Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Zusammenfassung

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Zusammenfassung

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Einleitung

In Nervenverletzungen sind die proximalen und distalen Nervenstümpfe oft von der direkten Neuausrichtung Nervenfaszikel verhindert aufgrund der Läsionsstelle ^1-2. Normalerweise werden Axon Striche hoch geordnete und ausgerichtete Bündel von Axonen zusammen, die komplexe Netzwerke von Konnektivität bilden. Allerdings ist die Nervenregeneration ein chaotischer Prozess wegen schlecht organisiert Axon Ausrichtung ^3-4. Um daher eine ausreichende Anzahl von regenerierenden Axonen zu erzeugen, das der Läsionsstelle brücken, ist es notwendig, gut organisierte axonalen Ausrichtung zu induzieren. Darüber hinaus begleitet Demyelinisierung Nervenverletzungen durch Tod der myelinisierende Zellen an der Verletzungsstelle. Da Demyelinisierung stark beeinträchtigt die leitende Kapazität Axone zu überleben, Behandlungen Targeting Demyelinisierung oder Remyelinisierung fördern sind bedeutsam für die funktionelle Erholung nach einer Nervenverletzung ^5. So ist das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Engineering-Ansatz zu verdeutlichen, die diese beiden Fragen behandeltder Nervenregeneration.

Oberflächenanisotropie, die als Differenz definiert, wenn sie entlang verschiedenen Achsen gemessen, in einem Material der physikalischen oder mechanischen Eigenschaften, wurde angewendet Zellausrichtung zu beeinflussen, das Wachstum und die Migration ^6-7. Neben Topographie, gibt es andere Methoden Anisotropie zu induzieren. Bisher untersuchten wir Oberflächenanisotropie durch mechanische statische Vorstreckung von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Membran induziert. Die Theorie der "kleinen super Verformung auf großen auferlegt" vorausgesagt , daß die effektive Steifigkeit der Zellen in der gedehnten Richtung erfassen von der senkrechten Richtung abweicht, und diese Differenz der effektiven Steifigkeit aufgrund Anisotropie ⁸ an die Oberfläche. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) , kultiviert auf einem vorgedehnten PDMS - Membran können die Anisotropie zu erfassen , indem aktiv die Oberfläche gezogen und als Ergebnis, richten in der vorgedehnten Richtung ^9. In ähnlicher Weise eine anisotrope Oberflächen arising von einer mechanischen Oberflächenvorgedehnten wirkt sich auf die Ausrichtung, ¹⁰ Axone sowie das Wachstum und die Myelinisierung von dorsal root ganglion (DRG). Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion Oberflächenanisotropie auf einer statischen vorgedehnten PDMS Substrat ¹⁰ Axonregeneration zu verbessern.

Zu axon Ausrichtung, topologische Merkmale mit gewünschten Mustern hervorzurufen, berichtet Kontaktführung durch die ausgerichteten Fasern zu schaffen und Kanäle ^6,11-12 wurden nachgewiesen axon Ausrichtung ^11,13 erleichtern. Jedoch zum Induzieren axon Ausrichtung durch topologische Merkmale Techniken berichtet, wie Fasern, Kanäle und Strukturieren, waren nicht imstande, zu verlängern und um die Dicke der Axone erhöhen. Im Gegensatz dazu Reckung mechanischen graduellen zu axon Ausrichtung in Dehnungsrichtung geführt mit längeren und dickeren Axone , die mit der Größe der Dehnung ¹⁴ erhöht. Jedoch ist eine angetriebene Motor Vorrichtung in vivo nicht enthältmöglich. Im Gegensatz dazu ist statisch vorgedehnten induzierte Anisotropie weniger kompliziert und leichter in Zukunft Gerüst Entwürfe für in vivo - Anwendungen integriert werden können.

In diesem Protokoll wird eine statische vorgedehnten Zellkultursystem wird verwendet Oberflächenanisotropie ohne topologische Eigenschaften zu induzieren. Die vorgedehnten Kultursystem besteht aus einem PDMS-Membran zusammengesetzt ist, einem dehnbaren Rahmen und einer Streckstufe, wobei die Membran an dem Rahmen befestigt ist und eine vorbestimmte Strecke Größe auf der Streckstufe zugeführt wird. Frisch isolierte DRG auf der vorgedehnten Oberfläche kultivierten Neuronen für bis zu 21 Tage für axon Ausrichtung und Dicke überwacht. Anschließend Schwann-Zellen (SCs) co-kultiviert mit den ausgerichteten Axone werden Myelinisierung überwacht. Vorstreckung induzierte Oberflächenanisotropie Durch die Integration konnten wir Ausrichtung der Zellen-Differenzierung und Axon Ausrichtung Wachstum von MSCs und DRG - Neuronen ^9-10 bzw. zu verbessern.

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Protokoll

Alle Verfahren zur Isolierung der Zellen wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Michigan State University genehmigt.

1. Herstellung von vorgespannter anisotroper Oberfläche

1. Mischen Sie eine 10: 1-Lösung von Base und Härter und gießen Sie die Mischung in eine Gewebekulturschale (12 cm Durchmesser). Verwenden Sie 4.900 mg Base und 490 mg Mittel für die gesamte Vernetzungs Mischung härtet.
2. Halten Sie die Gelmischung unter Vakuum für 20 min Luftblasen zu entfernen.
3. Legen Sie das Gel-Gemisch in dem Ofen über Nacht Aushärtung bei 60 ° C.
4. Nachdem die Membran aushärtet PDMS, Behandlung der Oberfläche mit Sauerstoffplasma eine Plasmareinigung / Ätzsystem für 3 min bei 165 mTorr und 65 sccm Fluss von O ₂ verwendet wird .
5. Schneiden Sie ein Stück von rechteckigen Membran (5 × 3,5 cm) von der Schale, während bewusst zu sein, welche Seite mit Sauerstoff behandelt wird, stellen Sie sicher, dass der Sauerstoff behandelte Seite nach oben zeigt und fixieren auf einem Spannrahmen. Platzieren Sie den Rahmen auf ein durch Drehen des Knopfes auf der Bühne Streckstufe und gleichmäßig dehnen , bis sie 10% Dehnung erreicht (oder eine andere vorgegebene Strecke, kann die Dehnung direkt von der Streckstufe gelesen werden) in der längeren Achse ^9. Befestigen Sie die Strecke durch die Schrauben am Rahmen befestigen.
6. Entfernen Sie den Rahmen von der Bühne. Sicherstellen, dass die Membran-Oberfläche ist trocken und frei von Staub, legen Sie dann eine Silikonkammer auf die Membran der klebrigen Seite der Kammer können an die Membran zu befestigen fest.
   Hinweis: Die Silikon-Kammer bietet eine gut zum Halten des Zellmedium auf der PDMS-Membran. Die Vorrichtung ist in Abbildung 1 dargestellt.
7. Sterilisieren der Oberfläche mit UV für 10 min.
8. 1 ml Poly-L-lysin (PLL) (0,01% in phosphatgepufferter Salzlösung) mit der PDMS-Oberfläche innerhalb der Kammer, innerhalb von 6 Stunden der Plasmabehandlung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C, bevor die DRG Neurone Animpfen. Dies fördert die Zellhaftung.

le "> 2. Die Isolierung von DRG

1. Bereiten Sie Standard-Wachstumsmedium für die DRG-Neuronen.
2. Vor der Isolierung, autoklaviert die Isolations Ausrüstung und Filter Reagenzien. 5 ml Isolationspuffer in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, und legen Sie die Platte auf Eis. Herstellung von 10 ml der Dissoziation Medium durch 1 ml Kollagenase A Zugabe (500 U / ml) zu 9 ml von 0,05% Trypsin-EDTA (1 mg / ml), filtriert die Lösung mit einem 0,22 um-Filter und auf Eis.
3. Verwenden Sie zehn bis zwölf fähig 5 - 7 Tage alten Sprague-Dawley Ratten für die Isolierung. Sprühen Sie die Welpen mit 75% Isopropanol und opfern durch Enthauptung.
4. Schneiden Sie die Haut über dem Rückenmark von hinten weg und entfernen Sie das überschüssige Gewebe rund um die Wirbelsäule. Unter einem chirurgischen Lupe mit den chirurgischen Scheinwerfer auf, machen den ersten Schnitt aus dem Hals und dann ein Schnitt entlang der Wirbelsäule auf beiden Seiten mit einer Schere. Nehmen Sie die Wirbelsäule aus dem Körper der Welpen und die überschüssigen Muskeln zu entfernen. Dann mit einer Schere entlang der lon zu schneideng Achse der Wirbelsäule und mit Hilfe einer Pinzette die Wirbelsäule vollständig zu öffnen und das Rücken cord.Remove die Spitze aus einer Pipette extrahieren, um eine größere Öffnung für die Übertragung der DRGs mit Isolationspuffer in ein steriles 15 ml Tube.
5. Mit einem feinen Pinzette, entfernen Sie das Ganglion aus dem Knochentasche und sammeln etwa 10-16 DRG von beiden Seiten. Schneiden Sie die Nervenwurzeln und übertragen die Ganglien auf dem eiskalten Isolationspuffer.
6. Die Spitze aus einer Pipette eine größere Öffnung für die Übertragung der DRGs mit Isolationspuffer in ein steriles 15 ml Tube. Nach der chemischen Dissoziation Zentrifuge die ganglia bei 900 xg und 4 ° C für 5 min.
7. Lassen Sie das Gewebe an der Unterseite des Rohres absetzen und sanft den Isolationspuffer oben entfernen und 10 ml Dissoziation Medium in das Röhrchen hinzufügen.
8. Inkubieren Sie die sezierten Gewebe im Dissoziation Medium in einem Wasserbad 37 ° C 1 Stunde für während der Schlauch alle 5 Schütteln - mindestens 10.
9. Nachdie chemische Dissoziation, zentrifugieren Sie das ganglia bei 900 xg und 4 ° C für 5 min.
10. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Standardwachstumsmedien und Wirbel.
11. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen, wie in Abschnitt 2.9 noch einmal angezeigt.
12. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml Standardwachstumsmedien und Wirbel.

3. Kultur der DRG auf vorgespannter Fläche

1. Vor der Zellen Aussaat, die PLL-Lösungen aus der Kammer zu entfernen und die PDMS-Oberfläche mit sterilem Wasser und der Luft trocknen zu spülen.
2. Nachdem die Zellen wieder suspendiert, lassen Sie die Suspension Set mit 1 - 2 Minuten die Trümmer zu ermöglichen, auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. 1,5 ml der Zellsuspension in jede Streckkammer und Inkubieren bei 37 ° C bei 5% CO _2.
3. Gliazellen, die am 1. Tag in vitro (DIV), mit 10 & mgr; l (oder 15 & mgr; l) Mischung aus Fluor-2-deoxy Uridin und Uridin (FDU-U) Lager soluti Zur Beseitigungauf (siehe Tabelle der Materialien) zu gut jeder. Nach 7 Stunden, ersetzen Sie dieses Medium mit frischem Standardwachstumsmedium und legen Sie die vorgestreckten Kulturvorrichtung in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO _2.
4. Während der Zellkulturperiode (2 - 3 Wochen), ändern Sie die Medien alle zwei Tage um die Hälfte des verbrauchten Medium durch frisches Medium ersetzt. Anmerkung: Nach Kultivierung auf den gedehnten und ungedehnten Flächen für 2 Wochen, gereinigt SCs werden zu der Kammer und eine weitere Woche kultiviert (Schritt 4.7).

4. Co-Kultur von Schwann-Zellen (SC) mit DRG Neurone auf vorgespannter Fläche

1. Isolieren SCs wie von Dr. Campana Gruppe zuvor ¹⁵ beschrieben.
   1. Kurz gesagt, die SCs aus einem 1 Tage alten Welpen zu isolieren. Sammeln und die Ischiasnerven distanzieren sowohl chemisch (Trypsin-EDTA und Kollagenase A) und mechanisch (18 - Gauge - Nadel / 10 - ml - Spritze) ^15.
   2. Seed die dissoziierten Zellen in Poly-D-Lysin (PDL) coated T25 - Kolben und die Kultur bei 37 ° C bei 5% CO _2. Am 5. Tag reinigen die Zellen durch Antikörper Auswahl Anti-thy 1,1 Antikörper und Kaninchen-Complement verwenden und die gereinigten Zellen Passage 2 Subkultur - 4. Verwenden Kulturmedium, das Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 1% Penicillin / Streptomycin (Penn / Strep), 21 & mgr; g / ml Rinderhypophysenextrakt (BPE) und 4 & mgr; M Forskolin.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium aus der SCs und 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA in den Kolben. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C bei 5% CO ₂ für 2 - 3 min.
3. Überprüfen Zellen unter dem Lichtmikroskop ein 10X-Objektiv verwendet, um zu sehen, ob sie aus dem Kolben heben, fügen Sie dann 5 ml Kulturmedium und mischen sich mit den Zellen in den Kolben.
4. Fügen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 200 xg und 20 ° C für 5 min.
5. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 7 ml Standard-DRG Wachstum media.
6. Nehmen Sie sich 10 ul Zellsuspension in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mischen mit 10 ul Trypanblau und dann auf die Zellzahl bestimmen eine Hämozytometer unter der optischen Mikroskopie unter Verwendung eines 10X-Objektiv verwendet wird. Verdünne die Zellsuspension zu 5000 Zellen pro ml durch DRG Wachstumsmedium hinzugefügt wird.
7. Entfernen Sie 0,5 ml Medium aus der DRG-Kultur in der gestreckten Kammer und mit 0,5 ml SC Suspension auf die DRG-Kultur.
8. Kultur die Zellen für 1 Woche bei 37 ° C und 5% CO _2. Ändern Sie die Medien alle zwei Tage nach der DRG die Hälfte des verbrauchten Mediums mit frischem Standardwachstumsmedium ersetzt. Nach 1 Woche Co-Kultur, verarbeiten die Zellen durch Immunhistochemie ^10.

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Ergebnisse

Die vorgedehnten Zellkultursystem DRG axon Ausrichtung gefördert ^10. DRG-Neuronen wurden auf vorgestreckten und ungereckten Oberflächen für 12 Tage. Die Axone wurden für β-III-Tubulin gefärbt ihre Ausrichtung zu zeigen. 2 vergleicht axon Ausrichtung auf den vorgestreckten und ungestreckte PDMS Substrate nach 12 Tagen Kultur. Die DRG Axone parallel zur Streckrichtung ausgerichtet sind, während sie zufällige Ausrichtung zeigte und bildeten ein miteinande...

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Diskussion

Zur Induktion Axon Ausrichtung auf vorgedehnte Oberfläche gibt es zwei wichtige Schritte: 1) die PDMS-Membran muss flach sein und homogener Dicke; und 2) Gliazellen müssen aus dem DRG entfernt werden. Nach dem Mischen in einem Ofen die PDMS und Vernetzer und der Härtung sollte das vernetzte PDMS Gel sorgfältig ein Verkanten zu vermeiden, auf einer flachen Tischplatte und behandelt gehalten werden. Die Sauerstoffplasmabehandlung der PDMS Membran sollte innerhalb von 6 h von PLL-Beschichtung eingehalten werden, da die...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.