Une approche pour améliorer l'alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Résumé

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Résumé

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

Dans les lésions nerveuses, les proximale et distale nerveuses souches sont souvent empêchés de réalignement direct des faisceaux nerveux en raison du site de la lésion ^1-2. Normalement, les secteurs de l'axone sont composés de faisceaux hautement ordonnés et alignés d'axones qui forment des réseaux complexes de connectivité. Cependant, la régénération nerveuse est un processus chaotique due à l' alignement de l' axone mal organisé ^3-4. Par conséquent, afin de générer un nombre suffisant de régénération d'axones qui relient le site de la lésion, il est nécessaire d'induire un alignement axonale bien organisé. En outre, la démyélinisation accompagne les lésions nerveuses dues à la mort des cellules myélinisantes au site de la lésion. Depuis démyélinisation affecte fortement la capacité conductrice des axones survivants, traitements ciblant la démyélinisation ou la promotion de la remyélinisation sont importantes pour la récupération fonctionnelle après lésion du nerf ^5. Ainsi, l'objectif de ce protocole est d'illustrer une approche d'ingénierie qui répond à ces deux questionsde la régénération nerveuse.

Anisotropie de surface, qui est définie comme une différence, lorsqu'elle est mesurée le long d' axes différents, des propriétés physiques ou mécaniques d'un matériau, a été appliqué pour influencer l' alignement des cellules, la croissance et la migration ^6-7. En plus de la topographie, il existe d'autres méthodes pour induire une anisotropie. Auparavant, nous avons étudié l'anisotropie de surface induite par mécanique pré-étirement statique de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) membrane. La théorie de la "petite super déformation imposée sur une grande" prédit que la rigidité effective des cellules détectent dans le sens étiré diffère de la direction perpendiculaire, et cette différence de rigidité effective est due à la surface anisotropie ^8. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur une membrane PDMS pré-étiré sont capables de détecter l'anisotropie en tirant sur ​​la surface active et en conséquence, d' aligner la direction pré-étiré ^9. De même, une surface ar anisotropiqueising à partir d' une surface pré-étiré mécanique affecte l'alignement, ainsi que la croissance et la myélinisation du ganglion de la racine dorsale (DRG) axones ^10. Ici , nous fournissons un protocole destiné à induire une anisotropie de surface sur un substrat pré-étiré statique PDMS pour améliorer la régénération axonale ^10.

Pour obtenir l' alignement des axones, des caractéristiques topologiques avec des motifs souhaités, rapporté à fournir des conseils de contact à travers des fibres et des canaux ^6,11-12 alignés, ont été démontrées pour faciliter l' alignement des axones ^11,13. Cependant, les techniques permettant d'induire un alignement des axones par les caractéristiques topologiques, telles que des fibres, des canaux et des motifs rapportés, ont été incapables d'allonger et d'augmenter l'épaisseur des axones. En revanche, progressive étirage mécanique a conduit à l' alignement des axones dans la direction d'étirement avec axones longs et plus épais que l' augmentation de l'amplitude du tronçon ^14. Cependant, incorporant un dispositif de moteur alimenté in vivo est pasfaisable. En revanche, statique anisotropie induite pré-étiré est moins compliqué et peut être plus facilement incorporé dans les futures conceptions d'échafaudage pour des applications in vivo.

Dans ce protocole, un système de culture de cellules pré-étiré statique est utilisé pour induire une anisotropie de surface sans caractéristiques topologiques. Le système de culture pré-étiré est constitué d'une membrane PDMS, un cadre extensible et un étage d'étirage, après quoi la membrane est fixée sur le châssis et un tronçon de grandeur prédéterminée est appliquée à l'étape d'étirage. neurones DRG fraîchement isolées en culture sur la surface pré-étiré jusqu'à 21 jours sont contrôlés pour l'alignement et de l'épaisseur axone. Par la suite, les cellules de Schwann (SC) co-cultivées avec les axones alignés sont surveillés pour la myélinisation. En incorporant de pré-étirement induite surface anisotropie , nous avons pu améliorer la cellule alignement différenciation et axone alignement de croissance des cellules souches mésenchymateuses et les neurones DRG ^9-10, respectivement.

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Protocole

Toutes les procédures pour l'isolement des cellules ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à Michigan State University.

1. Préparation des pré-étiré Surface anisotrope

1. Mélanger 10: 1 solution de base et l'agent de durcissement et de verser le mélange dans une boîte de culture tissulaire (12 cm de diamètre). Utilisez 4,900 mg de base et 490 mg d'agent de durcissement pour le mélange de réticulation totale.
2. Maintenir le mélange de gel sous vide pendant 20 minutes pour éliminer les bulles d'air.
3. Placer le mélange de gel dans le four pour un durcissement pendant une nuit à 60 ° C.
4. Après les cures de membrane PDMS, traiter la surface avec un plasma d'oxygène à l' aide d' un système de nettoyage / de gravure par plasma pendant 3 min à 165 mTorr et 65 flux de sccm d'O _2.
5. Coupez un morceau de membrane rectangulaire (5 x 3,5 cm) de l'antenne, tout en étant conscient de quel côté est l'oxygène traité, assurez-vous du côté de l'oxygène traité est orientée vers le haut et le fixer sur un cadre d'étirage. Placez le cadre sur un étirement scène et étirer uniformément en tournant le bouton sur la scène jusqu'à ce qu'il atteigne 10% d' allongement (ou d' un autre tronçon prédéterminé; l'allongement peut être lue directement à partir du stade d' étirage) dans l'axe plus ^9. Fixer le tronçon en serrant les vis sur le cadre.
6. Retirez le cadre de la scène. Vérifiez que la surface de la membrane est sèche et exempte de poussière, puis placer une chambre de silicone sur la membrane permettant le côté collant de la chambre d'attacher solidement à la membrane.
   Remarque: La chambre de silicone fournit un puits pour retenir le milieu de cellules sur la membrane PDMS. La conception du dispositif est représenté sur la figure 1.
7. Stériliser la surface avec des UV pendant 10 min.
8. Ajouter 1 ml de poly-L-lysine (PLL) (0,01% dans un tampon phosphate salin) à la surface du PDMS intérieur de la chambre, dans les 6 heures de traitement par plasma et laisser incuber pendant 2 heures à 37 ° C avant l'ensemencement des neurones DRG. Cela améliore la fixation des cellules.

Le "> 2. Isolement des DRG

1. Préparer un milieu de croissance standard pour les neurones DRG.
2. Préalablement à l'isolement, dans un autoclave de l'équipement et des réactifs d'isolement de filtre. Ajouter 5 ml de tampon d'isolement dans un puits d'une plaque à 6 puits, et placez la plaque sur la glace. Préparer 10 ml de milieu de dissociation en ajoutant 1 ml de collagénase A (500 U / ml) à 9 ml de 0,05% de trypsine-EDTA (1 mg / ml), on filtre la solution avec un filtre 0,22 pm et placer sur de la glace.
3. Utiliser dix à douze 5-7 rats Sprague-Dawley "jours pour l'isolement. Vaporiser les chiots avec 75% d'isopropanol, et le sacrifice par décapitation.
4. Coupez la peau recouvrant la moelle épinière de l'arrière et retirez tout excès de tissu autour de la colonne vertébrale. Sous une loupe chirurgicale avec les lumières de tache chirurgicales sur, faire la première incision du cou, puis une coupe le long de la colonne vertébrale sur les deux côtés avec des ciseaux. Détachez la colonne vertébrale du corps des chiots et enlever l'excès de muscles. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le long de la long axe de la colonne vertébrale et de l'utilisation des pinces pour ouvrir la colonne vertébrale complètement et extraire la moelle cord.Remove la pointe d'une pipette pour créer une plus grande ouverture pour transférer les DRG avec un tampon d'isolement dans un tube de 15 ml stérile.
5. L'utilisation d'une belle paire de pinces à épiler, retirez le ganglion de la poche de l'os et de recueillir environ 10 - 16 DRG des deux côtés. Couper les racines nerveuses et transférer les noyaux dans le tampon d'isolement glacée.
6. Retirer la pointe d'une pipette pour créer une plus grande ouverture pour transférer les DRG avec un tampon d'isolement dans un tube de 15 ml stérile. Après la dissociation chimique, centrifuger les ganglions à 900 x g et 4 ° C pendant 5 min.
7. Laissez les tissus se déposent au fond du tube et retirez délicatement le tampon d'isolement sur le dessus et ajouter 10 ml de milieu de dissociation dans le tube.
8. Incuber les tissus disséqués dans le milieu de dissociation dans un bain d'eau à 37 ° pendant 1 heure en agitant le tube tous les 5 - 10 min.
9. Aprèsla dissociation chimique, centrifuger les ganglions à 900 x g et 4 ° C pendant 5 min.
10. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de médias de croissance standard et vortex.
11. Centrifuger les cellules dissociées comme indiqué à la section 2.9 une fois de plus.
12. Retirer le surnageant, remettre en suspension le culot dans 12 ml de milieu de croissance standard et vortex.

3. Culture de DRG sur la surface pré-étiré

1. Avant l'ensemencement des cellules, enlever les solutions PLL de la chambre et rincer la surface de PDMS avec de l'eau stérile et l'air sec.
2. Après remise en suspension des cellules, laisser l'ensemble de la suspension pendant 1 - 2 min pour permettre aux débris de se déposer au fond du tube. Ajouter 1,5 ml de suspension cellulaire dans chaque chambre d'étirage et incuber à 37 ° C sous 5% de CO _2.
3. Pour éliminer les cellules gliales, à 1 jour in vitro (DIV), ajouter 10 pi (ou 15 pi) mélange de fluoro-2 désoxy-uridine et uridine (FDU-U) Stock solutisur (Voir le tableau des matériaux) dans chaque puits. Après 7 heures, remplacer ce milieu avec un milieu de croissance standard frais et placer le dispositif de culture pré-étiré dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2.
4. Au cours de la période de culture cellulaire (2 - 3 semaines), changer les médias tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu usé avec du milieu frais. Nota: Après culture sur les surfaces tendus et détendus pendant 2 semaines, SCs purifiés sont ajoutés à la chambre et mises en culture pendant une semaine (étape 4.7).

4. Co-culture de cellules de Schwann (SC) avec DRG Neurones sur la surface pré-étiré

1. Isoler SCs tel que décrit par le groupe du Dr Campana ¹⁵ auparavant.
   1. En bref, isoler le SCs d'un vieux chiot 1 jour. Recueillir et dissocier les nerfs sciatiques à la fois chimiquement (trypsine-EDTA et collagénase A) et mécaniquement (18 aiguille de calibre / 10 ml seringue) ^15.
   2. Ensemencer les cellules dissociées en poly-D-lysine (PDL) coATED flacon T25 et à la culture à 37 ° C sous 5% de CO _2. Le jour 5, purifier les cellules grâce à la sélection d'anticorps en utilisant Anti-thy 1.1 anticorps et complément de lapin et de sous-culture les cellules purifiées au passage 2 - 4. moyen Utilisation de culture contenant du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM), 10% de sérum bovin fœtal (FBS) , 1% de pénicilline / streptomycine (Penn / Strep), 21 pg / ml Extrait pituitaire bovin (BPE) et 4 uM forskoline.
2. Retirer le milieu de culture à partir de la CS et ajouter 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA dans le ballon. Incuber les cellules à 37 ° C sous 5% de _CO2 pendant 2-3 min.
3. Vérifiez les cellules au microscope optique en utilisant un objectif 10X pour voir si elles élèvent du flacon, puis ajouter 5 ml de milieu de culture et mélanger avec les cellules dans le flacon.
4. Ajouter la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et on centrifuge à 200 x g et à 20 ° C pendant 5 min.
5. Retirer le surnageant et resuspendre le culot dans 7 ml de med de croissance DRG normeia.
6. Prendre 10 pl de suspension cellulaire dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation, mélanger avec 10 pi de bleu trypan, puis compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre en microscopie optique en utilisant un objectif 10X. Diluer la suspension cellulaire 5.000 cellules par ml par addition de milieu de croissance DRG.
7. Retirer 0,5 ml de milieu de la culture DRG dans la chambre étirée et ajouter 0,5 ml de SC suspension à la culture de DRG.
8. Culture des cellules pendant 1 semaine à 37 ° C et 5% de CO _2. Changer les médias tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu usé avec un milieu de croissance standard frais pour DRG. Après 1 semaine de co-culture, processus , les cellules par immunohistochimie ^10.

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Résultats

Le système de culture de cellules pré-étiré promu l' alignement de l' axone ¹⁰ DRG. neurones DRG ont été cultivées sur des surfaces pré-étirées et non étirées pendant 12 jours. Les axones ont été colorées pour β-III-tubuline pour démontrer leur alignement. La figure 2 compare l' orientation des axones sur les PDMS pré-étirées et non étirées substrats après 12 jours de culture. Les axones DRG alignés parallèlement à la dire...

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Discussion

Pour induire l'alignement axone sur la surface pré-étiré, il y a deux étapes essentielles: 1) la membrane PDMS doit être plat et d'épaisseur homogène; et 2) les cellules gliales doivent être retirés de la DRG. Après le mélange des PDMS et réticulant et le durcissement dans un four, le gel de PDMS réticulé doit être conservé sur un dessus de banc plat et manipulé avec précaution pour éviter tout basculement. Le traitement par plasma d'oxygène de la membrane PDMS doit être suivie dans les ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.