Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

Riepilogo

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Abstract

Di circolazione (di cell-free) microRNA (miRNA) vengono rilasciati dalle cellule nel flusso sanguigno. La quantità di microRNA specifici in circolazione è stato collegato a uno stato di malattia e ha il potenziale per essere utilizzato come biomarker della malattia. Un metodo sensibile e preciso per circolazione microRNA quantificazione utilizzando una chimica a base di colorante e di gocce tecnologia PCR digitale è stato recentemente sviluppato. In particolare, utilizzando Locked Nucleic Acid (LNA) a base di primer specifici miRNA con un colorante legante il DNA fluorescente verde in un sistema PCR compatibile gocciolina digitale, è possibile avere la quantificazione assoluta di miRNA specifici. Qui, descriviamo come l'esecuzione di questa tecnica per valutare la quantità di miRNA nei fluidi biologici, come il plasma e il siero, è sia fattibile ed efficace.

Introduzione

MicroRNAs (miRNAs) are released into blood circulation by potentially all the cells of the organism, as a consequence of active release or necrotic and apoptotic processes. Cell-free miRNAs have been detected in the bloodstream either as free stable molecules or linked to lipoproteins or enveloped inside exosomes and microvesicles ^1-3. They are believed to function as cell-to-cell communicators ⁴, and their amount changes in the presence of cancer, cardiac disorders or autoimmune diseases ^5-7. Their accurate and reproducible quantification is the basis for their evaluation as disease biomarkers. However, for several reasons already described elsewhere ^8,9, miRNA quantification in serum or plasma, as well as other body fluids, could be very challenging ^10,11. We recently developed a method for the absolute quantification of circulating miRNAs, based on miRNA-specific LNA primers and DNA-binding dye droplet digital PCR (ddPCR) technology ¹². This methodology has been applied to the validation of miRNA breast cancer biomarkers ^13,14.

After the partitioning of each reverse-transcribed miRNA molecule inside a nanoliter-sized droplet, it is possible to count the copy number of each miRNA in each sample, basically counting the number of green, and therefore positive, fluorescent droplets. As soon as a PCR reaction occurs, a positive count is achieved, without the need to establish a standard curve or taking PCR efficiency into account in target amount calculation, as it happens with quantitative RT-PCR (RT-qPCR). In addition, ddPCR proved to be more sensitive and accurate than RT-qPCR in circulating miRNA quantification ¹⁵. In this article we present the detailed protocol of this methodology, discussing the most relevant steps andspecifically considering serum and plasma clinical samples.

Protocollo

MicroRNA Isolamento da plasma o siero

Nota: Plasma e la preparazione del siero è un passo rilevante in circolazione miRNA quantificazione. Non esiste una procedura preferita per il plasma e preparazione del siero. L'unica cosa importante da considerare è che tutti i campioni dello stesso esperimento devono essere elaborati usando esattamente lo stesso flusso di lavoro. Inizia dal siero 200 ml o plasma. RNA totale può essere isolato dal siero o plasma utilizzando kit disponibili in commercio.

1. Protocollo per RNA totale (compresi i miRNA) Isolamento

1. campioni di siero / plasma Scongelare su ghiaccio.
2. Aggiungere 1 ml di Reagente di Lisi (ad es., QIAzol) a 200 ml di siero / plasma.
3. Mescolare nel vortex e posizionare il tubo contenente l'omogeneizzato in panchina a temperatura ambiente per 5 min.
4. Aggiungere 3 ml di una soluzione 4.16 nM del sintetico miRNA cel-miR-39-3p da C. elegans.
5. Aggiungere 200 ml di cloroformio. Agitare la provetta con forza per 15 sec. ° postoe tubo in panchina a temperatura ambiente per 2 minuti.
6. Centrifugare per 15 min a 12.000 xga 4 ° C per ottenere la separazione fasi: la fase acquosa superiore contiene RNA.
7. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta, circa 700 ml, evitare il trasferimento di qualsiasi materiale interfase bianco.
8. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100% e miscelare per inversione.
9. Pipettare su 700 ml di campione in una colonna di mini rotazione collocato su un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a 12.000 xg per 15 sec. Gettare il flow-through.
10. Ripetere questa operazione con il campione rimanente.
11. Aggiungere 700 microlitri di buffer RWT alla colonna mini rotazione, chiudere il coperchio e centrifugare per 15 secondi a 12.000 xg per lavare la colonna. Gettare il flow-through.
12. Dispensare 500 microlitri Buffer RPE nella colonna mini rotazione. Chiudere il coperchio e centrifugare per 15 sec a 12.000 rpm. Gettare il flow-through. Ripetere questo passaggio.
13. Centrifugare la colonna di spin mini a tutta velocità per 2 minuti per asciugare la colonna di spinmembrana da etanolo residuo.
14. Trasferire la colonna mini centrifuga in una nuova provetta da 1,5 ml raccolta e acqua priva di RNasi pipetta 35 microlitri sulla membrana della colonna.
15. Centrifugare per 1 min a 12.000 xg per eluire l'RNA.
16. Conservare l'RNA a -80 ° C.
    Nota: Dal momento che la concentrazione di RNA non può essere determinata con precisione, utilizzare volumi fissi come misura per la quantità di input.

2. MicroRNA trascrizione inversa

1. Scongelare la trascrizione inversa (RT) Componenti miscela reagente: tampone di reazione 5x, acqua priva di nucleasi. Mescolare capovolgendo delicatamente i tubi e posto sul ghiaccio. Immediatamente prima dell'uso, rimuovere la miscela enzimatica dal congelatore e disporli sul ghiaccio. Spin giù tutti i reagenti.
2. Preparare la miscela reagente RT su ghiaccio come descritto nella Tabella 1. Preparare almeno il 10% della miscela superiore.
3. Mescolare la reazione pipettando, e poi spin down.
4. Incubare per 60 min a 42 ° C.
5. Heat-inattivare i reverSE trascrittasi per 5 minuti a 95 ° C.
6. Immediatamente raffreddare a 4 ° C.
7. Conservare il cDNA a -20 ° C.

3. cDNA diluizione

1. Diluire la quantità di cDNA necessari per le reazioni ddPCR previste in acqua priva di nucleasi. Diluire la reazione cDNA tra 1:50 e 1: 500 in acqua, a seconda bersaglio miRNA abbondanza. Conservare il cDNA diluito a -20 ° C. Il cDNA diluito dimostrato di essere stabile per almeno 3 mesi a -20 ° C.

4. Droplet generazione e PCR

Nota: generazione gocciolina deve essere eseguita su 8 campioni per volta. Repliche tecniche non sono tenuti, a causa della elevata riproducibilità di questa tecnologia ^12,15 .A No Control Template (NTC) campione deve essere eseguito in ogni piatto e per ogni diversa condizione ddPCR.

1. Scongelare ed equilibrare il mix master (ad es., EvaGreen Master Mix), microRNA Primer set e cDNA a temperatura ambiente.
2. Mescolare il Master Mix °oroughly invertendo la provetta diverse volte. Spin giù tutti i reagenti.
3. Preparare il mix ddPCR come descritto nella Tabella 2. Quando si eseguono più reazioni ddPCR, preparano una ddPCR mix di lavoro-soluzione. Preparare almeno il 10% superiore a miscela.
4. Una volta assemblato, mescolare bene e spin down mix ddPCR.
5. Dispensare 12 ml di ddPCR mescolano in un pozzo-96 piastra PCR o provette PCR.
6. Aggiungere 8 ml di cDNA diluito in ogni provetta / bene.
7. Inserire la cartuccia generatore di gocce nel supporto.
8. Trasferire 20 microlitri di ciascun campione preparato ai pozzetti del campione (fila centrale) della cartuccia generatore gocciolina accuratamente evitando bolle d'aria nella parte inferiore del pozzo.
9. Riempire ogni pozzo di petrolio (riga in basso) con 70 ml di olio di generatore di goccioline.
10. Agganciare la guarnizione sopra il supporto della cartuccia e inserire nel generatore di goccioline.
11. Chiudere il coperchio per avviare la generazione delle gocce in base al pr del produttoreotocol. Quando la generazione delle gocce è terminata, aprire il coperchio, rimuovere la guarnizione usa e getta. I primi pozzetti della cartuccia contengono le goccioline.
12. Pipettare lentamente ed uniformemente 40 ml di contenuto degli otto migliori pozzetti (le goccioline) in un'unica colonna di una piastra a 96 pozzetti PCR.
13. Sigillare la piastra PCR con un foglio subito dopo il trasferimento gocce per evitare l'evaporazione. Utilizzare piastra del foil perforabili che sono compatibili con gli aghi nel lettore gocciolina.
14. Iniziare cicli termici (PCR) entro 30 minuti dalla chiusura ermetica del piatto.
15. Eseguire il protocollo di ciclismo secondo la Tabella 3.

5. Droplet Reading

1. Accendere il lettore goccia.
2. Spostare la piastra dal termociclatore al lettore goccia.
3. Posizionare la piastra a 96 pozzetti PCR contenente le goccioline post-PCR nella base del supporto piastra.
4. Posizionare la parte superiore del portatarga sulla piastra PCR. Premere con forza entrambe le linguette di rilascioper fissare la piastra PCR nel supporto.
5. Avviare il software dal PC sistema.
   1. Fare clic su Imposta per definire l'esperimento (quantificazione assoluta) quindi fare clic su Esegui per avviare la lettura delle gocce.
   2. Quando la lettura delle gocce è completo, fare clic sul pulsante per aprire e analizzare i dati "Analizza".
   3. Utilizzare la trama di ampiezza 2D nel software di analisi per selezionare le goccioline positivi (lazo) (Figura 1B).
   4. Utilizzare la scheda Eventi per verificare il numero di goccioline positivi e totali. Un totale di 18.000 - 21.000 goccioline è di solito realizzato con senza sonda ddPCR.
   5. Una volta che le goccioline positivi sono selezionati, esportare i valori di concentrazione miRNA utilizzando l'opzione di esportazione CSV dalla scheda di concentramento.

Risultati

La quantità assoluta di miRNA specifici per ml di plasma o siero può essere determinato utilizzando un colorante legame al DNA fluorescente verde e di gocce tecnologia PCR digitale. La figura 1 mostra il processo di selezione positiva-goccioline, che determina la concentrazione finale miRNA (copie / ml ) nella reazione di amplificazione calcolata dal software di analisi. L'importo di ciascuna miRNA nel sangue è molto diversa, essendo alcune specie miRNA più abbon...

Discussione

miRNA circolanti sono presenti nel sangue a concentrazioni estremamente basse e la quantità di RNA che può essere estratto da campioni di plasma e siero è basso. Per questo motivo, sono difficili da quantificare con altre tecniche come microarray e RNA sequencing. Inoltre, vi è una generalizzata mancanza di accordo sulla normalizzazione dei dati e la presenza di endogene miRNA "di riferimento" nel sangue. In questo contesto, una tecnologia sensibile come gocciolina PCR digitale, in grado di contare il nume...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx and 2100000-21xxxxx	Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator	BioRad	186-4002	Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader	BioRad	186-4003	Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer	BioRad	181-4000	Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets	BioRad	186-4008	Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye	BioRad	186-4005	Oil for droplet generation