במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Summary

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Abstract

במחזור (של תא-חינם) מיקרו-רנ"א (miRNAs) משתחררים מתאי לתוך זרם הדם. סכום של מיקרו-רנ"א ספציפי במחזור נקשר למצב המחלה ויש לו פוטנציאל לשמש סמן ביולוגי למחלה. שיטה רגישה ומדויקת עבור מחזורי כימות microRNA באמצעות כימיה מבוססת לצבוע צַחצוֹחִית טכנולוגית PCR דיגיטלית פותחה לאחרונה. באופן ספציפי, באמצעות נעול חומצות גרעין (LNA) מבוססות פריימרים ספציפי מירנה עם צבע DNA מחייבת פלואורסצנטי ירוק במערכת PCR דיגיטלית תואמת אגל אפשר להשיג כימות המוחלטת של miRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים כיצד לבצע בטכניקה זו כדי להעריך כמות מירנה נוזלים ביולוגיים, כגון פלזמה ו בסרום, הוא גם ריאלי אפקטיבי.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) are released into blood circulation by potentially all the cells of the organism, as a consequence of active release or necrotic and apoptotic processes. Cell-free miRNAs have been detected in the bloodstream either as free stable molecules or linked to lipoproteins or enveloped inside exosomes and microvesicles ^1-3. They are believed to function as cell-to-cell communicators ⁴, and their amount changes in the presence of cancer, cardiac disorders or autoimmune diseases ^5-7. Their accurate and reproducible quantification is the basis for their evaluation as disease biomarkers. However, for several reasons already described elsewhere ^8,9, miRNA quantification in serum or plasma, as well as other body fluids, could be very challenging ^10,11. We recently developed a method for the absolute quantification of circulating miRNAs, based on miRNA-specific LNA primers and DNA-binding dye droplet digital PCR (ddPCR) technology ¹². This methodology has been applied to the validation of miRNA breast cancer biomarkers ^13,14.

After the partitioning of each reverse-transcribed miRNA molecule inside a nanoliter-sized droplet, it is possible to count the copy number of each miRNA in each sample, basically counting the number of green, and therefore positive, fluorescent droplets. As soon as a PCR reaction occurs, a positive count is achieved, without the need to establish a standard curve or taking PCR efficiency into account in target amount calculation, as it happens with quantitative RT-PCR (RT-qPCR). In addition, ddPCR proved to be more sensitive and accurate than RT-qPCR in circulating miRNA quantification ¹⁵. In this article we present the detailed protocol of this methodology, discussing the most relevant steps andspecifically considering serum and plasma clinical samples.

Protocol

בידוד MicroRNA מ פלזמה או סרום

הערה: פלזמה והכנה בסרום הוא צעד רלוונטי במחזור כימות מירנה. לא מקיים הליך מועדף עבור פלזמה והכנה בסרום. הדבר היחיד שחשוב לקחת בחשבון הוא כי כל הדגימות מאותו הניסוי חייבות להיות מעובד באמצעות העבודה בדיוק. התחל 200 μl בסרום או פלזמה. RNA סה"כ יכול להיות מבודד סרום או פלזמה באמצעות ערכות זמינות מסחרי.

1. ניתוק פרוטוקול RNA (כולל מירנה)

1. דגימות סרום / פלזמה להפשיר על הקרח.
2. הוסף 1 מ"ל של מגיב תמוגה (למשל., QIAzol) 200 μl בסרום / פלזמה.
3. מערבבים על ידי vortexing ומניחים את שפופרת המכילה את homogenate על הספסל ב RT במשך 5 דקות.
4. הוסף 3 μl של פתרון 4.16 ננומטר של cel-miR-39-3p מירנה הסינטטי ג elegans.
5. הוסף 200 μl של כלורופורם. לנער את הצינור במרץ למשך 15 שניות. ה מקוםצינור דואר על הספסל ב RT במשך 2 דקות.
6. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C כדי להשיג הפרדת שלבים: השלב מהימי העליון מכיל RNA.
7. מעביר את השלב המימי לצינור חדש, כ -700 μl, למנוע העברה של כל חומר ביניים לבן.
8. הוסף 1 מ"ל של 100% אתנול ומערבבים על ידי היפוך.
9. Pipet למעלה 700 μl של המדגם לתוך עמוד ספין מיני דגש על צינור איסוף 2 מ"ל. סגור את המכסה צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך.
10. חזור על שלב זה באמצעות המדגם הנותר.
11. הוסף 700 μl מאגר RWT לעמודת הספין המיני, לסגור את המכסה ו צנטריפוגות במשך 15 שניות ב XG 12,000 לשטוף את העמודה. מחק את הזרימה דרך.
12. Pipet 500 μl הצפת רשתית לתוך טור הספין המיני. סגור את המכסה ו צנטריפוגות במשך 15 שניות ב -12,000 סל"ד. מחק את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו שוב.
13. צנטריפוגה עמודת הספין המינית במלוא מהירות למשך 2 דקות כדי לייבש את טור הספיןקרום מ אתנול שיורית.
14. מעביר את טור הספין המיני לצינור 1.5 מיליליטר אוסף חדש ומי RNase ללא pipet 35 μl על הממברנה של הטור.
15. צנטריפוגה 1 דקות ב XG 12,000 כדי elute רנ"א.
16. אחסן את RNA ב -80 ° C.
    הערה: מאז ריכוז RNA לא ניתן לקבוע במדויק, משתמשים באמצעי אחסון קבוע כאמצעי עבור סכום קלט.

2. שעתוק לאחור MicroRNA

1. להפשיר את השעתוק לאחור תערובת מגיבה (RT) מרכיבים: חיץ תגובת 5x, nuclease ללא מים. מערבבים בעדינות היפוך הצינורות ומניחים על קרח. מיד לפני השימוש, להסיר את תמהיל האנזים מהמקפיא ומניחים על קרח. ספין למטה כל חומרים כימיים.
2. מכינים את תערובת מגיב RT על הקרח כמתואר בטבלה 1. הכן לפחות לערבב 10% מעבר.
3. מערבבים את התגובה על ידי pipetting, ולאחר מכן ספין למטה.
4. דגירה של 60 דקות ב 42 ג.
5. מחממים להשבית reverse transcriptase במשך 5 דקות ב 95 ג.
6. מיד לצנן עד 4 מעלות צלזיוס.
7. אחסן את cDNA ב -20 ° C.

3. cDNA דילול

1. לדלל את כמות תבנית cDNA דרושי תגובות ddPCR המתוכננות במים חינם nuclease. לדלל את התגובה cDNA בין 01:50 ו -1: 500 במים, תלוי שפע מירנה היעד. אחסן את cDNA מדולל ב -20 ° C. את cDNA בדילול הוכיח להיות יציב במשך 3 חודשים לפחות ב -20 ° C.

דור אגל 4. PCR

הערה: דור אגל צריך להתבצע ב -8 דגימות בכל פעם. משכפל טכני אינו נדרש, בשל השחזור הגבוה של טכנולוגיה זו ^12,15 .א אין שליטת תבנית (NTC) מדגם צריך לרוץ בכל צלחת עבור כל תנאי ddPCR שונים.

1. להפשיר לאזן את תערובת מאסטר (למשל., מיקס מאסטר EvaGreen), סט פריימר microRNA ו cDNA ב RT.
2. מערבבים את ה מיקס מאסטרoroughly על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. ספין למטה כל חומרים כימיים.
3. מכינים את תערובת ddPCR כמתואר בטבלה 2. כאשר התגובות ddPCR מרובים מבוצעות, להכין ddPCR לערבב-פתרון עובד. הכן לפחות 10% בתמהיל יעלה.
4. לאחר ההרכבה, ומערבבים היטב ומסובב תמהיל ddPCR.
5. לוותר 12 μl של ddPCR לערבב לתוך צלחת 96-היטב PCR או צינורות PCR.
6. הוסף 8 μl של תבנית cDNA מדולל על צינור אחד / היטב.
7. הכנס את המחסנית גנרטור אגל לתוך מחזיק.
8. העביר 20 μl של כל דגימה מוכנה בארות המדגם (בשורה אמצעית) של מחסנית גנרטור אגל בזהירות תוך הימנעות בועות אוויר בתחתית הבאר.
9. ממלאים כל באר נפט (בשורה התחתונה) עם 70 μl של שמן גנרטור רביב.
10. הוק אטם על בעל מחסנית ולהכניס לתוך הגנרטור רביב.
11. סגור את המכסה כדי להתחיל דור אגל על ​​פי יחסי הציבור של היצרןotocol. כאשר דור אגל סיים, לפתוח את המכסה, הסר את האטם הפנוי. הבארות העליונות של המחסנית להכיל את הטיפין.
12. Pipet לאט חלקה 40 μl של התוכן שמונה הבארות העליונות (הטיפין) לתוך עמודה אחת של צלחת 96-היטב PCR.
13. חותם את הצלחת PCR ברדיד מיד לאחר העברת טיפות כדי למנוע אידוי. השתמש חותמות צלחת רדיד לנקבה התואמות את המחטים בקורא רביב.
14. בגין רכיבת תרמית (PCR) בתוך 30 דקות של איטום הצלחת.
15. בצע את פרוטוקול האופניים לפי טבלה 3.

5. קריאה אגל

1. כוח על הקורא רביב.
2. הזז את הצלחת מן Cycler התרמית לקורא רביב.
3. מניחים את הצלחת ה- PCR 96-היטב המכיל את טיפות שלאחר PCR לתוך הבסיס של בעל צלחת.
4. הנח את החלק העליון של בעל צלחת על צלחת PCR. קש הוא לשוניות השחרור היטבמטה כדי לאבטח את הצלחת ה- PCR במחזיק.
5. הפעל את התוכנה ממחשב המערכת.
   1. לחץ על הגדרה כדי להגדיר את הניסוי (כימותים מוחלטים) ולאחר מכן לחץ על הפעל כדי להתחיל בקריאת רביב.
   2. כאשר קריאת האגל הושלמה, לחץ על "נתח" כפתור כדי לפתוח ולנתח את הנתונים.
   3. השתמש העלילה משרעת 2D בתוכנת הניתוח כדי לבחור את הטיפין החיוביות (כלי הלאסו) (איור 1 ב).
   4. השתמש בכרטיסיית האירועים כדי לבדוק את מספר טיפות חיוביות ומוחלטות. מספר כולל של 18,000 - 21,000 טיפות מושג בדרך כלל עם probeless ddPCR.
   5. לאחר הטיפין החיוביות נבחרות, לייצא את ערכי ריכוז מירנה באמצעות אפשרות .csv היצוא מכרטיסיית הריכוז.

תוצאות

הסכום המוחלט של miRNAs ספציפי לכל מיליליטר של פלזמה או בסרום ניתן לקבוע באמצעות צבע DNA מחייבת ניאון ירוק אַגְלִיל הטכנולוגיה PCR דיגיטלי. איור 1 מציג את התהליך של סלקציה חיובית-טיפות, אשר קובע את הריכוז מירנה הסופי (עותקים / μl ) ב תגובת ההגברה מחו?...

Discussion

miRNAs במחזור הנוכחים בדם בריכוזים נמוכים מאוד וכמות רנ"א שיכול להיות מופקת דגימות פלזמת בדם היא נמוכה. מסיבה זו, הם קשה לכמת עם טכניקות אחרות כגון microarray וסדר RNA. יתר על כן, קיימת חוסר כללי של הסכם על נורמליזצית נתונים ואת הנוכחות של miRNAs "ייחוס" אנדוגני בדם. בהקשר ז?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx and 2100000-21xxxxx	Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator	BioRad	186-4002	Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader	BioRad	186-4003	Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer	BioRad	181-4000	Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets	BioRad	186-4008	Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye	BioRad	186-4005	Oil for droplet generation