Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны

Резюме

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Аннотация

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Введение

В нервных травм, проксимальный и дистальный нервные пни часто предотвращается прямой перестройкой нервных пучках из - за повреждения участка ^1-2. Обычно аксонов тракты состоят из упорядоченных и высоко выровненных пучков аксонов, которые образуют сложные сети связи. Тем не менее, регенерация нерва является хаотический процесс из - за плохо организованной выравнивании аксона ^3-4. Таким образом, чтобы генерировать достаточное количество регенерирующей аксоны, позволяющего устранить месте повреждения, то необходимо, чтобы побудить хорошо организованной аксонов выравнивания. Кроме того, демиелинизация сопровождает повреждения нерва из-за гибели myelinating клеток в месте повреждения. Так как демиелинизация сильно ухудшает проводящую способность выдерживать аксоны, процедуры , направленные на демиелинизации или способствующие ремиелинизацию являются существенными для функционального восстановления после повреждения нерва ^5. Таким образом, цель данного протокола, чтобы проиллюстрировать инженерный подход, учитывающий эти два вопросарегенерации нерва.

Поверхностная анизотропия, которая определяется как разница, при измерении вдоль различных осей, в физических или механических свойств материала , в, был применен влиять выравнивание клеток, рост и миграцию ^6-7. В дополнение к топографии, существуют и другие методы, чтобы индуцирующие анизотропию. Ранее мы исследовали поверхностной анизотропии, вызванной механическим статическим предварительной протяжения поли-диметил-силоксановых (PDMS) мембраны. Теория "малой деформации супер , наложенных на большой" предсказал , что эффективная жесткость клетки чувствуют в растянутом направлении отличается от перпендикулярного направления, и эта разница в эффективной жесткости из - за поверхностной анизотропии ^8. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , культивируемые на предварительно растянутой мембраны PDMS способны чувствовать анизотропию, активно вытягивать поверхность , и в результате, выравнивать в предварительно растянутой направлении ^9. Аналогичным образом, поверхность ар анизотропнаяизинговских от механического предварительно растянутой поверхности влияет на выравнивание, а также роста и миелинизации спинномозговых ганглиев (DRG) аксонов ^10. Здесь мы приводим протокол для индукции поверхностной анизотропии на статическом предварительно растянутой подложке PDMS для повышения аксонов регенерации ^10.

Для того, чтобы вызвать выравнивание аксонов, топологические особенности с заданными узорами, сообщает предоставить контактную руководство через выровненных волокон и каналов ^6,11-12, были продемонстрированы для облегчения выравнивания аксонов ^11,13. Тем не менее, сообщалось методы индукции выравнивания аксонов через топологических характеристик, таких как волокна, каналы и структурирование, были неспособны удлиняться и увеличить толщину аксонов. В противоположность этому , постепенное механическое растяжение привело к выравниванию аксонов в направлении растягивания с более длинными и более толстыми аксонами , которые увеличились с величиной перегоне ^14. Тем не менее, включение устройства с независимым питанием двигателя в естественных условиях не являетсяпредставляется возможным. В противоположность этому , статическое предварительно растянутой наведенной анизотропии менее сложна и может быть более легко включены в будущие конструкции каркаса для применения в естественных условиях.

В этом протоколе, статический предварительно растянутой система клеточной культуры используется для индукции поверхностной анизотропии без топологических характеристик. Предварительно растянутая система культуры состоит из мембраны PDMS, поддающегося растягиванию рамой и простирающейся стадии, после чего мембрана закреплена на раме, а заданная величина растянуть применяется на стадии вытяжки. Свежевыделенные нейроны DRG культивировали на предварительно растянутой поверхности на срок до 21 дней, отслеживаются для выравнивания и толщины аксона. Впоследствии Шванн клетки (SCS) культивировали совместно с унифицированным аксонов контролируются на миелинизации. Объединив предварительно простирания индуцированной поверхностной анизотропии мы смогли улучшить ячейки выравнивания дифференциации и аксона выравнивания роста MSCs и DRG нейронов ^9-10, соответственно.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры для выделения клеток были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете штата Мичиган по.

1. Приготовление предварительно растянутой поверхности анизотропного

1. Смешайте 10: раствор основы и отвердителя 1 и вылить смесь в блюдо культуры ткани (диаметром 12 см). С помощью 4900 мг основы и 490 мг отвердителя для общей сшивающего смеси.
2. Смесь необходимо хранить гель в вакууме в течение 20 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха.
3. Поместите смесь геля в печи в течение ночи отверждения при 60 ° C.
4. После того, как мембраны лечений PDMS, обработать поверхность с кислородной плазмой с помощью системы очистки / плазменного травления в течение 3 мин при 165 мТорр и 65 куб.см при СТД потока O _2.
5. Отрежьте кусок прямоугольной мембраны (5 × 3,5 см) от тарелки, в то же время осознавая, какая сторона представляет собой кислород обращению, убедитесь, что кислород обработанной стороной вверх и крепятся на пялец. Поместите рамку на растягивая сцену и равномерно растянуть поворотом ручки на сцене , пока не достигнет 10% удлинения (или какой - либо другой предварительно определенное растяжение, удлинение может быть непосредственно считаны из стадии вытяжки) в длинной оси ^9. Закрепите растяжку, затянув винты на раме.
6. Снимите раму со сцены. Убедитесь, что поверхность мембраны сухой и свободной от пыли, а затем поместить силиконовую камеру на мембрану, позволяя липкой стороне камеры, чтобы плотно прикрепить к мембране.
   Примечание: силиконовая камера обеспечивает хорошо для удерживания среды клеток на мембране PDMS. Конструкция устройства показана на рисунке 1.
7. Стерилизовать поверхность с УФ в течение 10 мин.
8. Добавить 1 мл поли-L-лизин (ФАПЧ) (0,01% в фосфатно-солевом буферном) на поверхности PDMS внутри камеры, в течение 6 ч плазменной обработки и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С перед посевом нейроны DRG. Это усиливает прикрепление клеток.

ле "> 2. Выделение DRG

1. Подготовить стандартную ростовую среду для нейронов DRG.
2. До изоляции, автоклава изоляции оборудования и фильтров реагентов. Добавляют 5 мл буфера изоляции в одну лунку 6-луночного планшета, и поместите тарелку на льду. Приготовьте 10 мл среды диссоциации путем добавления 1 мл коллагеназы А (500 Ед / мл) до 9 мл 0,05% трипсин-ЭДТА (1 мг / мл), фильтрации растворов с фильтром и место 0,22 мкм на льду.
3. Используйте десять-двенадцать 5 - 7 старых крыс Sprague-Dawley суток за изоляции. Спрей щенкам с 75% изопропилового спирта, и принести в жертву путем обезглавливания.
4. Срежьте кожу, перекрывающую спинной мозг со спины и удалите излишки ткани вокруг позвоночника. Под хирургической лупу с хирургическими местная подсветка на, сделать первый надрез от шеи, а затем один разрез вдоль позвоночника с обеих сторон с помощью ножниц. Отделить позвоночник от тела щенкам и удалить избыток мышц. Затем, используйте ножницы, чтобы разрезать вдоль долготуг оси позвоночника и использовать пинцет, чтобы полностью открыть позвоночник и извлечь спинного cord.Remove наконечник из пипетки, чтобы создать большее отверстие для передачи ДРГ с буфером изоляции в стерильный 15 мл пробирку.
5. С помощью тонкой пинцет, удалите ганглий из костного кармана и собирают примерно 10 - 16 DRG с обеих сторон. Обрежьте корни нерва и передать ганглиев в ледяном буфере изоляции.
6. Извлеките наконечник из пипетки, чтобы создать большее открытие для передачи ДРГ с буфером изоляции в стерильный 15 мл пробирку. После химической диссоциации, центрифуга ганглии при 900 х г и 4 ° С в течение 5 мин.
7. Пусть ткани оседают на дно пробирки и осторожно удалите буфер изоляции на верхней и добавляют 10 мл раствора диссоциации среды в трубу.
8. Инкубируйте рассеченные ткани в среде диссоциации в водяной бане C 37 ° в течение 1 ч при встряхивании трубки через каждые 5 - 10 мин.
9. Послехимическая диссоциация, центрифуга ганглии при 900 х г и 4 ° С в течение 5 мин.
10. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 10 мл стандартных сред и вихревыми.
11. Центрифуга диссоциированных клеток, как указано в разделе 2.9 еще раз.
12. Удалить супернатант, повторно приостанавливать осадок в 12 мл стандартных сред роста и вихря.

3. Культура DRG по предварительно растянутой поверхности

1. Перед посевом клеток, удалить растворы ФАПЧ из камеры и промыть поверхность PDMS стерильной водой и сухой воздух.
2. После повторного суспендирования клеток, пусть множество подвески в течение 1 - 2 мин, чтобы позволить мусор оседают на дно пробирки. Добавить 1,5 мл суспензии клеток в каждую натяжного камеру и инкубировать при 37 ° С в 5% CO _2.
3. Для устранения глиальных клеток, на 1 день в пробирке (DIV), добавьте 10 мкл (или 15 мкл) смесь фтор-2-дезокси уридин и уридин (FDU-U) акций Soluti(смотрите таблицу материалов) в каждую лунку. Через 7 ч, заменить эту среду со свежей стандартной ростовой среды и поместить предварительно растянутой устройство культура в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO _2.
4. В течение периода культивирования клеток (2 - 3 недели), изменения среды каждые два дня, заменив половину затрачиваемое среды свежей средой. Примечание: После культивирования на растянутых и растяжений поверхности в течение 2 недель, очищенный Стволовые добавляют в камеру и культивировали в течение следующей недели (этап 4.7).

4. Совместное культивирование клеток Шванн (SCS) с DRG нейронах по предварительно растянутой поверхности

1. Изолировать SCs , как описано группой доктора Кампана в ранее ^15.
   1. Если коротко, то изолировать ГКС от 1-дневного возраста детеныша. Сбор и диссоциируют седалищный нервы как химически (трипсин-ЭДТА и коллагеназы A) и механически (18 калибра иглы / 10 мл шприц) ^15.
   2. Семя разложенных клеток в поли-D-лизина (PDL) соованные Т25 колбу и культуры при 37 ° С в 5% CO _2. На 5-й день, очищают клетки путем отбора антител с использованием анти-Thy 1.1 антител и кроличий комплемент и субкультуры очищенные клетки к прохождению 2 - 4. С помощью культуральной среды, содержащей Дульбекко модифицированную Дульбекко (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) , 1% пенициллин / стрептомицин (Пенна / Стрептококковое), 21 мкг / мл бычьего гипофизарный экстракт (BPE), и 4 мкМ форсколин.
2. Удалить культуральную среду, из ГКС, и добавляют 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в колбу. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО ₂ в течение 2 - 3 мин.
3. Проверьте клетки под оптическим микроскопом с использованием объектива 10х, чтобы увидеть, если они поднимают вверх из колбы, затем добавляют 5 мл культуральной среды и смешивают с клетками в колбе.
4. Добавить суспензии клеток в центрифужные пробирки объемом 15 мл и центрифугируют при 200g и 20 ° С в течение 5 мин.
5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 7 мл стандарт DRG медианы ростаНМА.
6. Взять 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужных пробирку емкостью 0,5 мл, смешивают с 10 мкл трипанового синего, а затем подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра при оптической микроскопии с использованием объектива 10х. Развести клеточной суспензии до 5000 клеток на мл путем добавления питательной среды DRG.
7. Удалить 0,5 мл среды от DRG культуры в растянутом камере и добавляют 0,5 мл суспензии SC в DRG культуры.
8. Культуры клеток в течение 1 недели при 37 ° С и 5% СО _2. Изменение средств массовой информации каждые два дня, заменив половину истощенной средой со свежей стандартной питательной среды для DRG. После 1 недели совместного культивирования, процесс клетки с помощью иммуногистохимии ^10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Система предварительно растянутой культуры клеток способствует DRG выравнивание аксонов ^10. DRG нейроны культивировали на предварительно растянутой и растяжений поверхности в течение 12 дней. Аксоны окрашивали для бета-III-тубулина , чтобы продемонстрировать их выр...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Для того, чтобы побудить аксонов выравнивание по предварительно растянутой поверхности, есть два важных шага: 1) мембрана PDMS должна быть ровной и гомогенной толщины; и 2) глиальные клетки должны быть удалены из DRG. После смешивания PDMS и сшивателя и отверждения в печи, сшитый гель PDMS должны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.