Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Resumo

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Resumo

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introdução

Em lesões nervosas, os cotos proximal e distal do nervo são muitas vezes impedidos de realinhamento direta dos fascículos nervosos devido ao local da lesão ^1-2. Normalmente, intervalos de axônios são compostos por feixes altamente ordenadas e alinhadas de axônios, que formam complexas redes de conectividade. No entanto, a regeneração do nervo é um processo caótico devido ao alinhamento axônio mal organizado ^3-4. Por isso, para gerar um número suficiente de regeneração de axónios que preenchem o local da lesão, é necessário para induzir o alinhamento axonal bem organizada. Além disso, a desmielinização acompanha lesões nervosas devido à morte das células mielinizantes no local da lesão. Desde desmielinização prejudica fortemente a capacidade condutora de sobreviver axônios, os tratamentos visam desmielinização ou promover remielinização são significativos para a recuperação funcional após a lesão do nervo ^5. Assim, o objetivo deste protocolo é para ilustrar uma abordagem de engenharia que aborda estas duas questõesda regeneração do nervo.

Anisotropia de superfície, que é definido como a diferença, quando medida ao longo de eixos diferentes, nas propriedades físicas ou mecânicas de um material, tem sido aplicado para influenciar alinhamento de células, o crescimento, a migração e ^6-7. Além de topografia, existem outros métodos para induzir a anisotropia. Anteriormente, foi investigada anisotropia superfície induzida por processos mecânicos de pré-alongamento estático de poli-dimetil-siloxano (PDMS) de membrana. A teoria da "Super pequena deformação imposta em grande" previu que a rigidez efectiva das células sentir na direcção esticada difere da direcção perpendicular, e esta diferença de rigidez efectiva é devido à superfície de anisotropia ^8. As células estaminais mesenquimais (MSCs) cultivadas numa membrana pré-esticado PDMS são capazes de detectar a anisotropia puxando de forma activa à superfície e, como resultado, alinham na direcção pré-esticado ^9. Da mesma forma, uma superfície AR anisotrópicaisinger a partir de uma superfície pré-esticado mecânica afeta o alinhamento, assim como o crescimento e a mielinização do gânglio da raiz dorsal (DRG) axônios ^10. Aqui nós fornecemos um protocolo para a indução de anisotropia de superfície sobre um substrato pré-estirado estática PDMS para melhorar a regeneração do axônio ^10.

Para obter o alinhamento axônio, características topológicas com padrões desejados, relatou para fornecer orientação contato através de fibras e canais ^6,11-12 alinhados, foram demonstrados para facilitar o alinhamento axônio ^11,13. No entanto, relataram técnicas para induzir alinhamento axónio através características topológicas, tais como fibras, e canais de modelação, não foram capazes de prolongar e aumentar a espessura dos axónios. Em contraste, gradual estiramento mecânico levou ao alinhamento axónio na direcção do estiramento, com axónios compridas e espessas, que aumentaram com a magnitude do troço ^14. No entanto, com dispositivo de motor movido in vivo não éfactível. Em contraste, anisotropia induzida pré-esticado estática é menos complicado e pode ser mais facilmente incorporados em futuros desenhos de andaime para aplicações in vivo.

Neste protocolo, um sistema de cultura de células pré-esticado estático é usado para induzir a anisotropia superfície sem características topológicas. O sistema de cultura de pré-esticado é constituído por uma membrana de PDMS, um quadro esticável e uma etapa de alongamento, após o que a membrana é fixada sobre a armação e um troço magnitude predeterminada é aplicada sobre a fase de alongamento. neurónios DRG isoladas de fresco de cultura na superfície pré-esticado por até 21 dias são monitorados para o alinhamento axónio e espessura. Posteriormente, as células de Schwann (SCs) co-cultivadas com os axônios alinhados são monitorados para a mielinização. Ao incorporar pré-estiramento induzido anisotropia superfície fomos capazes de aumentar a célula Alinhamento de diferenciação e axônio Alinhamento de crescimento de MSCs e neurônios DRG ^9-10, respectivamente.

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Protocolo

Todos os procedimentos para o isolamento das células foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual de Michigan.

1. Preparação de pré-esticado superfície anisotrópica

1. Misturar a 10: solução de base e um agente de cura e verter a mistura em um prato de cultura de tecidos (12 cm de diâmetro). Use 4,900 mg de base e 490 mg de agente de cura para a mistura total de reticulação.
2. Manter a mistura de gel sob vácuo durante 20 min para remover as bolhas de ar.
3. Coloque a mistura de gel no forno de cura durante a noite a 60 ° C.
4. Após a cura da membrana PDMS, tratar a superfície com plasma de oxigénio utilizando um sistema de limpeza / gravação por plasma durante 3 min a 165 mTorr 65 e fluxo sccm de _O2.
5. Corte um pedaço de membrana rectangular (5 × 3,5 cm) do prato, ao ser consciente de que lado é tratada com oxigênio, verifique se o lado tratado com oxigênio é voltado para cima e fixar em um quadro de alongamento. Coloque o quadro em uma alongamento fase e esticar uniformemente girando o botão na fase até atingir 10% de alongamento (ou algum outro extensível pré-determinado, o alongamento pode ser lida directamente a partir da fase de alongamento), em relação ao maior eixo ^9. Corrigir o estiramento, apertando os parafusos da moldura.
6. Retire a armação do palco. Certifique-se de superfície da membrana é seca e livre de poeira, em seguida, coloque uma câmara de silicone para a membrana permitindo que o lado adesivo da câmara para prender firmemente à membrana.
   Nota: A câmara de silicone fornece um poço para reter o meio de células na membrana de PDMS. O design do dispositivo é mostrado na Figura 1.
7. Esterilizar a superfície com UV durante 10 min.
8. Adicionar 1 ml de poli-L-lisina (PLL) (0,01% em tampão fosfato salino) para a superfície de PDMS no interior da câmara, dentro de seis horas de tratamento com plasma e incubar durante 2 horas a 37 ° C antes de semear os neurónios DRG. Isto aumenta a fixação das células.

le "> 2. Isolamento de DRG

1. Prepare meio de crescimento padrão para os neurônios do GRD.
2. Antes do isolamento, autoclave o equipamento e os reagentes de isolamento de filtro. Adicionar 5 ml de tampão de isolamento para um poço de uma placa de 6 poços, e colocar a placa em gelo. Preparar 10 ml de meio de dissociação por adição de 1 ml de colagenase A (500 U / ml) a 9 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (1 mg / ml), filtra-se as soluções com um filtro de 0,22 um e colocar em gelo.
3. Use dez a doze 5-7 velhos ratos Sprague-Dawley 'dias para o isolamento. Pulverize os filhotes com 75% isopropanol, e sacrifício por decapitação.
4. Cortar a pele que recobre a medula espinhal da parte de trás e remover qualquer excesso de tecido em torno da coluna. Sob uma lupa cirúrgica com as luzes do ponto cirúrgicos em, fazer a primeira incisão do pescoço e, em seguida, um corte ao longo da coluna em ambos os lados com uma tesoura. Retire a coluna vertebral do corpo dos filhotes e remover os músculos em excesso. Em seguida, use uma tesoura para cortar ao longo da long eixo da coluna vertebral e utilizar uma pinça para abrir completamente a coluna vertebral e extrair o cord.Remove a ponta de uma pipeta para criar uma abertura maior para a transferência de DRG com tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 ml.
5. Usando um belo par de pinças, retire o gânglio do bolso óssea e recolher cerca de 10-16 DRG de ambos os lados. Aparar as raizes nervosas e transferir os gânglios para o tampão de isolamento arrefecido em gelo.
6. Remover a ponta de uma pipeta para criar uma abertura maior para a transferência de DRG com tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 ml. Após a dissociação química, centrifugar a 900 xg em gânglios e 4 ° C durante 5 min.
7. Deixe os tecidos assentar no fundo do tubo suavemente e remover o tampão de isolamento na parte superior e adicionar 10 ml de meio de dissociação para dentro do tubo.
8. Incubar os tecidos dissecados no meio de dissociação, em um banho de água a 37 ° C durante 1 h enquanto se agita o tubo a cada 5-10 min.
9. Depois dea dissociação química, centrifugar a 900 xg em gânglios e 4 ° C durante 5 min.
10. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de crescimento standard e vortex.
11. Centrifugar as células dissociadas como indicado na secção 2.9, mais uma vez.
12. Remover o sobrenadante, re-suspender o sedimento em 12 ml de meio de crescimento standard e vortex.

3. Cultura do DRG na superfície pré-esticado

1. Antes de semear as células, as soluções remover PLL a partir da câmara e lavar a superfície de PDMS com água estéril e seca ao ar.
2. Depois de re-suspender as células, deixar que o conjunto de suspensão de 1 - 2 minutos para permitir que os detritos assentem no fundo do tubo. Adicionar 1,5 ml de suspensão de células em cada câmara de estiramento e incubar a 37 ° C em 5% de CO _2.
3. Para eliminar as células gliais, com 1 dia in vitro (DIV), adicionar 10 ul (ou 15 ul) de uma mistura de 2-fluoro-desoxi uridina e uridina (FDU-L) da solutiem (Ver Tabela de Materiais) para cada poço. Após 7 h, substituir este meio com meio de crescimento fresco padrão e colocar o dispositivo de cultura pré-esticado numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO _2.
4. Durante o período de cultura de células (2 - 3 semanas), alterar o suporte de dois em dois dias, substituindo metade do meio gasto com meio fresco. Nota: Após cultura nas superfícies estiradas e não estiradas de 2 semanas, SCs purificados são adicionados à câmara e cultivadas durante mais uma semana (fase 4.7).

4. Co-cultura de células de Schwann (SCS) com DRG neurônios na superfície pré-esticado

1. Isolar SCs como descrito por grupo previamente ¹⁵ do Dr. Campana.
   1. Resumidamente, isolar o SCs de um filhote de cachorro 1 dia de idade. Coletar e dissociar o nervo ciático tanto química (tripsina-EDTA e colagenase A) e mecanicamente (18 gauge agulha / seringa de 10 ml) ^15.
   2. Semear as células dissociadas em poli-D-lisina (PDL) coATED balão T25 e a cultura a 37 ° C em 5% de CO _2. No dia 5, purificar as células através de selecção de anticorpos utilizando anti-thy 1,1 de anticorpo e complemento de coelho e subcultura das células purificadas a passagem 2 - 4. média Utilização de cultura contendo de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), soro bovino fetal a 10% (FBS) , 1% de penicilina / estreptomicina (pen / Strep), 21 ug / ml de pituitária de bovino Extracto (BPE), e 4 | iM Forskolin.
2. Remover o meio de cultura a partir do SC, e adicionam-se 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para o balão. Incubar as células a 37 ° C em _CO2 5% durante 2-3 min.
3. Verificar as células ao microscópio óptico usando uma objectiva de 10X para ver se eles levantam a partir do frasco, em seguida, adicionam-se 5 ml de meio de cultura e misturar com as células do frasco.
4. Adicionar a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg e 20 ° C durante 5 min.
5. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 7 ml med crescimento DRG padrãoI a.
6. Tomar 10 ul de suspensão de células para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, misturar com 10 uL de azul de tripano, e depois contar o número de células utilizando um hemocitómetro sob microscopia óptica utilizando uma objectiva de 10X. Dilui-se a suspensão de células a 5000 células por ml pela adição de meio de crescimento DRG.
7. Retirar 0,5 mL de meio de cultura a partir do DRG na câmara esticada e adicionar 0,5 ml de suspensão de SC para a cultura de DRG.
8. Cultura as células durante 1 semana a 37 ° C e 5% de CO _2. Alterar os meios de comunicação a cada dois dias, substituindo metade do meio gasto com meio de crescimento padrão fresco para DRG. Após co-cultura uma semana, o processo as células por imuno-histoquímica ^10.

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Resultados

O sistema de cultura de células pré-esticado promovido DRG alinhamento ¹⁰ axónio. neurónios DRG foram cultivadas em superfícies pré-esticado e não estiradas durante 12 dias. Os axónios foram corados para β-III-tubulina para demonstrar o seu alinhamento. A Figura 2 compara a orientação axonal nas PDMS pré-esticado e não estiradas substratos após 12 dias de cultura. Os axónios DRG alinhados paralelamente à direcção esticada, enquanto que eles m...

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Discussão

Para induzir o alinhamento axónio na superfície pré-esticado, existem dois passos essenciais: 1) a membrana PDMS tem de ser plana e de espessura homogénea; e 2) células gliais deve ser removido a partir do DRG. Depois de misturar os PDMS e agente de reticulação e cura em um forno, o gel PDMS reticulado deve ser mantido no topo de uma bancada plana e manuseadas com cuidado para evitar qualquer inclinação. O tratamento com plasma de oxigénio da membrana PDMS deve ser seguido dentro de 6 horas por revestimento de...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.