Una piattaforma Microfluidic per l'isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Riepilogo

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Abstract

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Introduzione

Attualmente posizionando le celle singole singolarmente in uno spazio culturale è comunemente raggiunto utilizzando la diluizione limitando o cella a fluorescenza-attivato (FACS). Per molti laboratori, diluizione limite è un metodo conveniente, in quanto richiede solo una pipetta e piastre di coltura di tessuto, che sono prontamente disponibili. In questo caso, una sospensione cellulare viene diluito serialmente ad una densità cellulare appropriata, e quindi posto in pozzetti di coltura utilizzando una pipetta manuale. Queste cellule singoli compartimenti sono poi utilizzati per l'analisi delle cellule, come ad esempio lo screening eterogeneità genetica ¹ e colonia di formazione ^2. Tuttavia, questo metodo è basso throughput e intensità di lavoro, senza utilizzare un braccio robotico per l'assistenza, perché la natura distribuzione di Poisson del metodo di diluizione limitante limita eventi monocellulari ad una probabilità massima del 37% ^3. macchine FACS con un braccio robotico integrato in grado di superare la limitazione della distribuzione di Poisson con precisione placing una singola cella in una cultura ben alla volta ^4. Tuttavia, l'elevato sforzo di taglio meccanico (quindi abbassato vitalità cellulare) ⁵ ed acquisto della macchina e dei costi operativi hanno limitato il suo utilizzo in molti laboratori.

Per superare le limitazioni di cui sopra, i dispositivi microscala sono stati sviluppati per caricare altamente efficiente singole cellule nei pozzetti ^6. Tuttavia, i pozzetti non forniscono spazio sufficiente per le cellule caricate a proliferare, a causa della necessità di rendere le dimensioni di ciascun pozzetto vicino a quello di una singola cella di massimizzare il carico probabilità cella singola. Come test di cultura sono necessari in molte applicazioni basati su celle (ad esempio, test clonogenica ^7), pozzetti più grandi (90-650 micron di diametro o in lunghezza del lato) sono stati utilizzati per consentire colture cellulari estesi. Tuttavia, come il metodo di diluizione limitante, possiedono anche bassi singole efficienze di carico delle cellule, che vanno da 10 -. 30% ⁸, 9

In precedenza, abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica high-throughput per isolare singole cellule nei singoli pozzetti e dimostrare la sua applicazione nel saggio clonogenica delle cellule isolate. ¹⁰ Il dispositivo è stato realizzato con poli-dimetilsiloxano (PDMS), e comprende due serie di array di pozzetti con differenti formati micropozzetti, che può sostanzialmente migliorare l'efficienza nel caricare una singola cella in un micropozzetto cui dimensione è significativamente più grande della cella. In particolare, questo concetto "dual-well" permette la dimensione dell'area culturale di regolare in modo flessibile senza compromettere l'efficienza di cattura cella singola, rendendo semplice per regolare la progettazione del dispositivo per soddisfare diversi tipi di cellule e applicazioni. Questo metodo ad alta efficienza dovrebbe essere utile per esperimenti di coltura cellulare a lungo termine per gli studi eterogeneità delle cellule e monoclonale stabilimento linea cellulare.

Protocollo

Nota: I disegni fotomaschere per la nostra fabbricazione di dispositivi microfluidica sono stati elaborati utilizzando un software di progettazione assistita da computer (CAD). I disegni sono stati poi utilizzati per fabbricare fotomaschere Chrome con un servizio commerciale. I dispositivi PDMS sono state effettuate utilizzando tecniche di litografia morbide. ¹¹

1. Realizzazione di Maestro Stampi per litografia

1. Prima che il processo di fotolitografia ^12, utilizzare i wafer di silicio da 4 pollici come substrato e disidratare i wafer in un forno convenzionale a 120 ° C per 10 min.
2. Pulire i wafer di silicio disidratati mediante trattamento al plasma di ossigeno a 100 watt per 30 secondi in un pulitore plasma.
3. Preriscaldare due piastre a 65 ° C e 95 ° C, rispettivamente, per il seguente processo di cottura.
4. Cappotto 5 g di photoresist negativo (PR) sui wafer di silicio pulite da un dispositivo a induzione di spin; centrifuga a 1200 rpm (SU-8 50) per 30 sec per produrre lo strato di microcanali.
5. Posizionare il PRrivestito wafer su una piastra preriscaldato a 65 ° C per 12 min e trasferirlo in un'altra piastra preriscaldato a 95 ° C per 33 min (per 100 micron di spessore modelli) per eseguire un processo di cottura morbida.
6. Dopo la cottura, posizionare il wafer di silicio rivestito PR sul supporto di una maschera allineatore semi-automatico e allinearlo a una trasparenza fotomaschera 25.400 dpi di risoluzione.
7. Esporre il rivestito PR wafer di silicio a luce UV (365 nm) ad una dose di 500 mJ / cm ² per creare il modello PR sul wafer di silicio.
8. Rimuovere il wafer dal allineatore e posizionarlo su una piastra per la post-cottura a 95 ° C per 12 min.
9. Mettere a bagno i wafer di SU-8 sviluppatore della soluzione (glicole propilenico monometiletere acetato, PGMEA) per lavare via PR non reticolato per 12 min e asciugare delicatamente con azoto per esporre i segni di allineamento.
10. Ancora una volta, cappotto 5 g di fotoresist negativo sui wafer da un coater centrifuga; centrifuga a 700 rpm (SU-8 100) per 30 sec e 1.200 rpm (SU-8 10) per 30 sec per 300 &# 181; m modello di spessore e 27 micron modello di spessore, rispettivamente, per rendere lo strato micropozzetto.
11. Posizionare il wafer PR rivestito su una piastra riscaldante a 65 ° C per 4 min ed a 95 ° C per 8 min (per 27 micron strato profondo cattura-well); ed a 65 ° C per 40 minuti ea 95 ° C per 110 min (per 300 micron strato profondo cultura-well).
12. Dopo raffreddamento, posizionare il wafer di silicio rivestito PR sul allineatore maschera dotata di luce UV.
13. Esporre il rivestito PR wafer di silicio alla luce UV (365 nm) ad una dose di 250 mJ / cm ² (per 27 micron di spessore pattern) e 700 mJ / cm ² (per 300 micron di spessore pattern).
14. Cuocere i wafer a 95 ° C per 5 min (27 micron di spessore pattern) e 30 min (300 micron di spessore pattern), rispettivamente.
15. Lavare il PR non reticolato dal PGMEA per 6 min (27 micron di spessore pattern) e 25 min (300 micron di spessore pattern), rispettivamente, e poi asciugare con azoto.
16. Misurare l'altezza del modello dispone suil wafer con un profilometro scansione laser posizionando il wafer sul xy fase di un profilometro laser a scansione.
    1. Regolare il piano focale per mostrare chiaramente il modello presenta sul wafer utilizzando la modalità di osservazione "telecamera" sotto una lente obiettivo 20X.
    2. Cambiare la modalità di osservazione da "telecamera" a "vista laser", e impostare le posizioni superiori ed inferiori delle caratteristiche.
    3. Impostare la modalità di misurazione, zona, la qualità, e Z-passo fino a trasparente (in alto), 1 linea (1.024 x 1), ad alta precisione e 0,5 micron, rispettivamente, e quindi premere il fondo di partenza per iniziare la misurazione.

2. Preparazione di dispositivi PDMS per l'isolamento Single-cell

1. Prima di PDMS casting, silanizzare gli stampi di perfezionamento con triclorosilano per creare una superficie idrofobica, che rende più facile per staccare il PDMS repliche dagli stampi maestri.
   1. Mettere gli stampi master e una barca ponderazione contenente200 ml di triclorosilano in essiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 15 min.
   2. Arrestare il vuoto e poi lasciare gli stampi di master in un essiccatore per silanizzare gli stampi maestri a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
   3. Rimuovere gli stampi maestri dal essiccatore e posizionare ogni stampo master in un 10 centimetri Petri.
2. Mescolare un totale di 17,6 g di polimero kit PDMS contenente una base e un agente indurente in un rapporto di 10: 1, e quindi versare il PDMS sullo stampo master nel piatto Petri.
3. Posizionare la piastra di Petri in un essiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 1 ora per rimuovere le bolle d'aria nei PDMS.
4. Rimuovere la piastra di Petri dal essiccatore e metterla in un forno tradizionale a 65 ° C per 3-6 ore per curare il PDMS.
5. Rimuovere le repliche PDMS indurito dagli stampi master e perforare due fori come un ingresso e una uscita alle due estremità del microcanale sull'array PDMS replica capture-bene da un perforatore con interno-diametro di 0.75 mm per il canale fluidica (Figura 2A).
6. Utilizzare nastro per pulire la superficie delle repliche PDMS, e quindi posizionare le repliche PDMS un detersivo plasma per breve trattamento al plasma di ossigeno (100 watt per 14 sec).
7. Rimuovere le repliche PDMS dalla macchina plasma di ossigeno.
8. Allineare un top (contenente i pozzetti di cattura) e un PDMS fondo (che contengono i pozzetti di coltura) replica a mano allo stereomicroscopio e metterli in contatto.
9. Posizionare i PDMS repliche allineate in un forno a 65 ° C per 24 ore per ottenere l'unione permanente tra le PDMS repliche per formare il dispositivo finale.
10. Bagnare il dispositivo PDMS in un deionizzata (DI) -acqua contenitore riempito e posizionare il contenitore in un essiccatore sotto vuoto (-85 kPa) per 15 minuti per eliminare l'aria dalla microcanali del dispositivo PDMS.
11. Posizionare il dispositivo PDMS piena d'acqua DI in una cappa coltura tissutale e utilizzando luce UV (lunghezza d'onda: 254 nm) per sterilizzare il dispositivo per 30 min.
12. Sostituire l'acqua deionizzata nel dispositivo PDMS con un siero albumina bovina 5% (BSA) in soluzione PBS 1x e incubare a 37 ° C per 30 minuti per impedire alle cellule di attaccarsi alla superficie PDMS.
    Nota: Il rivestimento BSA è essenziale per migliorare l'efficienza di trasferimento di cellule isolate dalla cattura pozzetti per coltura pozzetti.
13. Sostituire la soluzione BSA 5% nel dispositivo PDMS con una soluzione di PBS 1x sterilizzata.

3. Preparazione di cella singola sospensione

1. Culture Neural staminali KT98 cella e A549 cellule di carcinoma umano MDA-MB-435 che in piastra di Petri in coltura cellulare convenzionale incubatore (37 ° C, 5% di CO _2, e 95% di umidità) per preparare le cellule per l'esperimento PDMS cella periferica .
2. Rimuovere e scartare il terreno di coltura esaurito (DMEM medio basale in dotazione con il 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici) dal piatto di coltura con cellule coltivate a 70 - 80% di confluenza.
3. Lavare delicatamente le cellule con sterilizzati PBS per tre volte.
4. Rimuovere e scartare il PBS e aggiungere 2 ml di una miscela di enzimi proteolitici ricombinante con, collagenolitica, e le attività di DNasi (si veda l'elenco dei materiali per le informazioni dettagliate).
5. Incubare il piatto cultura a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi toccare il piatto cultura per facilitare il distacco delle cellule.
6. Aggiungere 4 ml di PBS sterile per disperdere le cellule, e poi trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
7. Centrifugare la provetta a 300 xg per 3 min e rimuovere il surnatante.
8. Risospendere delicatamente il pellet di cellule in 1 ml sterilizzati PBS e contare il numero di cellulare dal vivo con il metodo standard di esclusione Trypan Blue ^13.
   Nota: questo passaggio risospensione è fondamentale per la preparazione di ben dissociato-cella singola sospensione per migliorare l'efficienza di isolamento cella singola.

4. Isolamento Single-cell e cultura clonale

1. Carico 50 ml di sospensione cellulare ad una concentrazione di 2,2 - 2.5 x10 ^{6 cellule / ml nel microcanali del dispositivo PDMS tramite foro di uscita del dispositivo con una pipetta palmare.
   Nota: Il caricamento della pipetta sospensione cellulare deve essere fermato e tenuto alla prima posizione di arresto per evitare l'introduzione di bolle d'aria nel microcanali.}
2. Caricare altri 50 ml di sospensione cellulare attraverso il foro di ingresso per riempire in modo uniforme l'intero microcanali con cellule.
3. Sigillare il foro di uscita con un tappo (a lunghezza 3 mm, 1 mm di diametro nylon taglio lenza) per evitare il flusso indotto dalla pressione idrostatica dalle goccioline di fori di ingresso e di uscita.
   Nota: le spine erano UV sterilizzato all'interno di una cappa coltura tissutale prima dell'uso.
4. Riempire una siringa da 1 ml sterile con terreno di coltura, espellere le bolle d'aria da esso, e impostarlo su una pompa a siringa.
5. Collegare il supporto caricato siringa al foro di ingresso del dispositivo PDMS tramite un ago G smussata 23 ed una poli-tetrafluoroethene tubazione (PTFE).
6. Togliere la spina dalla presa di corrente e tutto il foro diow un intervallo di tempo di 2 minuti per consentire alle cellule di stabilirsi nella cella singola cattura-pozzi di forza gravitazionale.
7. Lavare via le cellule non catturate con 300 ml di terreno di coltura ad una portata di 600 ml / min spinto dalla pompa a siringa.
8. Attendere 2 minuti per stabilizzare il dispositivo, e sigillare i fori di ingresso e di uscita con spine per formare un sistema di coltura chiuso.
9. Capovolgere il dispositivo a mano per trasferire i catturati singole cellule ai pozzetti di coltura.
10. Posizionare il dispositivo PDMS in un piatto di coltura di tessuti da 100 mm, e aggiungere 10 ml di PBS sterile intorno al dispositivo per evitare l'evaporazione cultura media dal microcanali.
11. Spostare il piatto cultura di un incubatore tradizionale coltura cellulare (37 ° C, 5% di CO _2, e 95% di umidità) per la cultura clonale delle singole cellule.

5. terreno di coltura Replenishment

1. Dopo 1 d della cultura, sostituire il terreno di coltura nel dispositivo PDMS con terreno fresco per migliorare pr celluleoliferation.
2. Inserire due gocce di mezzo di coltura sulla parte superiore del dispositivo PDMS vicino alle aree fori di ingresso e di uscita per evitare l'introduzione di bolle d'aria nel microcanale durante l'esecuzione della fase successiva.
3. Punch due fori dalla parte superiore del dispositivo PDMS prossimità delle due estremità del microcanale come un ingresso e un'uscita per il microcanali.
   Nota: non perforare attraverso l'intero due strati del dispositivo PDMS; invece, proprio pugno attraverso lo strato superiore delle PDMS.
4. Collegare una siringa di plastica da 1 ml contenente mezzo fresco per l'ingresso attraverso un ago G smussata 23 e tubi in PTFE.
5. Portata media 120 microlitri fresca nel dispositivo per 5 minuti per sostituire il vecchio mezzo.
6. Inserire due tappi per sigillare entrata e uscita fori, e restituire il dispositivo per l'incubatore di coltura cellulare.
7. Aggiornare il terreno di coltura ogni 2 d durante il periodo di coltura rimuovendo le spine di tenuta, seguito ripetendo i punti 5.4 al 5.5.

Risultati

La piattaforma microfluidica per l'isolamento e la coltura singola cella comprende un microcanale (200 micron di altezza) con due serie di matrici di micropozzetti (Figura 2A). Le due serie di array di pozzetti sono definiti come la cattura-bene (25 micron di diametro e 27 micron di profondità) e la cultura-bene (285 micron di diametro e 300 micron di profondità) per l'isolamento a cella singola e cultura, rispettivamente, e ogni cattura-well è posizionata al ...

Discussione

Sistemi di dispositivi di pozzetti a base di ^6,14 sono stati utilizzati per la manipolazione a cella singola e di analisi, come ad esempio su larga scala singola cellula intrappolando ⁶ e la proliferazione delle cellule staminali ematopoietiche singolo ^15. Sebbene dimensioni ben, il numero e la forma può essere regolata per applicazioni specifiche, l'efficienza di isolamento singola cella è sempre compromessa quando si aumenta la dimensione del pozzo. ^9,15

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumin (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basal medium	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Plastic syringe (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge blunt needles	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm