높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

요약

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

초록

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

서문

현재 배양 공간에 개별적으로 하나의 셀을 배치는 일반적으로 제한 희석 또는 형광 - 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 사용하여 달성된다. 그것은 단지 쉽게 사용할 수 있습니다 피펫 및 조직 배양 플레이트를 필요로 많은 실험실의 경우, 희석을 제한하는 편리한 방법입니다. 이러한 경우에, 세포 현탁액을 연속적으로 적당한 세포 밀도로 희석 한 다음 수동 피펫을 이용하여 배양 웰에 두었다. 이러한 복실 단셀 그런 다음 ¹ 콜로니 ^{형성이 스크리닝} 이질성 유전자로서 세포 분석을 위해 사용된다. 한계 희석법의 푸 아송 분포의 특성은 37 % ^(3)의 최대 확률 단세포 이벤트를 제한하기 때문에,이 방법을 지원하기위한 로봇 팔을 이용하지 않고 낮은 처리량과 노동력이있다. 통합 된 로보트 팔 FACS 기계 정확하게 PLAC으로 푸 아송 분포의 한계를 극복 할 수있다한 번에 ^4에서 잘 문화에서 하나의 셀을 보내고. 그러나, 높은 기계적 전단 응력은 ⁵ (따라서, 세포 생존 능력을 저하) 및 기계 구입 및 운영 비용은 많은 실험실에서의 사용을 제한하고있다.

고효율 마이크로 웰 ^(6)에 하나의 셀을로드에 위의 한계를 극복하기 위해, 마이크로 장치가 개발되었다. 그러나, 마이크로 웰은로드 셀 인해 단일 ​​셀 로딩 가능성을 최대화하기 위해 하나의 셀에 가까운 마이크로 웰 각의 크기의 제조가 필요로 증식 할 충분한 공간을 제공하지 않는다. 배양 분석이 더 많은 마이크로 웰 세포 - 기반 애플리케이션 (예를 들면, 클론 원성 분석 ^7)에 요구되는 바와 같이 (90 - 650 ㎛의 직경 또는 측면 길이) 또한 확장 세포 배양을 허용하기 위해 이용되어왔다. 그러나, 한계 희석법 같이, 또한 (10)에 이르기까지, 낮은 단일 셀 로딩 효율을 갖는다 -. 30 % ⁸9

이전에, 우리는 ⁽¹⁰⁾ 장치는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)으로 제작 하였다. 각각의 마이크로 웰에서 단일 세포를 분리하고, 분리 된 세포의 클론 원성 분석에서의 응용을 증명하기 위해 높은 처리량 미세 플랫폼을 개발하고, 마이크로 웰 어레이들의 두 세트를 포함하는 한 대체로 크기가 마이크로 웰의 단일 셀 로딩의 효율을 향상시킬 수있는 다른 마이크로 웰 크기와 세포보다 상당히 크다. 특히,이 "이중 - 웰"개념 배양 영역의 크기는 유동적이 간단 다른 세포 유형 및 애플리케이션에 적합하도록 장치의 설계를 조정할 수있어 단일 세포 포집 효율에 영향을주지 않고 조절 될 수있다. 이 고효율 방법은 세포 이질성 연구 및 모노클로 날 세포주 확립 장기간 세포 배양 실험에 유용 할 것이다.

프로토콜

주 : 우리의 미세 유체 소자의 제작을위한 포토 마스크 설계는 컴퓨터 이용 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 그려졌다. 디자인이어서, 상용 서비스를 이용하여 크롬 포토 마스크를 제조하는데 사용 하였다. PDMS의 장치는 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 제조 하였다. ¹¹

리소그래피에 의해 마스터 금형 1. 제작

1. 포토 리소그래피 공정 ⁽¹²⁾ 전에, 기판으로 4 인치 실리콘 웨이퍼를 사용하여 10 분 동안 120 ℃에서 종래의 오븐에서 웨이퍼 탈수.
2. 플라즈마 클리너 30 초 100w에서 산소 플라즈마 처리를 이용하여 탈수 한 실리콘 웨이퍼를 클린.
3. 다음 베이킹 프로세스에 대해 각각 65 ° C에서 두 개의 핫 플레이트 95 ° C를 예열.
4. 스핀 코터에 의해 세정 된 실리콘 웨이퍼 상에 네가티브 포토 레지스트 (PR)를 도포 5g; 30 초 동안 1,200 rpm으로 (SU-8 50)에서 스핀 마이크로 층을 생성한다.
5. 홍보를 배치12 분 동안 65 ℃에서 예열 된 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 도포하고, 소프트 베이크 공정을 수행하기 위해 (두께 100㎛의 패턴) 33 분 동안 95 ° C에서 다른 예열 된 핫 플레이트로 옮긴다.
6. 소성 후, 반자동 마스크 얼 라이너의 홀더에 PR 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 배치하고, 25,400 dpi의 해상도 투명 마스크에 정렬.
7. 실리콘 웨이퍼의 PR 패턴을 만들 의해 500mJ / ^㎠의 도즈에서 UV 광 (365 ㎚)에 PR 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 노출시킨다.
8. 얼 라이너에서 웨이퍼를 제거하고 12 분 동안 95 ° C에서 후 베이킹을위한 열판에 놓습니다.
9. 정렬 마크를 노출 12 분 질소 가스로 가볍게 건조위한 미가 교 PR을 씻어 SU-8 현상액 (프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트, PGMEA) 용액에 웨이퍼를 담근다.
10. 다시, 스핀 코터에 의해 웨이퍼 상에 네가티브 포토 레지스트의 코팅 5g; 300 30 초 30 초와 1,200 RPM (SU-8 10) 700 rpm으로 (SU-8 100)에서 스핀# 181; m 두께의 패턴 및 27 μm의 두께 패턴은 각각 마이크로 웰 층을 확인합니다.
11. (27 μm의 깊은 캡처 웰 층) 4 분, 8 분 동안 95 ° C에서 65 ° C에서 열판에 PR 코팅 된 웨이퍼를 배치; 40 분 동안 65 ° C에서과 (300 μm의 깊은 문화 잘 층) 110 분 동안 95 ° C에서.
12. 냉각 후, UV 광을 구비 한 마스크 얼 라이너에 PR 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 배치했다.
13. 250 엠제이 / cm ² (27 μm의 두께 패턴) 700 엠제이 /의 용량 cm ² (300 μm의 두께 패턴)에 자외선 (365 nm의)에 PR 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 노출.
14. 각각 5 분 (27 μm의 두께 패턴), 30 분 (300 μm의 두께 패턴) 95 ° C에서 웨이퍼를 굽는다.
15. 각각 6 분 (27 μm의 두께 패턴), 25 분 (300 μm의 두께 패턴)의 PGMEA에 의해 가교 PR을 세척 한 후 질소 가스로 건조.
16. 패턴의 피처들의 높이를 측정스캐닝 레이저 프로파일로의 XY 스테이지 상에 웨이퍼를 배치함으로써 주사 레이저 프로파일로 갖는 웨이퍼.
    1. 명확 패턴은 20X 대물 렌즈에서 "카메라 뷰"관찰 모드를 사용하여 웨이퍼 상에 표시하는 기능의 초점 평면을 조정한다.
    2. "레이저보기"를 "카메라 뷰"로부터 관찰 모드를 전환 한 기능의 상하 위치를 설정한다.
    3. 각각 측정 모드, 영역, 품질 및 투명 (위)까지 Z 피치, 1 라인 (1024 × 1), 높은 정확도와 0.5 μm의를 설정하고 측정을 시작하기 시작 바닥을 누릅니다.

단일 세포 분리를위한 PDMS 장치 2. 준비

1. PDMS 주조 전에 쉽게 마스터 몰드에서 PDMS 복제본을 박리하게 소수성 표면을 만들 트리클로로 마스터 주형 silanization합니다.
   1. 마스터 주형 및 함유 가중 보트 놓고200 데시 케이 터에서 트리클로로 실란의 μL, 15 분 동안 진공 (-85 kPa의)를 적용합니다.
   2. 진공을 중지 한 후 적어도 1 시간 동안 실온에서 마스터 주형 silanization합니다하도록 데시 케이 터 내에서 마스터 주형을 떠난다.
   3. 데시 케이 터에서 마스터 금형을 제거하고 10cm 페트리 접시에 각각의 마스터 몰드를 배치합니다.
2. 베이스 10의 비율로 함유 경화제 17.6 g PDMS 중합체 키트 총량 믹스 : 1 다음 페트리 접시에서 마스터 주형 상에 PDMS를 붓는다.
3. 데시 케이 터에서 페트리 접시를 놓고 PDMS 기포를 제거하기 위해 1 시간 동안 진공 (-85 kPa의)을 적용한다.
4. 데시 케이 터에서 페트리 접시를 제거하고 3 ~ 65 ° C에서 기존의 오븐에 배치 - PDMS의 치료를 위해 6 시간.
5. 마스터 몰드로부터 경화 된 PDMS 레플리카를 제거하고 공의 내경을 가진 펀치에 의해 캡처 웰 어레이 PDMS 복제본 마이크로 채널의 양단에서 두개의 입구로서 구멍 출구 펀치.유체 채널 (그림 2A) 75 mm이다.
6. PDMS의 복제본의 표면을 청소 한 다음 간단한 산소 플라즈마 처리 (14 초 100 와트)에 대한 플라즈마 클리너에 PDMS 복제본을 배치하는 테이프를 사용합니다.
7. 산소 플라즈마 시스템에서 PDMS 복제본을 제거합니다.
8. 실체 현미경 아래에 손으로 최고 (캡처 마이크로 웰을 포함)과 (문화 마이크로 웰 포함) 바닥 PDMS 복제를 맞추고 접촉을 가져.
9. 최종 장치를 형성하도록 PDMS 복제본 간의 영구적 인 결합을 달성하기 위해 24 시간 동안 65 ° C의 오븐에서 배향 PDMS 복제본을 놓는다.
10. 탈 (DI) - 물 채워진 용기에 PDMS 소자를 담가 상기 PDMS 장치의 마이크로 채널로부터 공기를 제거하기 위해 15 분간 진공 (-85 kPa의) 하에서 건조기에서 용기를 배치했다.
11. 조직 배양 후드에서 DI 워터 가득 PDMS 소자를 배치하고 UV 광 (광의 파장이 254 나노 미터)를 사용하여 30 마일에 대해 장치의 살균엔.
12. 1X PBS 용액에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 함께 PDMS 소자의 DI 물을 장착하고 PDMS 표면에 달라 붙는 것을 방지 세포를 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
    BSA 코팅에서 분리 된 세포의 전달 효율을 개선하는 것이 중요합니다 캡처 웰에 문화를 잘 참고.
13. 살균 1X PBS 용액으로 PDMS 장치에서 5 % BSA 용액을 교체합니다.

단일 세포 현탁액 3. 준비

1. 배양 신경 세포 KT98, 인간 암 세포 A549 및 MDA-MB-435 우리를 줄기 PDMS 소자 세포 실험에서 세포를 제조하는 통상의 세포 배양 용 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO _2, 95 % 습도)에서 페트리 접시 .
2. 제거하고 소모 된 배양액 (70)으로 성장 세포 배양 접시에서 (10 % 소 태아 혈청 및 1 % 항생제가 공급 DMEM 기초 배지) 폐기 - 80 % 합류.
3. 부드럽게 멸균 PBS로 3 회 세포를 씻는다.
4. (자세한 내용은 자료 목록을 참조하십시오) 제거하고 PBS를 폐기하고, 단백질 분해, collagenolytic 및 DNase의 활동과 재조합 효소 혼합물 2 ㎖를 추가합니다.
5. 실온에서 5 분간 배양 접시에 배양 한 후 세포의 분리를 촉진하는 배양 접시를 탭.
6. 세포를 분산시키는 멸균 PBS 4 mL를 추가 한 후 15ml의 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 전송.
7. 3 분 300 XG에 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
8. 부드럽게 PBS 멸균 한 용액에 세포 펠렛을 재현 탁하고 트리 판 블루 표준 제외 방법 ^(13)을 이용하여 생균 수를 카운트.
   주 :이 부유하는 단계는 상기 단일 세포 분리 효율을 향상시키는 것이 잘 해리 된 단일 세포 현탁액을 제조하는 핵심이다.

4. 단일 세포 클론의 분리 및 배양

1. X10 2.5 - 2.2의 농도 부하 세포 현탁액 50 μL를 106 세포 / ㎖.
   주 : 세포 현탁액 로딩은 마이크로 피펫에 기포를 도입하지 않도록 정지 및 정지 제 위치에 유지 될 필요가있다.
2. 고르게 세포 전체 마이크로 채널을 채우기 위해 입구 구멍을 통해 세포 현탁액의 또 다른 50 μl를로드합니다.
3. 입구 및 출구 구멍에 액 적을에서 정수압에 의한 유동을 방지하기위한 플러그 (3 mm 길이 1 mm 직경 잘라 나일론 낚싯줄)와 배출구를 밀봉.
   주 : 플러그 사용 전에 조직 배양 후드 안쪽 UV 살균 하였다.
4. 문화 매체와 1 ㎖의 멸균 주사기를 채워 그것에서 기포를 배출하고, 주사기 펌프를 설정합니다.
5. 23 G 무딘 바늘과 폴리 tetrafluoroethene (PTFE) 튜브를 통해 PDMS 장치의 입구 구멍 매체로드 주사기를 연결합니다.
6. 콘센트 구멍 모두에서 플러그를 제거아우 2 분의 시간 간격이 세포들이 중력에 의해 단일 ​​셀 캡처 웰에 정착 할 수 있도록한다.
7. 시린지 펌프 (600)에 의해 구동 μL / 분의 유속으로 배양액 300 μL로 캡처되지 세포를 씻어.
8. 장치를 안정화 2 분 동안 기다린 폐쇄 배양 시스템을 형성하기 위해 플러그 입구 및 출구 구멍을 밀봉.
9. 배양 마이크로 웰에 캡쳐 된 단일 세포를 전송할 손으로 장치를 플립.
10. 100-mm 조직 배양 접시에 PDMS 소자를 배치하고, 마이크로부터 배양액 증발을 방지하기 위해 장치의 주위에 멸균 PBS 10 ㎖를 추가한다.
11. 단일 세포의 클론 문화에 대한 기존의 세포 배양 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO _2, 95 % 습도)에 배양 접시를 이동합니다.

5. 문화 매체 보충

1. 배양 한 후 (D), 셀 (PR)을 향상시키는 새로운 배지로 PDMS 장치에서의 배양 배지를 대체oliferation.
2. 다음 단계를 수행하는 동안 미세 기포로 도입되지 않도록 입구 및 출구 구멍 부분 근처 PDMS 소자 위에 배지 두 방울을 놓는다.
3. 입구와 마이크로 채널의 양단 근처 PDMS 소자의 상부 및 마이크로 채널의 배출구로부터 2 구멍 펀치.
   참고 : PDMS 장치의 전체 두 개의 레이어를 통해 펀치하지 마십시오 대신에, 단지 PDMS의 상부층을 통해 펀치.
4. 23 G 무딘 바늘과 PTFE 튜브를 통해 입구에 신선한 매체를 포함하는 1 ML의 플라스틱 주사기를 연결합니다.
5. 오래된 배지를 교체 5 분 동안 장치에 120 ㎕의 신선한 배지를 흐른다.
6. 입구를 밀봉 구멍 콘센트 및 세포 배양 용 인큐베이터에 장치를 반환 개의 플러그를 삽입한다.
7. 5.5 단계 5.4를 반복 한 다음 밀봉 플러그를 제거하여 배지를 문화의 기간 동안 매 2 일을 새로 고칩니다.

결과

단일 세포 분리 및 배양 용 마이크로 유체 플랫폼은 마이크로 웰 어레이의 두 세트 (도 2A)와 마이크로 채널 (200 ㎛의 높이)를 포함한다. 마이크로 웰 어레이의 두 세트 캡처 웰 (직경 25 μm의 깊이에 27 μm의) 각각 단일 세포의 분리 및 문화에 대한 문화 웰 (직경 285 μm의 깊이에서 300 μm의), 각 되나된다 탑 뷰 (도 2B)에서 볼 때 캡처 - 웰 배양 웰의 중?...

토론

마이크로 웰 기반 장치 시스템은 ^{6,14 그러한 6 트래핑} 대규모 단일 셀 및 단일 조혈 줄기 세포 증식 ¹⁵ 단일 세포 조작 및 분석을 위해 사용되어왔다. 물론 크기, 개수, 형상 비록 특정 애플리케이션을 위해 조절 될 수 있으며, 웰의 크기가 증가 될 때 단일 세포 분리 효율은 항상 노출되어있다. ^9,15

마이크로 웰의 크기가 세포의 확산과 성장을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumin (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basal medium	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Plastic syringe (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge blunt needles	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm