספים הקאמרי בתרבית למשך שבוע נוסף (שלב 4.7).

4. משותף תרבות של תאי שוואן (SCS) עם DRG נוירונים על פני שטח טרום נמתחו

1. לבודד גיל כפי שתואר על ידי הקבוצה של ד"ר קמפנה בעבר ^15.
   1. בקצרה, לבודד את הגיל מאז שהיה גור קטן בן 1 יום. האיסוף לנתק את העצבים הנשה הוא כימי (טריפסין-EDTA ו- A Collagenase) מכאני (18 מחט מד / 10 מזרק מיליליטר) ^15.
   2. זרעי התאים ניתקו לתוך פולי- D- ליזין (PDL) במשותףבקבוק ותרבות T25 ated ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2. ביום 5, לטהר את התאים דרך בחירת נוגדנים באמצעות אנטי-עמך 1.1 נוגדן ארנב להשלים תת התאים המטוהרים למעבר 2 - 4. בינוני השתמש תרבות המכיל בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור עוברי (FBS) פניצילין, 1% / סטרפטומיצין (פן / סטרפטוקוקוס), 21 מיקרוגרם / מ"ל ​​שור יותרת המוח חלץ (BPE), ו -4 מיקרומטר Forskolin.
2. הסר בינוני תרבות מן גיל, ולהוסיף 5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ על 2 - 3 דקות.
3. בדוק התאים תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות המטרה 10X כדי לראות אם הם להרים מהבקבוק, ולאחר מכן להוסיף 5 מ"ל של מדיום תרבות ומערבבים עם התאים את הבקבוק.
4. מוסיפים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 200 ו -20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
5. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 7 מ"ל med צמיחה DRG תקןIA.
6. קח 10 μl של השעיה התא לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, לערבב עם 10 μl של trypan כחול, ולאחר מכן לספור את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות המטרה 10X. לדלל את השעית תא 5,000 תאים לכל מיליליטר ידי הוספת תקשורת צמיחת DRG.
7. הסר 0.5 מ"ל של מדיום מתרבות DRG בתא נמתח ולהוסיף 0.5 מ"ל של השעיה SC לתרבות DRG.
8. התרבות התאים במשך שבוע 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. שנה את התקשורת בכל יומיים על ידי החלפת מחצית בינונית בילה עם מדיום הגידול רגיל טרי DRG. לאחר 1 בשבוע שיתוף תרבות, תהליך התאים על ידי אימונוהיסטוכימיה ^10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מערכת תרבית תאים טרום נמתח קדמה יישור האקסון DRG ^10. נוירונים DRG היו בתרבית על משטחים מראש נמתח unstretched במשך 12 ימים. האקסונים היו מוכתמים עבור β-III טובולין להפגין יישור שלהם. איור 2 משווה אוריינטציה האקסון על מצעים PDMS מראש נמתח unstretched לאחר 12 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כדי לגרום יישור האקסון על משטח מראש נמתח, ישנם שני שלבים קריטיים: 1) קרום PDMS חייב להיות שטוח של עובי אחיד; ו -2) ותאי גלייה חייב יוסר DRG. לאחר ערבוב PDMS ו crosslinker וריפוי בתנור, הג'ל PDMS crosslinked צריך להישמר על גבי ספסל שטוח מטופל בזהירות כדי למנוע הטיה. טיפול פלזמת החמצן של קרום ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.