Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Özet

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Özet

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Giriş

Şu anda bir kültür alanı ayrı ayrı tek hücre yerleştirilmesi genellikle sınırlayıcı seyreltme veya floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak elde edilir. sadece kolayca elde edilebilir Bir pipet ve doku kültür plakaları, gereğine göre bir çok laboratuarlar için, sınırlayıcı seyreltme, uygun bir yöntemdir. Bu durumda, bir hücre süspansiyonu seri uygun bir hücre yoğunluğuna kadar seyreltilir ve daha sonra bir el ile bir pipet kullanarak kültür kuyu içine yerleştirilir. Bu bölmeli tek hücreler daha sonra, ¹ ve koloni oluşumu ² tarama genetik heterojenliğinin olarak, hücre analizi için kullanılmıştır. Sınırlayıcı seyreltme yöntemi Poisson dağılımı doğa% 37 ³ maksimum olasılık tek hücreli olayları kısıtlar çünkü Ancak, bu yöntem yardım için bir robot kolu kullanarak olmadan düşük verimlilik ve emek-yoğun, olduğunu. entegre robot kol ile FACS makineleri doğru Plac tarafından Poisson dağılımının sınırlama üstesinden gelebilirBir anda ⁴ de hiç bir kültürde tek hücreli ing. Ancak, yüksek mekanik kayma gerilmesi ⁵ (böylece, hücre canlılığını indirdi) ve makine alım ve işletme maliyetleri çok laboratuvarda kullanımını sınırlıdır.

Çok verimli bir mikro ⁶ içine tek hücreler yüklemek için yukarıdaki sınırlamaları aşmak için, mikro cihazlar geliştirilmiştir. Ancak, mikro-yüklü hücreler nedeniyle tek hücreli yükleme olasılığını maksimize etmek için tek bir hücre olduğu yakın microwell her boyutunu yapma ihtiyacı, çoğalmaya için yeterli alan vermeyin. Kültür deneyleri daha büyük mikro-birçok hücre bazlı uygulamalar (örneğin, klonojenik analiz ^7), gerekli olduğu için (90 - 650 um çapında ya da yan uzunluğunda), aynı zamanda uzun bir hücre kültürleri için izin vermek için kullanılmıştır. Ancak, sınırlayıcı seyreltme yöntemi gibi, onlar da 10 arasında değişen, düşük tek hücre yükleme verimliliği sahip -.% 30 ⁸9

Daha önce, ¹⁰ cihazı poli-dimetilsiloksan (PDMS) ile yapıldı. Ayrı ayrı mikro tek hücrelerin izole edilmesi ve izole edilmiş hücrelerin klonojenik deneyde uygulanmasını göstermek için yüksek verimli mikroakışkan platformu geliştirilmiş ve mikro dizilerinin iki grup ihtiva eder adres büyük ölçüde olan boyutu kuyucuklarda tek bir hücreyi yüklenirken verimliliğini artırabilir farklı mikro boyutlarda olan hücrenin önemli ölçüde daha büyüktür. Özellikle, bu "çift kuyu" kavramı kültür alanının büyüklüğü esnek o basit farklı hücre tiplerini ve uygulamalarına uygun cihazın tasarımını ayarlamak için yapım, tek hücreli yakalama verimliliği etkilemeden ayarlanmasına imkan verir. Bu yüksek verimli bir yöntem, hücre heterojenite çalışmaları ve monoklonal hücre çizgisi oluşturulması için uzun vadeli bir hücre kültür deneyleri için yararlı olacaktır.

Protokol

Not: Bizim mikroakışkan cihaz imalatı için photomask tasarımları bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak çizildi. tasarımlar daha sonra ticari bir hizmeti kullanarak krom, fotoğraf maskeleri imal etmek yararlanılmıştır. PDMS cihazlar yumuşak litografi teknikleri kullanılarak yapılmıştır. ¹¹

Litografi tarafından Usta Kalıpları 1. Fabrikasyon

1. Fotolitografi işlem ¹² önce, bir alt-tabaka 4-inç çaplı silisyum gofret kullanımı ve 10 dakika boyunca 120 ° C de, geleneksel bir fırında gofret dihidrat.
2. Bir plazma temizleyici 30 saniye boyunca 100 watt oksijen plazma tedavisi ile susuz silikon gofret temizleyin.
3. Aşağıdaki pişirme işlemi için, sırası ile 65 ° C 'de iki ocak ve 95 ° C, ön ısıtma.
4. spin kaplayıcı ile temizlenir silikon gofret üzerinde olumsuz fotorezist (PR) Coat 5 g; 30 sn 1,200 rpm (SU-8 50) spin mikrokanal tabakası üretmek.
5. PR yerleştirin12 dakika boyunca 65 ° C'de önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerine gofret kaplanmış ve yumuşak bir fırında işlemini gerçekleştirmek için (100 mikron kalınlığında desenler) 33 dakika boyunca 95 ° C'de bir ısıtılmış sıcak plaka aktarın.
6. Pişirme sonrasında, bir yarı otomatik maske hizalama sahibinin PR kaplı silikon gofret yerleştirin ve bir 25400 dpi çözünürlük şeffaflık photomask onu hizaya getirin.
7. Silikon gofret PR desen oluşturmak için 500 mJ / ^cm2 dozunda UV ışığı (365 nm) PR kaplı silikon gofret Açığa.
8. hizalama gelen gofret çıkarın ve 12 dakika süreyle 95 ° C'de post-Pişirme için bir ocak üzerine yerleştirin.
9. hizalama işaretlerini ortaya çıkarmak için 12 dakika ve azot gazı ile hafifçe kuru için çapraz bağlanmamış PR yıkayın SU-8 geliştirici (propilen glikol monometil eter asetat, PGMEA) çözeltide gofret bekletin.
10. Yine, spin kaplayıcı tarafından gofret üzerinde olumsuz fotorezist ceket 5 g; 300 ve 30 sn için 30 saniye ve 1200 rpm'de (SU-8 10) 700 rpm'de (SU-8 100) spin# 181; m kalınlığında desen ve 27 mikron kalınlığında desen sırasıyla mikro katmanı yapmak.
11. (27 um, derin çekme çukurlu katmanı), 4 dakika ve 8 dakika boyunca 95 ° C 'de 65 ° C' de bir sıcak plaka üzerinde PR kaplanmış gofret yerleştirin; 40 dakika boyunca 65 ° C 'de ve (300 um derin bir kültür çukurlu tabakası için), 110 dakika boyunca 95 ° C' de.
12. Soğuduktan sonra, UV ışığı ile donatılmış maske hizalama PR kaplı silikon gofret yerleştirin.
13. 250 mJ / cm ² (27 mikron kalınlığında deseni) ve 700 mJ / dozunda cm ² (300 mikron kalınlığında pattern) UV ışığı (365 nm) PR kaplı silikon gofret Açığa.
14. sırasıyla 5 dakika boyunca (27 mikron kalınlığında deseni) ve 30 dakika (300 mikron kalınlığında kalıp) 95 ° C 'de gofret pişirilir.
15. sırasıyla 6 dakika (27 mikron kalınlığında deseni) ve 25 dakika (300 mikron kalınlığında desen), için PGMEA tarafından çapraz bağlanmamış PR yıkayın ve sonra azot gazı ile kurulayın.
16. desen özelliklerini yüksekliğini ölçmekBir tarayıcı lazer Profilometrenin xy-sahnede gofret koyarak tarama lazer profilometreyle gofret.
    1. açıkça desen 20X objektif mercek altında "kamera görüntüsü" gözlem modu kullanarak gofret özelliklerini göstermek için odak düzlemi ayarlayın.
    2. "Lazer görünüm" "kamera görüntüsü" dan gözlem moduna geçmek ve özellikleri üst ve alt pozisyonları ayarlayın.
    3. sırasıyla ölçüm modu, alanı, kalite ve saydam (üstte) kadar z-zift, 1 satır (1.024 x 1), yüksek doğruluk ve 0.5 mikron, ayarlayın ve ardından ölçüme başlamak için başlangıç ​​altını basın.

Tek hücreli İzolasyon PDMS Cihazlarının 2. Hazırlık

1. PDMS döküm önce, daha kolay ana kalıpları PDMS kopyaları kalkmasına yapar hidrofobik bir yüzey yaratmak için trichlorosilane ile ana kalıpları Silanize.
   1. usta kalıpları ve içeren bir ağırlık tekne yerleştirin200 kurutucuda trichlorosilane ul ve 15 dakika boyunca vakum (-85 kPa) uygulanır.
   2. vakumu durdurmak ve daha sonra en az 1 saat oda sıcaklığında ana kalıpları Silanize için desikatörde ana kalıpları bırakın.
   3. desikatöre master kalıpları çıkarın ve 10 cm Petri kabındaki her ana kalıp yerleştirin.
2. bir taban ve 10 arasında bir oranda bir sertleştirme ajanı ihtiva eden 17.6 g PDMS polimer kitinin bir toplam tutarını karıştırın: 1, ve daha sonra Petri kabındaki ana kalıp PDMS dökün.
3. desikatörde Petri kabı yerleştirin ve PDMS hava kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat vakum (-85 kPa) uygulanır.
4. desikatör Petri çanağı çıkarın ve 3 65 ° C sıcaklıkta, geleneksel bir fırında yer - PDMS tedavisi için 6 saat.
5. ana kalıpları tedavi PDMS kopyaları çıkarın ve 0 iç-çapına sahip bir puncher'ait yakalama-kuyu dizi PDMS çoğaltma Mikrokanallı iki ucunda iki bir giriş olarak delikleri ve bir çıkış yumruk.Akışkan kanalının (Şekil 2A) için 75 mm.
6. PDMS kopyaları yüzeyini temizlemek ve sonra kısa bir oksijen plazma tedavisi (14 sn için 100 watt) için bir plazma temizleyici PDMS kopyaları yerleştirmek için bant kullanın.
7. oksijen plazma makineden PDMS kopyaları çıkartın.
8. Bir stereomikroskop altında elle bir üst (yakalama mikro içeren) ve (kültür mikro içeren) bir alt PDMS çoğaltma hizalayın ve temas getirmek.
9. Nihai cihaz oluşturmak PDMS yinelemeler arasında sürekli bir bağlantı sağlamak için 24 saat boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde hizalanmış PDMS yinelemeler yerleştirin.
10. deiyonize (Di) -su doldurulmuş kapta PDMS cihaz ıslatın ve PDMS cihazın mikrokanaldan havayı çıkarmak için 15 dakika boyunca vakum altında (-85 kPa) bir desikatör içinde kap yerleştirmek.
11. Bir doku kültürü kaputu DI su dolu PDMS cihaz yerleştirin ve UV ışığı (ışığın dalga boyu: 254 nm) kullanmak 30 mil için cihazın sterilize etmekn.
12. 1X PBS çözeltisi içinde% 5 sığır serum albumin (BSA) ile PDMS cihazında distile su yerine ve PDMS yüzeye yapışmasını engellemek için hücrelerin 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    BSA kaplama izole hücre transferi verimini artırmak için kritik yakalama oyuklu kültür oyuklu: edin.
13. sterilize 1x PBS çözeltisi ile PDMS cihazın% 5 BSA çözüm değiştirin.

Tek hücreli Süspansiyon 3. hazırlanması

1. Kültür Nöral hücre KT98 ve insan karsinoma hücre A549 ve MDA-MB-435, biz kök PDMS cihaz hücre deneyi için hücreler hazırlamak için geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 _CO2 ve% 95 nem) Petri kabındaki .
2. Çıkarın ve geçirilerek kültür ortamı 70 yetiştirilen hücreler kültür kabı (% 10 fetal bovin serumu ve% 1 antibiyotik ile birlikte DMEM bazal ortamı) iptal -% 80 birleşir.
3. Yavaşça sterilize PBS üç kez hücreleri yıkayın.
4. (Ayrıntılı bilgi için Malzeme Listesi bakınız) çıkarın ve PBS atmak ve proteolitik, kolajenolitik ve DNaz faaliyetleri ile rekombinant enzim karışımı 2 ml ekleyin.
5. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kültürü çanak inkübe ve daha sonra hücre ayrılması için kültür çanağı dokunun.
6. hücrelerin dağıtılması için steril PBS 4 ml ve sonra 15 ml konik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın.
7. 3 dakika boyunca 300 xg'de tüp Santrifüj ve süpernatant kaldırmak.
8. Yavaşça PBS sterilize 1 ml hücre pelletini ve standart Tripan Mavi dışlama yöntemi ¹³ kullanarak canlı hücre sayısını.
   Not: Bu yeniden süspansiyon haline adımı tek hücre izolasyon verimini artırmak için iyi ayrışmış tek hücre süspansiyonu hazırlamak için kritik önem taşır.

4. Tek hücreli İzolasyon ve klonal Kültür

1. 2.5 x10 - 2.2 arasında bir konsantrasyonda Yük hücresi süspansiyonu 50 ul 6 hücre / ml.
   Not: Hücre süspansiyonu yükleme pipet Mikrokanallı içine hava kabarcıkları almaktan kaçınması durdu ve ilk durağı konumunda düzenlenecek gerekmektedir.
2. eşit hücreleri ile tüm Mikrokanallı doldurmak için giriş delikten hücre süspansiyonu başka bir 50 ul yükleyin.
3. giriş ve çıkış delikleri damlacıklar gelen hidrostatik basınç ile uyarılan akışını önlemek için bir tıkaç (3 mm uzunluğunda, 1 mm çapında kesim naylon misina) ile çıkış deliği mühür.
   Not: Fişler kullanmadan önce bir doku kültürü kaput içinde sterilize UV ​​idi.
4. , Kültür ortamı ile 1 ml steril şırınga doldurun ondan hava kabarcıklarını çıkarmak ve bir şırınga pompası kurmak.
5. Bir 23 G, kör bir iğne ve bir poli-tetrafluoroethene (PTFE) boru ile PDMS cihazın giriş deliğine orta yüklü şırınga bağlayın.
6. çıkış deliği ve tüm prizden çıkarınow 2 dk zaman aralığı hücreleri yerçekimi kuvveti tarafından tek hücreli yakalama-kuyu içine yerleşmek için izin vermek.
7. şırınga pompası tarafından tahrik edilen 600 | il / dk'lık bir akış oranında kültür ortamında 300 ul uncaptured hücreleri yıkamak.
8. Cihazı stabilize etmek 2 dakika bekleyin ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için fişler ile giriş ve çıkış delikleri kapatın.
9. kültür mikro yakalanan tek hücreleri aktarmak için el cihazı çevirin.
10. 100 mm doku kültürü çanağı içinde PDMS cihaz yerleştirin ve mikrokanaldan kültür ortamı buharlaşmayı önlemek için cihaz etrafında steril 10 ml PBS ilave edin.
11. Tek hücrelerinin klonal kültürü için geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 _CO2 ve% 95 nem) kültür çanağı hareket.

5. Kültür Orta Yenileme

1. kültür 1 gün sonra, hücre pr geliştirmek için taze ortam PDMS cihazında bir kültür ortamı yerineoliferation.
2. Bir sonraki adımı yaparken Mikrokanallı içine hava kabarcıkları almaktan kaçınması giriş ve çıkış delikleri alanların yakınında PDMS cihazın üstündeki kültür ortamının iki damlacıkları yerleştirin.
3. Bir giriş olarak, mikrokanalın iki ucunun yakınındaki PDMS cihazın üst ve mikrokanal için bir çıkışı iki delikler.
   Not: PDMS cihazın tam iki kat üzerinden yumruk etmeyin; Bunun yerine, sadece PDMS üst katmanı sayesinde yumruk.
4. Bir 23 G, kör bir iğne ve PTFE tüp vasıtasıyla girişe taze ortam ihtiva eden bir 1 ml'lik plastik bir şırınga bağlayın.
5. eski orta yerine 5 dakika süreyle cihaza 120 ul taze orta akış.
6. giriş mühür ve delikler çıkış ve hücre kültürü inkübatör cihazı geri dönmek için iki fişleri takın.
7. 5.5 adımları 5.4 tekrarlayarak ardından sızdırmazlık tapaları, kaldırarak kültür ortamının kültürünün döneminde her 2 günde bir yenileyin.

Sonuçlar

Tek hücre izolasyonu ve kültürü için mikroakışkan platformu mikro dizileri iki set (Şekil 2A) ile bir mikrokanal (yükseklik 200 mm) içerir. Mikro dizilerin iki set yakalama oyuk (çapı 25 mm ve derinliği 27 mm), sırasıyla, tek hücreli izolasyonu ve kültürü için, kültür oyuk (çapı 285 mm ve derinlik 300 mm), ve her olarak adlandırılır üst görünümü (Şekil 2B) görüldüğü zaman yakalama-kuyu kültür-kuyu merkezinde konuml...

Tartışmalar

Mikro-tabanlı bir aygıt sistemleri ^6,14 örneğin ⁶ yakalama geniş çaplı tek bir hücre tek kök hücre çoğalması ¹⁵ gibi tek hücre manipülasyonu ve analiz için kullanılmıştır. De boyut, sayı ve şekil olsa da, özel uygulamalar için ayarlanabilmektedir kuyunun boyutu artar olduğunda tek hücre izolasyon verimi, her zaman ele almaktadır. ^9,15

Mikro boyutu hücre yayılması ve büyümesi için izin vermek için büyütülür ise ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumin (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basal medium	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Plastic syringe (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge blunt needles	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm