Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

Résumé

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Résumé

Circulant (des sans cellules) microARN (miARN) sont libérés à partir de cellules dans le flux sanguin. La quantité de micro-ARN spécifique dans la circulation a été liée à un état pathologique et a le potentiel pour être utilisé en tant que marqueur biologique de la maladie. Une méthode sensible et précis pour la circulation microRNA quantification en utilisant une chimie à base de colorants et des gouttelettes de la technologie PCR numérique a été récemment mis au point. Plus précisément, à l'aide Locked Nucleic Acid (LNA) à base d'amorces spécifiques de miARN avec un colorant fluorescent de liaison à l'ADN vert dans un système de PCR compatible avec des gouttelettes numérique, il est possible d'obtenir la quantification absolue des miARN spécifiques. Ici, nous décrivons comment effectuer cette technique pour évaluer le montant de miARN dans les liquides biologiques, tels que le plasma et le sérum, est à la fois faisable et efficace.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) are released into blood circulation by potentially all the cells of the organism, as a consequence of active release or necrotic and apoptotic processes. Cell-free miRNAs have been detected in the bloodstream either as free stable molecules or linked to lipoproteins or enveloped inside exosomes and microvesicles ^1-3. They are believed to function as cell-to-cell communicators ⁴, and their amount changes in the presence of cancer, cardiac disorders or autoimmune diseases ^5-7. Their accurate and reproducible quantification is the basis for their evaluation as disease biomarkers. However, for several reasons already described elsewhere ^8,9, miRNA quantification in serum or plasma, as well as other body fluids, could be very challenging ^10,11. We recently developed a method for the absolute quantification of circulating miRNAs, based on miRNA-specific LNA primers and DNA-binding dye droplet digital PCR (ddPCR) technology ¹². This methodology has been applied to the validation of miRNA breast cancer biomarkers ^13,14.

After the partitioning of each reverse-transcribed miRNA molecule inside a nanoliter-sized droplet, it is possible to count the copy number of each miRNA in each sample, basically counting the number of green, and therefore positive, fluorescent droplets. As soon as a PCR reaction occurs, a positive count is achieved, without the need to establish a standard curve or taking PCR efficiency into account in target amount calculation, as it happens with quantitative RT-PCR (RT-qPCR). In addition, ddPCR proved to be more sensitive and accurate than RT-qPCR in circulating miRNA quantification ¹⁵. In this article we present the detailed protocol of this methodology, discussing the most relevant steps andspecifically considering serum and plasma clinical samples.

Protocole

MicroARN Isolation du plasma ou du sérum

Remarque: Le plasma et la préparation de sérum est une étape pertinente dans la circulation miRNA quantification. Il n'y a pas de procédure préférée pour le plasma et la préparation du sérum. La seule chose importante à considérer est que tous les échantillons de la même expérience doivent être traitées en utilisant exactement le même workflow. À partir de sérum de 200 pi ou de plasma. L'ARN total peut être isolé à partir de sérum ou de plasma en utilisant des kits disponibles dans le commerce.

1. Protocole pour l'ARN total (y compris miRNA) Isolation

1. des échantillons de sérum / plasma Décongeler sur la glace.
2. Ajouter 1 ml de réactif de lyse (par ex., QIAzol) à 200 ul de sérum / plasma.
3. Mélanger par tourbillonnement et placer le tube contenant le broyat sur le banc à température ambiante pendant 5 min.
4. Ajouter 3 ul d'une solution nM 4.16 du miRNA cel-miR-39-3p synthétique de C. elegans.
5. Ajouter 200 ul de chloroforme. Agiter vigoureusement le tube pendant 15 sec. La place etube e sur le banc à température ambiante pendant 2 min.
6. Centrifuger pendant 15 min à 12 000 xg à 4 ° C pour obtenir la séparation des phases: la phase aqueuse supérieure contenant l'ARN.
7. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, environ 700 ul, éviter tout transfert de matériel d'interphase blanche.
8. Ajouter 1 ml d'éthanol à 100% et mélanger par retournement.
9. Pipeter jusqu'à 700 ul de l'échantillon dans une colonne de centrifugation de mini placée sur un tube collecteur de 2 ml. Fermer le couvercle et centrifuge à 12.000 xg pendant 15 sec. Jeter l'écoulement.
10. Répétez cette étape en utilisant l'échantillon restant.
11. Ajouter 700 ul de tampon RWT à la colonne de spin mini fermer le couvercle et centrifuger pendant 15 secondes à 12.000 xg pour laver la colonne. Jeter l'écoulement.
12. Pipet 500 ul de tampon RPE dans la colonne de spin Mini. Fermer le couvercle et centrifuger pendant 15 secondes à 12000 rpm. Jeter l'écoulement. Répétez cette étape.
13. Centrifuger la colonne de spin mini-à pleine vitesse pendant 2 minutes pour sécher la colonne de spinune membrane à partir d'éthanol résiduel.
14. Transférer la colonne spin mini-à un nouveau tube de 1,5 ml de collecte et de l'eau libre de RNase-pipette 35 ul sur la membrane de la colonne.
15. Centrifuger pendant 1 min à 12 000 xg pour éluer l'ARN.
16. Stocker l'ARN à -80 ° C.
    Remarque: Comme la concentration d'ARN ne peut pas être déterminée avec précision, utiliser des volumes fixes comme une mesure de quantité d'entrée.

2. microARN Reverse Transcription

1. Décongeler la transcription inverse (RT) des composants réactifs de mélange: 5x tampon de réaction, de l'eau sans nucléase. Mix retournant doucement les tubes et les placer sur la glace. Immédiatement avant utilisation, retirer le mélange d'enzymes du congélateur et placer sur de la glace. Isoler tous les réactifs.
2. Préparer le mélange de réactifs RT sur la glace comme décrit dans le tableau 1. Préparer au moins 10% supérieure à mélange.
3. Mélanger la réaction par pipetage, puis tourner vers le bas.
4. Incuber pendant 60 min à 42 ° C.
5. Heat-inactiver le reverse transcriptase pendant 5 min à 95 ° C.
6. Immédiatement refroidir à 4 ° C.
7. Stocker l'ADNc à -20 ° C.

3. ADNc Dilution

1. Diluer la quantité d'ADNc modèle nécessaire pour les réactions ddPCR prévues dans l'eau sans nucléase. Diluer la réaction d'ADNc entre 1:50 et 1: 500 dans l'eau, en fonction de la cible miARN abondance. Stocker l'ADNc dilué à -20 ° C. L'ADNc dilué avéré être stable pendant au moins 3 mois à -20 ° C.

4. Génération et Gouttelette PCR

Remarque: la génération de gouttelettes doit être effectuée sur 8 échantillons à la fois. Réplicats techniques ne sont pas nécessaires, en raison de la grande reproductibilité de cette technologie ^12,15 .Un contrôle sans matrice (NTC) échantillon doit être exécuté dans chaque plaque et pour chaque condition de ddPCR différente.

1. Décongeler et équilibrer le mélange maître (par ex., EvaGreen Master Mix), microRNA ensemble d' amorces et d' ADNc à la température ambiante.
2. Mélanger le th Master Mixoroughly en renversant le tube plusieurs fois. Isoler tous les réactifs.
3. Préparer le mélange ddPCR comme décrit dans le tableau 2. Lorsque plusieurs réactions ddPCR sont effectuées, préparer un ddPCR mélanger travail-solution. Préparer au moins 10% supérieure à mélange.
4. Une fois assemblé, bien mélanger et centrifuger le mélange ddPCR.
5. Distribuer 12 pi de ddPCR mélanger dans un 96 puits plaque PCR ou tubes PCR.
6. Ajouter 8 pi de matrice d'ADNc dilué dans chaque tube / puits.
7. Insérer la cartouche de générateur de gouttelettes dans le support.
8. Transférer 20 pl de chaque échantillon préparé dans les puits d'échantillon (ligne médiane) de la cartouche du générateur de gouttelettes avec précaution, tout en évitant les bulles d'air au fond du puits.
9. Remplir chaque puits de pétrole (rangée du bas) avec 70 pi d'huile générateur de gouttelettes.
10. Accrocher le joint sur le support de cartouche et l'insérer dans le générateur de gouttelettes.
11. Fermez le couvercle pour lancer la génération de gouttelettes selon la pr fabricantotocole. Lorsque la génération des gouttelettes est terminée, ouvrir le couvercle, retirer le joint jetable. Les premiers puits de la cartouche contiennent des gouttelettes.
12. Pipet lentement et en douceur 40 pl du contenu des puits supérieurs huit (les gouttelettes) dans une seule colonne d'une plaque à 96 puits PCR.
13. Sceller la plaque PCR avec une feuille immédiatement après le transfert de gouttelettes pour éviter l'évaporation. Utiliser les joints d'étanchéité perforable plaque d'aluminium qui sont compatibles avec les aiguilles dans le lecteur de gouttelettes.
14. Commencez le cycle thermique (PCR) dans les 30 min de la plaque d'étanchéité.
15. Effectuer le protocole de cyclisme selon le tableau 3.

5. Droplet Reading

1. Allumez le lecteur de gouttelettes.
2. Déplacer la plaque par rapport au cycleur thermique pour le lecteur de gouttelettes.
3. Placer la plaque PCR 96 puits contenant les gouttelettes post-PCR dans la base du support de plaque.
4. Placer la partie supérieure du support de plaque sur la plaque de PCR. Appuyez fermement sur les deux pattes de dégagementvers le bas pour fixer la plaque de PCR dans le support.
5. Démarrez le logiciel du système PC.
   1. Cliquez sur Configuration pour définir l'expérience (quantification absolue) puis cliquez sur Exécuter pour démarrer la lecture des gouttelettes.
   2. Lorsque gouttelette lecture est terminée, cliquez sur "Analyser" bouton pour ouvrir et analyser les données.
   3. Utilisez le tracé d'amplitude 2D dans le logiciel d'analyse pour sélectionner les gouttelettes positives (outil Lasso) (Figure 1B).
   4. Utilisez l'onglet Événements pour vérifier le nombre de gouttelettes positifs et totaux. Un nombre total de 18.000 - 21.000 gouttelettes est habituellement réalisé avec ddPCR sans sonde.
   5. Une fois que les gouttelettes positives sont sélectionnées, exporter les valeurs de concentration miRNA en utilisant l'option de l'exportation à partir de l'onglet Concentration.

Résultats

La quantité absolue de miARN spécifiques par ml de plasma ou le sérum peut être déterminée en utilisant un colorant fluorescent de liaison à l' ADN vert et des gouttelettes de la technologie de PCR numérique. La figure 1 présente le processus de sélection-gouttelettes positif, ce qui détermine la concentration finale miRNA (copies / ul ) dans la réaction d'amplification calculée par le logiciel d'analyse. Le montant de chaque miARN dans le sang e...

Discussion

miARN circulantes sont présents dans le sang à des concentrations extrêmement faibles et la quantité d'ARN qui peut être extrait à partir d'échantillons de plasma et de sérum est faible. Pour cette raison, il est difficile de quantifier avec d'autres techniques telles que la puce à ADN et le séquençage de l'ARN. De plus, il y a un manque généralisé d'accord sur la normalisation des données et la présence de miARN "de référence" endogènes dans le sang. Dans ce contexte, un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx and 2100000-21xxxxx	Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator	BioRad	186-4002	Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader	BioRad	186-4003	Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer	BioRad	181-4000	Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets	BioRad	186-4008	Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye	BioRad	186-4005	Oil for droplet generation