פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Summary

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Abstract

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Introduction

כרגע הצבת תאים בודדים בנפרד בחלל תרבות מושגת בדרך כלל באמצעות דילול מגביל או תא מופעל קרינת מיון (FACS). למעבדות רבות, הגבלת דילול היא שיטה נוחה, כמו זה רק דורש צלחות תרבות פיפטה ורקמות, אשר זמינות. במקרה זה, השעית תא הוא מדולל סדרתי צפיפות תאים מתאימה, ולאחר מכן להציב לתוך בארות תרבות באמצעות פיפטה ידנית. תאים בודדים המחולקים אלה משמשים לניתוח תא, כגון מגוון גנטי הקרנת היווצרות ¹ ו מושבת ^2. עם זאת, שיטה זו היא נמוכה תפוקה ועבודה אינטנסיבית, ללא ניצול זרוע רובוטית עבור סיוע, כי טבעו התפלגות פואסון של שיטת הדילול המגבילה מגביל אירועים-תא בודד כדי הסתברות מקסימלית של 37% ^3. מכונית FACS עם זרוע רובוטית משולבת יכול להתגבר על המגבלה של התפלגות פואסון ידי במדויק Placing מתא בודד אחד בתרבות היטב בכל פעם ^4. עם זאת, לחץ הגזירה המכאני הגבוה (ובכך, הוריד כדאיויות תא) ⁵ ורכישת מכונית ועלויות תפעול מוגבלות השימוש שלה במעבדות רבות.

כדי להתגבר על המגבלות לעיל, התקנים microscale פותחו כדי מאוד ביעילות לטעון תאים בודדים לתוך microwells ^6. עם זאת, microwells אינו מספק מרחב מספיק עבור התאים הטעונים להתרבות, בשל הצורך של עשייה את הגודל של כל microwell קרוב לזה של תא בודד כדי להגביר את סיכוי טעינת תא הבודד. כמו מבחני תרבות נדרשים ביישומים רבים מבוסס תאים (למשל, clonogenic assay ^7), microwells הגדול (מ 90 - 650 מיקרומטר בקוטר או באורך צד) גם כבר נוצל כדי לאפשר בתרביות תאים מורחבות. עם זאת, כמו שיטת הדילול המגבילה, הם גם בעלי יעילות טעינת תא בודדת נמוכה, הנעים בין 10 -. 30% ⁸, 9

בעבר, פיתחנו פלטפורמה microfluidic תפוקה גבוהה לבודד תאים בודדים microwells הפרט להפגין היישום שלה assay clonogenic של תאים בודדים. ¹⁰ המכשיר נעשתה עם פולי-dimethylsiloxane (PDMS), ונחלק לשני סטים של מערכים microwell עם גדלי microwell שונים, אשר יכול לשפר את היעילות בעיקר בטעינת תא בודד בתוך microwell שגודל הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר התא. יש לציין, זה "כפול גם" המושג מאפשר גודל השטח תרבות להיות מותאם באופן גמיש מבלי להשפיע על יעילות לכידת תא בודד, מה שהופך אותו פשוט כדי להתאים את העיצוב של המכשיר כדי להתאים סוגים ויישומים סלולריים שונים. שיטת יעילות גבוהה זה צריכה להיות שימושי עבור ניסויים בתרביות תאים לטווח ארוכים ללימודי ההטרוגניות תא הקמת קו סלולארי חד שבטית.

Protocol

הערה: עיצובי photomask עבור ייצור מכשיר microfluidic שלנו נמשכו באמצעות תוכנת מחשב תכנון בעזרת מחשב (CAD). העיצובים נוצלו אז לפברק photomasks כרום באמצעות שירות מסחרי. מכשירי PDMS נעשו באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות. ¹¹

ייצור 1. של תבניות הורים על ידי ליתוגרפיה

1. לפני תהליך photolithography ^12, השתמשו פרוסות סיליקון 4 אינץ 'כמו מצע מייבש את הפרוסות בתנור רגיל ב 120 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
2. נקו את פרוסות סיליקון מיובש באמצעות טיפול פלזמה חמצן ב 100 וואט למשך 30 שניות בתוך שואב פלזמה.
3. מחמם שתי כיריים על 65 מעלות צלזיוס ו -95 מעלות צלזיוס, בהתאמה, עבור תהליך האפייה הבאה.
4. מעיל 5 גרם של photoresist שלילית (PR) על פרוסות סיליקון ניקה ידי coater ספין; ספין ב -1,200 סל"ד (SU-8 50) למשך 30 שניות כדי לייצר את שכבת microchannel.
5. מניחים את PRמצופה רקיק על פלטה חמה שחוממה מראש ב 65 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות ולהעביר אותו למקום אחר פלטה חשמלית שחוממה מראש ב 95 מעלות צלזיוס במשך 33 דקות (עבור 100 מיקרומטר דפוסים עבים) לבצע תהליך לאפות רך.
6. לאחר אפייה, מניחים את פרוסות סיליקון מצופה PR על בעל aligner מסכת חצי אוטומטי וליישר אותו photomask שקיפות ברזולוציה 25,400 dpi.
7. לחשוף את פרוסות סיליקון מצופה PR לאור UV (365 ננומטר) במינון של 500 mJ / ² ס"מ כדי ליצור את דפוס יחסי ציבור על פרוסות סיליקון.
8. הסר את אפיפית aligner ומניח אותו על פלטה חמה עבור שלאחר אפייה על 95 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.
9. משרה את הפרוסות ב מפתח SU-8 (יצטט אתר monomethyl פרופילן גליקול, PGMEA) פתרון לשטוף PR uncrosslinked במשך 12 דקות ויבשות בעדינות באמצעות גז חנקן כדי לחשוף את סימני היישור.
10. שוב, מעיל 5 גרם של photoresist שלילית על ופלים ידי coater ספין; ספין ב 700 סל"ד (SU-8 100) למשך 30 שניות ו -1,200 סל"ד (SU-8 10) למשך 30 שניות ב -300 &# 181; דפוס מ 'עובי ו -27 מיקרומטר דפוס עבה בהתאמה להפוך את שכבת microwell.
11. מניחים את פרוסות PR מצופה על פלטה חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות (עבור 27 מיקרומטר שכבה ללכוד היטב עמוק); ו ב 65 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות ו 95 מעלות צלזיוס למשך 110 דקות (עבור 300 מיקרומטר שכבת התרבות-באר עמוקה).
12. לאחר הקירור, מניחים את פרוסות סיליקון מצופה PR על aligner מסכה מצויד אור UV.
13. לחשוף את פרוסות סיליקון מצופה PR אל אור UV (365 ננומטר) במינון של 250 mJ / ² ס"מ (עבור 27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -700 mJ / ² ס"מ (עבור 300 מיקרומטר דפוס עבה).
14. אופים את פרוסות על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -30 דקות (300 מיקרומטר דפוס עבה), בהתאמה.
15. לשטוף את ה- PR uncrosslinked ידי PGMEA במשך 6 דקות (27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -25 דקות (300 מיקרומטר דפוס עבה), בהתאמה, ולאחר מכן לייבש אותם עם גז חנקן.
16. למדוד את גובהם של דפוס תכונותרקיק עם profilometer לייזר סריקה על ידי הנחת פרוסות על-הבמה XY של profilometer לייזר סריקה.
    1. התאם את מישור המוקד כדי מראים בבירור את התבנית כולל על פרוסות סיליקון באמצעות "תצוגת המצלמה" מצב תצפית תחת עדשה אובייקטיבי 20X.
    2. לעבור את מצב התצפית מן "תצוגת מצלמה" ל "נוף ליזר", ולהגדיר את העמדות העליונות ותחתונות של התכונות.
    3. הגדרת מצב המדידה, שטח, איכות, ו- Z-המגרש עד (למעלה) שקופים, 1 הקו (1,024 x 1), דיוק גבוה ו -0.5 מיקרומטר, בהתאמה, ולאחר מכן לחץ על החלקה התחתונה כדי להתחיל את המדידה.

2. הכנת התקני PDMS עבור בידוד תא בודד

1. לפני ליהוק PDMS, silanize תבניות ההורים עם trichlorosilane כדי ליצור משטח הידרופובי, מה שהופך אותו קל יותר לקלף את העתקי PDMS מן תבניות ההורים.
   1. מניחים את תבניות הורים וסירה שקלול המכיל200 μl של trichlorosilane ייבוש, ולהחיל ואקום (-85 kPa) במשך 15 דקות.
   2. עצור את הוואקום ולאחר מכן לעזוב את תבניות ההורים בבית הייבוש silanize התבניות מאסטר בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 לפחות.
   3. הסר את תבניות הורים מתא הייבוש ומקום כל עובש אמן בצלחת 10 ס"מ פטרי.
2. מערבבים בסכום כולל של ערכת פולימר PDMS 17.6 גרם המכיל בסיס ואת סוכן ריפוי ביחס של 10: 1, ואז לשפוך את PDMS על עובש אמן בצלחת פטרי.
3. מניחים את צלחת פטרי ייבוש ולהחיל ואקום (-85 kPa) במשך שעה 1 כדי להסיר בועות אוויר בתוך PDMS.
4. הסר את צלחת פטרי מן הייבוש ומניח אותו בתנור רגיל על 65 מעלות צלזיוס למשך 3 - 6 שעות כדי לרפא את PDMS.
5. הסרת העותקים המשוכפלים PDMS נרפא מן תבניות הורים ומחייג שני חורים כמו מפרצון ולשקע על שני הקצוות של microchannel על העתק PDMS מערך היטב ללכוד ידי אגרופן עם קוטר פנימי של 0.75 מ"מ עבור ערוץ fluidic (איור 2 א).
6. השתמש קלטת לניקוי המשטח של העתקי PDMS, ולאחר מכן למקם את העתקי PDMS בתוך שואב פלזמה לטיפול פלזמת חמצן קצר (100 ואט במשך 14 שניות).
7. הסרת העותקים המשוכפלת PDMS ממכונת פלזמת חמצן.
8. יישר עליון (המכיל את microwells הלכידה) וכן PDMS תחתונה (המכיל את microwells התרבות) העתק ביד תחת סטראו ולהביאם במגע.
9. מניח את העתקי PDMS מיושרים בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להשיג זוגיות קבועה בין העתקי PDMS כדי ליצור את המכשיר הסופי.
10. משרים את המכשיר PDMS בתוך deionized (DI) -water מיכל מלא ומניחים את המיכל ייבוש תחת ואקום (-85 kPa) במשך 15 דקות כדי להסיר אוויר מן microchannel של המכשיר PDMS.
11. מניחים את המכשיר PDMS מלא מים DI במנדף בתרבית רקמה ולהשתמש אור UV (אורך הגל של האור: 254 ננומטר) לעקר של המכשיר עבור 30 מילn.
12. החלף את המים DI במכשיר PDMS עם אלבומין 5% שור (BSA) בתמיסה 1x PBS ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי למנוע מתאי יידבקו אל פני השטח PDMS.
    הערה: ציפוי BSA הוא קריטי כדי לשפר את יעילות העברת תאים מבודדים מתפיסה-היטב-היטב בתרבות.
13. החלף את פתרון BSA 5% במכשיר PDMS עם פתרון 1x PBS מעוקר.

3. הכנת ההשעיה תא בודד

1. עצבי תרבות בתאי גזע KT98, ו A549 תאי קרצינומה אדם מד"א- MB-435 אנחנו בצלחת פטרי תרבית תאי חממה קונבנציונלית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, ו -95% לחות) להכין תאים לניסוי תא מכשיר PDMS .
2. סר וזורק את מדיום תרבות בילו (בינוני הבזליים DMEM מסופק עם 10% בסרום שור עובריים 1% אנטיביוטיקה) מצלחת התרבות עם תאים שגודלו עד 70 - 80% מפגש.
3. לשטוף בעדינות את התאים עם פעמים מעוקרות שלושה PBS.
4. סר וזורק את PBS, ולהוסיף 2 מיליליטר של תערובת אנזים רקומביננטי עם פרוטאוליטים, collagenolytic, ופעילויות DNase (עיין הרשימה חומר המידע המפורט).
5. דגירה את מנת התרבות בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן קש על מנת התרבות להקל ניתוק תא.
6. הוסף 4 מ"ל של עיקור PBS לפזר תאים, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ"ל.
7. צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
8. בעדינות resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל מעוקר PBS ולספור את מספר תא חי בשיטת הרחקה Trypan כחול תקן ^13.
   הערה: צעד resuspension זה הוא קריטי עבור הכנת השעית תא בודד ניתקת גם כדי לשפר את יעילות בידוד התא הבודד.

4. בידוד תא בודד ותרבות משובטת

1. טען 50 μl של השעית תא בריכוז של 2.2 - 2.5 x10 ^{6 תאים / מ"ל לתוך microchannel של המכשיר PDMS דרך החור לשקע של המכשיר עם טפטפת כף יד.
   הערה: פיפטה טעינת תא ההשעיה שחייבת להיפסק והחזיק במיקום התחנה הראשון כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך microchannel.}
2. טען עוד 50 μl של השעית תא דרך חור המפרצון כדי למלא את microchannel כולו באופן שווה עם תאים.
3. לאטום את החור לשקע עם תקע (ארוך 3 מ"מ, 1 מ"מ חוט חכת ניילון לחתוך קוטר), כדי למנוע זרימת מושרה על ידי לחץ ההידרוסטטי מן הטיפין על חורי כניסה ויציאה.
   הערה: התקעים היו UV עיקור בתוך ברדס בתרבית רקמה לפני השימוש.
4. מלאו את מזרק סטרילי 1 מ"ל עם המדיום תרבות, להוציא בועות אוויר ממנו, ולהגדיר אותו על משאבת מזרק.
5. חברו את המזרק טעון בינוני עד החור מפרצון של המכשיר PDMS באמצעות מחט 23 G בוטה בצינור פולי-tetrafluoroethene (PTFE).
6. הסר את התקע לשקע חור וכלow מרווח זמן של 2 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתוך בארות לכידת תא בודד על ידי כוח הכבידה.
7. לשטוף את התאים שלא נלכדו עם 300 μl של מדיום התרבות בקצב זרימה של 600 μl / min מונע על ידי משאבת המזרק.
8. חכה 2 דקות כדי לייצב את המכשיר, ולאטום את חורי מפרצון ו לשקע עם אטמים כדי ליצור מערכת תרבות סגורה.
9. תהפוך את המכשיר ביד להעביר את חד תאים שנתפסו על microwells התרבות.
10. מניחים את המכשיר PDMS בצלחת בתרבית רקמה 100 מ"מ, ולהוסיף 10 מ"ל של PBS מעוקרים סביב המכשיר כדי למנוע אידוי תרבות בינוני מן microchannel.
11. הזז את מנת תרבות חממת תרבית תאים קונבנציונלית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, ו -95% לחות) לתרבות המשובטת של-תאים הבודדים.

5. רענון בינוני תרבות

1. לאחר 1 ד תרבות, להחליף את מדיום תרבות מכשיר PDMS עם מדיום חדש לשיפור יחסי ציבור תאoliferation.
2. מניח שתי טיפות של מדיום תרבות על גבי מכשיר PDMS ליד אזורי חורי כניסה ויציאה כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך microchannel בעת ביצוע השלב הבא.
3. פאנץ שני חורים מהחלק העליון של המכשיר PDMS ליד שני הקצוות של microchannel כקובץ מפרצון ולשקע עבור microchannel.
   הערה: אל אגרוף דרך שתי שכבות שלמות של המכשיר PDMS; במקום, רק אגרוף דרך השכבה העליונה של PDMS.
4. חבר מזרק פלסטיק 1 מ"ל המכיל מדיום חדש אל מפרצון באמצעות מחט 23 G בוטה צינורות PTFE.
5. זרימה בינונית טרי 120 μl לתוך המכשיר למשך 5 דקות כדי להחליף את המדיום הישן.
6. הכנס שני תקעים לאטום את הכניסה ויציאה חורה, ולהחזיר את המכשיר אל האינקובטור תרבית תאים.
7. רענן את מדיום התרבות כל 2 ד בתקופת התרבות ידי הסרת תקעי איטום, ואחריו חזרה על שלבי 5.4 עד 5.5.

תוצאות

פלטפורמת microfluidic לבידוד תא בודד והתרבות כוללת microchannel (200 מיקרומטר גובה) עם שני סטים של מערכי microwell (איור 2 א). שני סטים של מערכים microwell מכונים כמו-גם ללכוד (25 מיקרומטר בקוטר 27 מיקרומטר עומק) ו-גם תרבות (285 מיקרומטר בקוטר 300 מיקרומטר עומק) לבידוד תא ...

Discussion

מערכות מכשירות מבוסס microwell ^6,14 כבר נוצלו עבור מניפולצית תא בודד וניתוח, כגון תא בודד בקנה מידה גדולה השמן ⁶ ובחלוקה של תאי גזע hematopoietic יחיד ^15. למרות גודל היטב, מספר, וצורה יכולה להיות מותאם עבור יישומים ספציפיים, את יעילות בידוד התא היחיד נפגעה תמיד כאש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumin (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basal medium	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Plastic syringe (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge blunt needles	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm