JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

Abstract

המפרט של תאי hemogenic האנדותל מן האנדותל של כלי דם עוברי מתרחש בתקופות התפתחותיות קצרות בתוך רקמות שונות, והוא חיוני עבור הופעתה של HSPC הסופי מן צק חלמון murine הנוסף העוברי, שליה, כלי טבור, ואת עוברי האאורטה-בלוטת מין-הכליה ( באזור AGM). האופי החולף והגודל קטן של אוכלוסיית תא זה הופך הבידוד לשחזור שלה כימות זהירה ויישומים ניסיוניים קשה מבחינה טכנית. הקמנו תא קרינת מיון מופעל (FACS) פרוטוקול מבוסס לבידוד בו זמני של תאי hemogenic האנדותל HSPC בזמנים הדורים לשיאם צק החלמון ואת AGM. אנו מדגימים שיטות לנתיחה של שק החלמון ורקמות AGM מעוברים העכבר, ואנחנו מציגים תנאים לעיכול רקמת אופטימיזציה נטיה נוגדן להישרדות התא מקסימלי לפני זיהוי ואחזור באמצעות FACS. נציג FACS anaמגרשי תמוגה מוצגים המזהים את תא hemogenic האנדותל פנוטיפים HSPC, ולתאר assay מבוסס methylcellulose להערכת הפוטנציאל להרכיב בדמם ברמה משובטת.

Introduction

מערכת דם פונקציונלית מחייבת פיתוח המקביל של כלי דם ותאי דם. בשלבים המוקדמים של פיתוח דם (hematopoiesis הפרימיטיבי), מקורם של erythroblasts נשאר התווכח 1 במרץ. לעומת זאת, בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות תאי הדם (hematopoiesis סופי), זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי HSPC רב השושלת להתעורר מתאי אנדותל כלי הדם מיוחדים לרכוש דם להרכיב פוטנציאל (תאי אנדותל hemogenic) בתוך שק חלמון, השליה, וכן AGM 2-5, כמו גם את vitelline וכלי טבור, את endocardium העוברי 6, וראש כלי דם 7. המפרט של תאי hemogenic אנדותל בתוך רקמות הברורות אלה מתרחש בשלבים מסוימים של פיתוח; למשל, בתוך שק החלמון ב ~ E8.25 ובתוך AGM ב ~ E10 8-12. עם זאת, גם במהלך חלונות התפתחותיים ספציפיים אלה, האוכלוסייה של אנדו hemogenicתאים thelial מייצג חלק קטן של כל תאי האנדותל (1 - 3% שק החלמון ותאי האנדותל AGM) 11,12. תהליך "מפרט" hemogenic אנדותל תא הוא קריטי עבור בעכברים, כמו גם אדם, hematopoiesis. תאים Hematopoietic הוכחו ניצן מן האנדותל של כלי שק חלמון לבין אבי העורקים בעוברים אנושיים 13, וכמה מעבדות הוכיחו כי ייצור תאי דם מתאי גזע פלוריפוטנטיים האדם דורש תא האנדותל 14-16 ביניים. לכן, הגדיר את הפנוטיפ של תאים בעכברי hemogenic אנדותל והבנת אירועים המולקולריים להוביל להתפתחותם מודל זה חי אמור להקל במרדף אחר טכנולוגיות במבחנה עבור דור של תאי hemogenic אנדותל מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם. בתורו, פיתוח העתידי של גישה עבור דור בקנה מידה גדולה של סוגי תאי דם בדיל מן HSPC רב שושלת - עצמם דרעיved מתאי גזע אנושיים pluripotent באמצעות תא hemogenic אנדותל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ביניים - יצטרך פוטנציאל טיפולי מדהים עבור המטולוגיות, האונקולוגיים ורפואה רגנרטיבית. לקראת מטרה זו, הגדרנו את הפנוטיפ של תאי hemogenic אנדותל, ברמה משובטת, בתוך החלמון murine צק 11 ו AGM 12, שני אתרים גדולים של ייצור HSPC הסופי במהלך embryogenesis. כמו HSPC בתוך מח עצם בוגר 17, תאי אנדותל ומאפיין בזרימה לצבוע Hoechst תערוכת HSPC hemogenic עובריים ולכן מופיע בתוך "האוכלוסייה בצד" (SP) של תאים על מגרש FACS 5,11,12 (כפי שמוצג באיור 3). בנוסף, אנו גם הראו כי תאי אנדותל hemogenic להביע סמנים של שני אנדותל ותאי גזע (Flk1 ו cKit, בהתאמה), אך אינם מבטאים את סמן השושלת hematopoietic, CD45 5,11,12. לכן, תאים hemogenic האנדותל יכול להיות הזיהויified ומבודדת על ידי FACS כמו Flk1 + / cKit + / תאים CD45- SP, ואנחנו הראו כי תאים אלה להצמיח HSPC הכלול בתוך שבריר Flk1- / cKit + / CD45 + SP של שק החלמון ותאי AGM 5,11,12. תאי אנדותל Hemogenic ו HSPC ניתן לזהות ומבודד מן שק החלמון או רקמות AGM שנקטפו משני עוברים מורדמים טרי, או מעוברים בתרבית למשך עד 48 שעות בתרבות העובר vivo לשעבר (כמתואר באיור 1). Ex vivo התרבות מאפשר סלקטיבית טיפול מקדים של עוברים פרטניים עם סוכנים תרופתיים, ומאפשר גם ביטוי חולף של transgenes הרצוי (כלומר, על ידי תמרת lentiviral). זיהוי FACS של תאי אנדותל hemogenic ו HSPC מהפעלת השיטה המתוארת במסמך זה יכול לשמש כמדד כמותי של פיתוח hematopoietic סופי במודלים של עכברים מניפולציה גנטית; גם ניתן לאחזר את התאים עבור היישומים הבאים הניסיונות, כוללים-FO דםמבחני rming, ניתוח ביטוי, והשתלות.

בנושאים בעלי חיים: שימושי שיקולים אתיים

גוף של ספרות גוברת הקים את תרומתו החשובה של תאי אנדותל hemogenic להיווצרות HSPC בשלב hematopoiesis הסופי של התפתחות עוברית. עם זאת, גם במצב רגיל וגם אותות המקדמים מפרט של תת-אוכלוסייה של תאי אנדותל כלפי גורל hemogenic להישאר ממעטים להבין, ולכן לא ניתן חיקה עדיין בסביבה חוץ גופית. אכן, הטכניקות המתוארות במאמר זה נמצאים כעת בשימוש על ידי המעבדה שלנו וקבוצות אחרות כדי לשפר את ההבנה של תחום הפיתוח hematovascular, שיאפשר גישה עבור vivo לשעבר מפרט תא hemogenic האנדותל וייצור HSPC אולי יום אחד להיות מפותח. עד אז, לעומת זאת, בתחום נשאר תלוי רקמות עיקריות מן wild-type (וגןעוברי עכברים מהונדסים tically) להשיג שצוינו תאי hemogenic האנדותל HSPC למחקר נוסף. תאי אנדותל Hemogenic ו HSPC ניתן לזהות באופן אמין מבודד E8.5 או (10 - 12 זוגות somite) שק חלמון או E10.5 (35 - 40 זוגות somite) AGM 11,12. בשל המחסור היחסי של תאי אנדותל hemogenic (בדרך כלל מייצג 1 - 3% של תאים הכולל אנדותל 11,12 בתוך רקמות אלה) וריכוז רקמות מן מרובים (~ 8 - 10) להמלטה לתוך מדגם יחיד מומלץ מאוד כדי להשיג מספיק תאים לניסויים הבאים. אימות שתאי hemogenic האנדותל HSPC זוהו בהצלחה ומבודדת ניתן להשיג על ידי התרבות של תאים לאחזר בתנאי להשרות התמיינות hematopoietic. בתנאים אלה, תאי אנדותל hemogenic ו HSPC יפגינו בידול hematopoietic רב השושלת, וכתוצאה מכך הופעתו של מושבות המכילות eryאבות throid (BFU-E), גרנולוציט ואת אבות מקרופאג (CFU-GM), ו גרנולוציט, כדורית, מקרופאג, מושבות אבי megakaryocyte (-GEMM CFU).

Protocol

משפט ואתיקה: הפרוטוקול המפורטים להלן נבדק על ידי, והוא מציית להנחיות, הטיפול בבעלי החיים המוסדי של אונ' ייל ועדת שימוש.

1. העובר כולו תרבות אקס V איבו ללימודי שק החלמון (אופציונלי)

  1. להרדים סכרים בהריון E7.0 - E7.5, ולהסיר קרני הרחם בתנאים סטריליים, כמתואר ביתר פירוט להלן (שלבים 2.4 - 2.7).
  2. עוברים כולו נפרד (עם שק החלמון שלם 12) מן decidua שמסביב, להשעות ב 50 מ"ל סרום עכברוש שלם 50 מ"ל צינורות קלקר.
  3. עובר גז בקבוקים במשך 3 דקות עם 5% CO 2 מייד כפי שתוארו לעיל 12,18. חזור על שלב זה לאחר 24 שעות אם culturing עובר 24 - 48 שעות.
  4. מדגירים מתגלגל תרבות 37 ° C עד 48 שעות.
    הערה: עובר ניתן לטפל vivo לשעבר עם סוכנים תרופתיים (כלומר, מעכב Notch DAP.חלבוני T 12) או מסיסים (כלומר, פיברונקטין 19) דרך דגירה מראש של עוברת עד 2 שעות במדיום תרבות המכילים גורמים כאלה, או באמצעות תוספת של אלה גורמים עד בינוני התרבות מתגלגל לכל האורך של התרבות לשעבר vivo פרק זמן. ביטוי גנים ניתן להשפיע העוברים על ידי הדגירה טרום של עוברים עם lentivirus titered אופטימלית עבור שעה 2 12. וסקולרית צק חלמון ופיתוח hematopoietic ניתן לנטר בזמן אמת באמצעות עכברי כתב מהונדסים וטכניקות הדמיה אופטיות.

2. Dissection של שק חלמון (י"ש) או אבי העורקים-בלוטת המין-כלית (AGM) מהעכבר עוברים

  1. לעקר ספסל במעבדה על ידי ריסוס ונגב את כל המשטחים עם אתנול 70% כדי להפחית את הזיהום בתרביות תאים עקב. הוסף underpad סופג על פני ספסל מעבדה.
  2. לעקר מכשירי ניתוח עם 70% אתנול. מכשירי ניתוח מומלץ שתי כוח # 5 ישרps, ומספריים ישר אחד 8.5 ס"מ.
  3. אם עובדים עם עוברים מתרבות vivo לשעבר, להסיר בזהירות עוברים כולו מ- 50 מ"ל צינורות פלקון והמשך מיד לשלב 2.8. אחרת, לדלג על שלב זה והמשך לשלב 2.4.
  4. להרדים סכר בהריון בגיל עוברי מתאים (E8.5 אם י"ש קציר; E10.5 אם AGM קציר).
    הערה: הטכניקה המתוארת מעסיקה גישת המתת חסד כפולה שיטה - מינון קטלני של הרדמה נדיפים ואחריו נקע בצוואר רחם מכאני - כדי למזער את כאב חי ומצוקה, ועל מנת להבטיח מינימאלי סיום פולשנית ואנושי של בנושאים בעלי חיים. טכניקה משולבת זו להמתת חסד מכרסם קטן מומלץ על ידי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית כאשר היא מבוצעת על ידי חוקר מנוסה ומיומן (הנחיות AVMA עבור המתת חסד של בעלי חיים: 2013 Edition).
    1. להרדים העכבר באמצעות מנה קטלנית של isoflurane (> 5% ב O 2) עבור 3 - 5 דקות. (CAUTION: Isoflurane היא נשימתית רעילה; להשתמש תחת במנדף כימי עם ציוד מגן אישי נשימה מתאים.)
    2. בעקבות חשיפת העכברים isoflurane, לבדוק לפחות שלושה סימני רמת הרדמה - אובדן רפלקס ליישר, אובדן רפלקס קמצוץ הבוהן, והפחתה של קצב הנשימה - כדי להבטיח הנבדקים השיגו מטוס הרדמה עמוקה לפני שתמשיך עם המתת חסד מכני.
    3. Cervically לנקוע סכר לגרום למוות במהירות.
  5. מניח פרקדן סכר מורדם על underpad בנדיבות לרסס בבטן תחתונה עם אתנול 70%.
  6. לעשות חתך אנכי לאורך קו האמצע של דופן הבטן התחתונה. הפוך נוסף ~ 1 חתכים אופקיים אינץ הארכת ימין ועל שמאל מנקודת האמצע של החתך האנכי, ואת לנתח משם את דופן הבטן לחשוף קרן רחם תקינה לחלוטין והשאיר כל עוברי gestating מרובים המכילים.
  7. בעזרת מלקחיים, להחזיק באחת משתי קרנות הרחםולהשתמש מספריים כדי להפריד אותו mesometrium. מניח גזור רחם על קרח תמיסת המלח המאוזן של האנק סטרילית (HBSS) בצלחת בתרבית רקמת קלקר 60 מ"מ. חזור על פעולה עבור קרן רחם אחרת.
  8. תחת מיקרוסקופ לנתח אור רגיל, להשתמש במלקחיים כדי להתרחק שכבת השרירים של שלפוחית ​​הרחם כדי לחשוף את שק ההיריון הבסיסית decidua. לבודד י"ש (איור 2 א) על ידי הסרת השק בעדינות מן העובר הסגור. הסר י"ש רקמות מעובר נאות על המקור העוברי של כלי vitelline.
  9. כדי לבודד את AGM, להסיר את י"ש ו transect העובר מתחת לרמה של הלב forelimbs וזורקים באזור החזה והראש. לאחר מכן, transect העובר רק מתחת לרמה של hindlimbs ולהסיר ולסלק את רקמת הזנב. הסר את hindlimbs ורקמות גחון עודפים מהמדור הנותר, אשר מכיל את AGM (איור 2 ב).
  10. בריכת י"ש או רקמות AGM מעוברים מרובים ולאחסןעל הקרח HBSS + (HBSS בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, ו -0.3 מ"ג / מ"ל ​​L- גלוטמין) בצינור 1.5 מ"ל נקי.

3. עיכול של רקמות ראשוניות לתוך השעית תא בודדת

  1. צינור צנטריפוגה המכיל י"ש שנקטף או רקמות AGM למשך 5 דקות XG ב 2000 ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הסר supernatant רקמות גלולה ב 1 מ"ל של או 0.05% (עבור י"ש) או 0.2% (עבור AGM) סוג collagenase השנייה מדולל HBSS +. דגירה למשך 30 דקות באמבט מים ב 37 ° C, היפוך צינור כל 5 דקות כדי לערבב.
  3. בעדינות לנתק את הרקמה באופן מכני על ידי העברת מדגם 10 פעמים באמצעות פיפטה P1000. אם מתקשה aspirating רקמות חלקית מתעכל, נשא קצה פיפטה ניתן התרחבו ידי ניתוק ~ 5 מ"מ של קצה עם זוג מספריים.
  4. צנטריפוגה מדגם במשך 5 דקות XG ב 2000 ב 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל קר כקרח HBSS +.
  5. לעבור מדגם באמצעות 70 &# 956; מסננת תא מ.
  6. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ידנית או אוטומטית.
  7. צנטריפוגה מדגם במשך 5 דקות XG ב 2000 ב 4 מעלות צלזיוס. מדגם גלולה ב DMEM + (4.5 גרם / גלוקוז L בינוני הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, ו -0.3 מ"ג / מ"ל ​​L- גלוטמין) מראש מעלות צלזיוס חימם עד 37 כך התאים בריכוז סופי של 1 x 10 6 תאים / מ"ל.

טיפול 4. של תאים עם חומצות גרעין דיי וסימון עם נוגדנים fluorescently מצומדת

  1. Aliquot לפחות 100 μl של מדגם (1 x 10 5 תאים) לתוך צינורות טריים 1.5 מיליליטר עבור דגירת נוגדן.
  2. כלול את הדוגמא הבאה וצינורות שליטה נדרשים: בלא כתם; cKit-APC בלבד; CD45-FITC בלבד; CD31-PE בלבד; Flk1-PECy7 בלבד; Hoechst 33,342 בלבד; Hoechst 33,342 בלבד + Verapamil; לדוגמא (מקבלת את כל הצבעים, לא יקבל Verapamil). השתמש מינימום של 1 x 10 5 תאים 100 μl עבור צינורות שליטה.
    הערה: נפח גדול יותר של תאים ניתן להוסיף הצינור לדוגמא באותו ריכוז כדי למקסם את התשואה של EC Hemogenic מיון HSPC.
  3. הוסף Verapamil מדולל 95% אתנול (ראה דיון על רציונל) אל "Hoechst 33,342 בלבד + Verapamil" צינור מלא לריכוז סופי של 50 מיקרומטר. דגירה כל הצינורות במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. (זהירות: Verapamil הוא סוכן חסימת תעלות סידן חזק והוא רעיל מאוד טפל בכפפות.).
  4. להוסיף Hoechst 33342 לשליטה "Hoechst 33,342 בלבד", לשליטה Hoechst 33342 + Verapamil בלבד, אל הצינור "לדוגמא" לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה כל הצינורות עבור שעה 1 ב 37 ° C, מוגן מפני אור. לערבב בעדינות על ידי היפוך כל 15 דק '. (זהירות: Hoechst 33342 הוא צבע גרעיני רעיל צריך להיות מטופלים עם כפפות).
  5. צנטריפוגה כל samples 5 דקות XG ב 2000 ב 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant ו resuspend כדורי תא בריכוז של 1 x 10 מ"ל 5 תאים / בקור HBSS +.
  6. הוספת נוגדנים מצומדות fluorescently צינורות שליטה נוגדנים רק הולם, וכדי הצינור "לדוגמא" לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה על קרח למשך 30 דקות, מוגן מפני אור.
  7. צנטריפוגה כל הצינורות במשך 5 דקות XG ב 2000 ב 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 μl קר כקרח HBSS. דגימות מסננים דרך מכסה המסנן רשת של 5 מ"ל עגול צינור FACS קלקר בתחתית ולאחסן על הקרח, מוגן מפני אור, עבור FACS מיידית.

זיהוי 5. ובידוד של לתאי אנדותל Hemogenic ו HSPC ידי FACS

הערה: פרוטוקול זה היה מותאם באמצעות מערכת BD FACSAria 5-לייזר מצויד לייזר UV 100 MW 355 ננומטר, לייזר 200 MW 405 ננומטר ויולט, לייזר כחול ננומטר 200 MW 488, לייזר ירוק ננומטר 200 MW 532, וכן 150 MW 637 האדום ננומטרלייזר. תאים מוינו ב PBS סטרילית כמו נדן נוזל ובתנאים ספטית, ואת דרך נחיר 100 מיקרומטר עם קצב הזרימה מוגדר לחץ מדגם של 1 כך לכל היותר 1,500 - 2,000 אירועים נרכשים לשנייה כדי להקטין את הלחץ בתא.

  1. תחת הגדרות אלה שתוארו לעיל, השתמש צינורות בקרת צבע "בלא כתם" ורווקים לייעל בעוצמות לייזר סדרן תא FACS ולקיים בקרת פיצוי רפאים צבעוניות על פי הוראות היצרן. השתמש קדימה פיזור הצד לבצע תא חי ואת כָּפִיל אפליה מאירועים כוללים (ראה הוראות יצרן לפרטים נוספים).
    הערה: פרוטוקול זה בדרך כלל תוצאות ~ 70 - 80% תאי קיימא. אם בעיות הם נתקלו עם כדאיויות תא נמוכות, להבטיח כי רקמות בתחילה הם גזורים במהירות בתקשורת קרה כקרח, וכי כל פעולות פרט לאלה ציון אחר מתבצעות על קרח, עם pipetting העדין כדי למזער מות גז ותא(ראה דיון מפורט יותר על שמירה על כדאיויות תא).
  2. השתמש עלילה ליניארית בקנה מידת הפרש של Hoechst אדום לעומת הקרינה הכחולה Hoechst לזהות אוכלוסייה בצד (SP) אירועים (איור 3 א). השתמש "Hoechst 33,342 בלבד + Verapamil" שליטה כביקורת שלילית על מנת לוודא כי השערים נמשך כראוי למדגם. SP יופיע בתור כתף בצד שמאל של התאים הלא-SP, ו תופחת בבקרה Verapamil שטופלו. האוכלוסייה הלא-SP ישמש לזהות EC הלא hemogenic (איור 3 ב).
  3. צור מגרשי קרינת הפרש נוספים (יומן בקנה מידת צירים) ולהסיק שערים בתו של SP לזהות תאי אנדותל hemogenic (איור 3 ג-ה).
    הערה: תאי אנדותל Hemogenic צדודית כמו Flk1 + / cKit + / תאים CD45- SP (איור 3D), ו HSPC הם Flk1- / cKit + / CD45 + תאים SP (איור 3E). ג אנדותל Hemogenicאמות ניתן לנתח במקביל הלא hemogenic תאי אנדותל, אשר מזוהים על פי גישה זו כמו CD31 + / CD45- תאים שאינם SP (איור 3 ב).
  4. אחזור תא האנדותל hemogenic או חלק HSPC על methylcellulose המכילים צלחות לתרבות hematopoietic (ראה להלן), או לתוך מאגרים אחרים לעיבוד שלאחר מכן וניתוח.

6. בידול Hematopoietic בתרבות

  1. הוסף 0.5 מ"ל (135 μl / 2 ס"מ) התקשורת והתרבות methylcellulose מבוססי hematopoietic למספר הרצוי של בארות צלחת בתרבית רקמה 24 גם בטמפרטורת החדר. הוסף 0.5 מ"ל מים סטריליים לתוך בארות בשימוש כדי למזער אידוי. הכן טרי לשמור בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
  2. מיין 1 - 10 תאים לניתוח המשובטים, או עד 1,000 תאי אנדותל hemogenic (Flk1 + / cKit + / CD45- תאים SP) או HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + תאים SP) להרחבת והבחנה בתפזורת ישירות לתוך הבאר כל שלצלחת המכילה methylcellulose. היווצרות מושבה מזוהית כ 10 - 20%.
  3. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, השתמש טיפ P1000 עם קצה גזוז להרחיב נשא שלה, כדי resuspend כל טוב בעדינות של התקשורת methylcellulose זורעים 2 - 3 פעמים, מקפיד להימנע יצירת בועות. הדבר מבטיח ההשעיה של תאים ממוינים לתוך methylcellulose למחצה לצמיחה אופטימלית.
  4. דגירה צלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עד 2 שבועות.
  5. צג תרבויות תא בודד עבור היווצרות של מושבות תאים hematopoietic הבדיל לאורך זמן (איור 4). ציון בארות עבור מספר וסוג מושבות hematopoietic הבדיל ב בימים 1, 3, 7, ו -14 על ידי השיטה (ים) המפורטים להלן בשלב 6.7.
    1. צלחות ציון ביום 1 כדי לאשר confluency כדאיות המשך של התאים הממוינים.
    2. במשך היום 3, לבדוק היווצרות מוקדמת של מושבות תאי אנדותל hemogenic חסידות עם "מרצפותהטון "מורפולוגיה (ראה גולדי et al. 11 ואת מרסלו et al. 12 לייצוג של מורפולוגיה יום 3).
    3. לפי ימים 5 - 7, לבדוק היווצרות צבירי HSPC מעוגלות בבארות המכיל מסודרים EC hemogenic. HSPC יש לשים לב סמוך בברוטליות EC hemogenic מוצגת מורפולוגיה תא האנדותל "מרוצפת".
      הערה: תאי אנדותל Hemogenic צריכים ליצור מושבות hematopoietic (נקבעו על ידי מספר מושבת hematopoietic), וצריכים להפגין יכולת בידול רבה שושלת (נקבעה על ידי תצפית של סוגי מושבה מרובים מתא בודד). ראינו בעבר כי ~ 20% של hemogenic EC או HSPC לאחזר באמצעות FACS לשרוד כדי ליצור הבחנה מתרבים במושבות hematopoietic ב methylcellulose 11.
  6. כדי להעריך היווצרות המושבה ידי מיקרוסקופ שלב:
    1. דמיינו ולספור מושבות und בהגדלה נמוכהאה מיקרוסקופ אור שלב, ולזהות BFU-E, CFU-GM, ו CFU-GEMM מושבות ידי המורפולוגיה המושבה, כפי שתואר על ידי גולדי et al. 11.
  7. כדי להעריך היווצרות המושבה ידי מורפולוגיה תאים:
    1. מושבות בודדות לשאוב מפני שטח methylcellulose לתוך טיפ P1000 עם הסוף גזוזות להרחיב לשעמם. זה הופך לפשוט יותר שאיפה של מדיום methylcellulose הצמיג ומבטיח אחזור מוצלח של המושבה.
    2. Resuspend הרים מושבות לתוך 200 מ"ל HBSS ספין על גבי זכוכית נושאת באמצעות cytocentrifuge ב 28 XG במשך 5 דקות.
    3. תקן שקופיות מתנול 100% במשך 5 דקות (זהירות: מתנול רעיל אמור לשמש רק במנדף כימי עם אוורור מתאים וציוד מגן אישי).
    4. לצלול שקופיות כתם 0.04% Giemsa במשך 20 דקות (זהירות:. צביעת גימזה מכילה מתנול השתמש במנדף כימי עם אוורור מתאים ואדםאל ציוד מגן).
    5. יש לשטוף שקופיות מים ללא יונים.
    6. הר שקופיות עם coverslips, ותמונה בהגדלה גבוהה תחת מיקרוסקופ אור רגילה, השוואת מורפולוגיה תאים לזה שנצפה קלסי בתאי hematopoietic ממח עצם בוגר כי הם בתרבית תקשורת methylcellulose. לדוגמאות, עיין בהוראות היצרן.
  8. כדי להעריך היווצרות מושבה ידי תא ביטוי של סמני שושלת hematopoietic ידי FACS:
    1. הוסף 2 מ"ל של HBSS היטב בכל צלחת 24-היטב המכיל מושבות בתרבית על 0.5 מ"ל methylcellulose (כלומר, לדלל methylcellulose מניות זמינים מסחרית 1: 4). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב, ולהעביר צינור חדש (ים).
    2. צנטריפוגה מדגם XG ב 2000 למשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות microcentrifuge בטבלה העליונה סטנדרטי.
    3. הסר supernatant ו resuspend תא גלולה (ים) ב 1 מ"ל HBSS +, איגום דגימות אם רוצים כל כך.
    4. CentrifuGE מדגם XG ב 2000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. הסר supernatant ו resuspend תא גלולה (ים) ב 400 μl HBSS +.
    6. מדגם Aliquot לארבעה 1.5 מיליליטר צינורות כדלקמן: בלא כתם; B220-FITC בלבד; GR-1-FITC בלבד; Ter119-FITC בלבד.
    7. הוסף נוגדן fluorescently- מצומדות צינור המתאים לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    8. צנטריפוגה מדגם XG ב 2000 למשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר supernatant ו resuspend התא גלולה ב 0.5 קר כקרח מ"ל HBSS.
    9. לנתח כל דגימה על ידי FACS לביטוי של כל סמן השושלת hematopoietic: B220 מסמן תאי- B 20; GR-1 סימני תאים מיאלואידית 21; Ter119 סימני תאים erythroid 22.
      הערה: נוגדני מיקוד נוספים סמני שושלת hematopoietic אחרים שיוכנסו גישה זו, אם רוצים כל כך.

תוצאות

תיוג מוצלח של תאי hemogenic האנדותל HSPC מ י"ש עוברי או AGM יניבו מגרשי פיזור FACS דומים מגרשי הנציגים מוצגים באיור 3. בעקבות תאים סטנדרטיים חיה כפיל אפליה על ידי קדימה פיזור בצד (לא מוצג), אוכלוסייה בצד (SP) אירועים הם דמיינו ב עלילה לינארי דיפרנציאלי Hoechst האדום לעומת Hoechst כחול בהעדר Verapamil בתור "כתף" שמאל העביר מהרוב של אירועים (לא SP) (איור 3 א). כאשר שער SP מופנה כראוי, תאי SP ייצגו כ 1 - 3% של תאי י"ש קיימא הכוללים 3 - 5% של אירועי AGM קיימא כוללים. טיפול Verapamil אמור לגרום> 50% עיכוב של אירועי SP קשר למקור רקמה (איור 3 א, לוחות עליונים). קבענו בעבר כי באוכלוסיות אחרות המופיעות מחוץ הכתף SP אבל נחסמים גם על ידי verapamil הם Ter119 חיובי erythrאובלסט, ולכן אינם נכללים האוכלוסייה SP שלנו 5.

בהשוואת SP, תאים שאינם SP מזוהים באשכול הצפוף של תאים סמוכים אל SP "הכתף" (איור 3 א). אוכלוסייה זו כוללת EC הלא Hemogenic אשר ניתן להבחין באמצעות CD31-PE לעומת העלילה הבת CD45-FITC (איור 3 ב), כמו CD31 + / אירועים CD45-. EC ללא Hemogenic הם בדרך כלל 2 - 5% של תאים שאינם SP מן AGM (איור 3B) או צק חלמון (לא מוצג), ומספרים גבוהים של תאים אלה ניתן למיין בחזרה בקלות יחסית.

לצורך זיהוי של HSPC ו Hemogenic EC, שערים הבת שאובים השבר SP, זיהוי CD45 + ותאי CD45-, שם CD45 + תאים הם בדרך כלל <20% של סך כל האירועים בשני AGM (איור 3 ג) או י"ש (לא מוצג). Hemogenic EC מזוהים ובהמשך מתאי CD45- לפער cKit-APC לעומת p הבת Flk1-PECy7הרבה כאירועי פעמים חיוביות, ובדרך כלל מייצגי 1 - 3% של אירועי CD45- כאשר מבודדים משני AGM (איור 3 D) או י"ש (לא מוצג). HSPC מזוהה רק מחלק CD45 + בתוך cKit-APC נפרד לעומת עלילת בת Flk1-PECy7 כמו Flk1- / cKit + תאים, וגם בדרך כלל מייצג כ 25 - 30% מהאוכלוסייה הקטנה של תאי CD45 + כאשר מתקבל משני י"ש (לא מוצג) או AGM (איור 3 E). לפיכך, הוא Hemogenic EC ו HSPC הוא נדירים במיוחד (~ 0.01% של אירועי תא כוללים), והיא מאפיינת עבור פרוטוקול זה לחזור כמה מאות של כל סוג תא גם כאשר רקמות מעוברים מרובים הם אספו. גייטס בחלקות הבת יש להקים תוך התייחסות לקבוצות ביקורת שליליות. כדי להבדיל בין מכתים נוגדן הספציפי שאינו ספציפי, שערים צריכות להימתח בתחילה בהתייחס גם שולט בלא הכתם (איור 3C), כמו גם דגימות טופל fluorescently- מצומדות בהתאמת אלוטיפ (IgG2a או IgG2B נוגדני שליטה) (לא מוצג). שליטה זו האחרונה הוכיחה כי מכתים הלא ספציפית הוא מינימלי על ידי פרוטוקול זה, ולכן בעוד אנו ממליצים נוגדנים ביקורת שוות אלוטיפ (למשל., IgG2a-PE או IgG2B-FITC) לשמש בתחילה לייעל את הגדרות סדרן FACS ולקבוע גבולות השער כמו כן, אנו מוצאים כי בקרות בלא כתם מספיקות כדי לאמת גבולות שער ואיכות ניסיון במהלך FACS לשגרת מיון. אם השערים נמשך כראוי, פיזור חיובי מינימלי צריך לשמור שערים חד או דו-חיובי בעת ההקלטה מפיקוח בלא כתם או אלוטיפ בהתאמה.

תאי אנדותל Hemogenic מן AGM ו HSPC לעבור התמיינות hematopoietic מעל 14 ימים של תרבות (איור 4 א) methylcellulose. חלקם היחסי של סוגי המושבה נצפה בדרך כלל אלהתרבויות תלויות מקור רקמה. תאי אנדותל Hemogenic מבודד מרקמות שק החלמון על עלייה תן E8.5-E9.5 כדי BFU-E, CFU-GM, ומעטים 5 CFU-GEMM, ואילו תאי אנדותל hemogenic מבודד מן AGM E10.5 להצמיח בעיקר CFU 12 -GEMM, למרות שושלות אחרות עדיין הם נצפו, כפי שמוצג באיור 4B (בחלונית הימנית העליונה). HSPC מבודד E10.5 AGM גם להצמיח בעיקר כדי CFU-GEMM על תרבות methylcellulose (איור 4 ב ', פאנל באמצע למעלה), אם כי תאים אלה יהיה גם להתמיין לסוגי המושבה hematopoietic אחרים גם כן. ללא hemogenic תאי האנדותל (CD31 + / CD45- הלא-SP) יש גם מצופים (איור 4 ב ', לוח ימני עליון). תאים אלו מראים אין צמיחה בתרבות hematopoietic לאחר 14 ימים.

מבחני כושר hematopoietic של סמן משטח הפרט להביע סוגי תאים, כולל תאים עם ובלי ביטוי hematopoieticnd אנדותל סמני CD31, Flk1, c-Kit, VE-CAD, CD41, CD45 ו בתוך שבריר SP של AGM ב E10.5 בוצע ולהפגין כי מושבה רבה שושלת פעילות להרכיב AGM E10.5 מוגבלת כדי CD31 +, VE-cadherin +, + c-Kit, תאי CD41 + ו- CD45 + SP 12. מעניין לציין, כי פעילות המושבה להרכיב צוינה בשני תאי FLK-1 + ו- FLK-1- תאי SP, אבל רק Flk1 + c-Kit + CD45- SP הולידו מושבות רבות שושלת באמצעות monolayer אנדותל המאופיין ביניים על ידי "הן מרוצף "מורפולוגיה תא האנדותל (איור 4 ב ', בחלונית השמאלית התחתונה) ועל ידי ספיגת דיל-AcLDL 12. יתר על כן, הביטוי של c-kit הוא הכרחי עבור פעילות hematopoietic של תאי AGM SP 12.

למרות שזה הוכח כי כמה אבות מיאלואידית יש מאפייני מורפולוגיים דומים בהשוואה לתאי אנדותל hemogenic, ובתאים מיאלואידית להביע CD45 ולא יכולים ליצור מושבות רבות שושלת במבחנה. HSPC גם ליצור מושבות רבות שושלת, אבל למרות תאים אלה CD45, הם חסרים FLK-1 ביטוי 12,23 ו להצמיח צבירי תאים מעוגלים ללא monolayer אנדותל בסיסי (איור 4 ב ', פנל ימני תחתון). לכן, האוכלוסייה נגדיר האנדותל hemogenic כמו (או, FLK-1 + / c-Kit + / תאי CD45-SP) מייצגים תאי אנדותל להרכיב דם פוטנציאל ויציב ביטוי גנים hematoendothelial, כולל Gata-1/2, Lmo2, SCL / טל-1, RunX-1, c-Kit, CD34, CD41, CD45 ו 11 כי הם ברורים מתאי גזע אבות היווצרות הדם, כמו גם עמיתיהם תאים שאינם hemogenic האנדותל שלהם.

figure-results-5653
איור 1. בסך הכל Workflow. בקיצור, עובר יוסר מן הסכרים בהריון, י"ש או רקמות AGM נקצרים. עוברים יכול להיות מתורבת אופציונלי ל -2 4 - 48 שעות vivo לשעבר לפני קציר רקמות. י"ש שנקטף או רקמות AGM מתעכל כדי השעית תא בודדת, aliquoted לתוך צינורות מלאי מדגם, וטופח על ידי הנוכחות של צבע Hoechst ו / או נוגדני fluorescently- מצומדות. Verapamil, מעכב תעלות סידן, משמש גם כדי ליצור שליטה שלילית חיונית לצורך האימות של gating המדויק של שבר SP. תאי אנדותל Hemogenic מזוהים על ידי FACS כמו Flk1 + / cKit + / CD45- SP תאים, בעוד HSPC נמצאים בתוך החלק היחסי של תאים Flk1- / cKit + / CD45 + SP; שני סוגי התאים מסודרים על methylcellulose עבור אישור של פוטנציאל hemogenic. בנוסף, אי-hemogenic תאי האנדותל יכול להיות מופלים (והוציא, אם רוצים כל כך) כמו CD31 + / CD45- תאים שאינם SP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

igure 2 "src =" / files / ftp_upload / 54,150 / 54150fig2.jpg "/>
איור 2. Dissection של י"ש ורקמות AGM. א) י"ש הוא גזור משם מעובר E8.5, והניח כולו לתוך סטרילי HBSS + לעיכול שלאחר מכן. ב) הגזע של עוברי E10.5 מבודד על ידי ביצוע חתכים אופקיים להלן הוא ניצני forelimb ו hindlimb. השנתי מופרד אז מן ניצני איבר מלקחיים באמצעות רקמות גחון. C) תמונות בהיר שדה להראות דיסקציה של שני י"ש ו AGM מעובר E10.5 (בסולם = 1 מ"מ). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-7514
איור 3. מגרשי נציג הוכחת היררכית שער עבור אפליהשל Hemogenic האנדותל נייד ים (Flk1 + / cKit + / תאים CD45- SP), HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP תאים), ואי-hemogenic לתאי אנדותל (CD31 + / אי-SP CD45-) על ידי FACS מ E8.5 י"ש או E10.5 AGM. בעקבות אפלית תא כפיל חיה של תאים משני י"ש (משמאל לוחות) או AGM (לוחות מימין) על ידי קדימה פיזור בצד (לא מוצג), א) האוכלוסייה בצד (שער SP) מופנה ומאומת על ידי ירידה משמעותית של שבר SP בבקרה השלילית שטופלה Verapamil. האוכלוסייה הלא-SP מזוהה באשכול הצפוף של תאים סמוכים אל SP. בכל החלקות הציג 20,000 אירועים מוצגים B) ללא hemogenic תאי אנדותל מזוהים CD31 + / תאים CD45- בתוך שבריר הלא-SP, ולייצג 2 -. 5% של תאים שאינם SP אם המתקבל AGM (המוצג ) או י"ש (לא מוצג). כדי הפליהminate Hemogenic EC או HSPC, C) שערים הבת שאובים השבר SP לזהות CD45 + ו- CD45- תאים. D) לצורך זיהוי של בתאי האנדותל hemogenic משני AGM (מוצג) או י"ש (לא מוצג), שערים בת נוספת נמשכים מן השבר CD45- להבחין cKit + (לעומת cKit-) ו Flk1 + (לעומת Flk1-) תאים. EC Hemogenic משני י"ש או AGM הם בדרך כלל ~ 1 - 3% האירועים CD45- E) HSPC מזוהים מן CD45 + חלק כמו cKit + ו- Flk1-, ובדרך כלל מייצגים 20 -. 30% של CD45 + תאים אם מסודרים מן AGM (המוצג ) או י"ש (לא מוצג). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-9351
איור 4. Visualization של בידול Hematopoietic הבא ותרבות של תאי האנדותל Hemogenic ו HSPC על Methylcellulose. א) טופס מושבות תאים בודדים מיון תוך 7 ימים של ציפוי על methylcellulose. פוטנציאל hematopoietic רב שושלת יכול להיות מאושר על ידי תצפית של סוגי מושבת hematopoietic מרובים, שזוהה על ידי הערכת מורפולוגיה מושבה ברורה 11. B) הדמיה מיקרוסקופית שלב של EC hemogenic מיון HSPC מן AGM (או י"ש, לא מוצג) להראות hematopoietic רב שושלת היווצרות המושבה לאחר 7 ימים של תרבות במדיום תרבות methylcellulose. ללא hemogenic EC מן AGM (או י"ש, לא מוצג) לא להפגין צמיחה בתנאים אלה. בהגדלה גבוהה יותר, תאים חסידים עם "מרוצף" קלסית מורפולוגיה תא האנדותל (חץ לבן) ניתן לראות והולידו אשכולות של תאי hematopoietic ב מבוי סתוםטורס של hemogenic EC; לא בתאי האנדותל כזה הם נצפו בתרבויות של מיון HSPC (בקנה מידה = 100 מיקרומטר). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

נותרו שאלות רבות ללא מענה בתחום פיתוח hematovascular - תחום הוא עדיין בחיתוליו בשל הקשיים הטכניים הטמון בלימוד אוכלוסיות תאים חולפים וקטנות העולות רק במהלך חלון התפתחותית מסוימות. הטכניקות המתוארות לעיל לשפר בחלק גדול מהקשיים הללו בכך שהוא מאפשר בידוד של תאים בודדים אפילו מתא hemogenic אנדותל ואוכלוסיות HSPC ברקמות עובריות בנקודות זמן התפתחותיים קריטיות באמצעות חומרים כימיים וציוד כי הם בדרך כלל זמינים ברוב המעבדות. הפרוטוקול שלנו גם מאפשר בידוד מקביל של שברי תא האנדותל הלא hemogenic מן י"ש ו AGM, אשר ניתן להשתמש בם עבור ניתוחים פרטיים, או כפי שולט עבור שבריר תא hemogenic האנדותל ניתוחים שלאחר מכן.

נקודת מפתח הבידוד של תאי אנדותל hemogenic בשיטה מבוסס FACS ססגוניות זה שיתוף ספקטרלי המתאיםmpensation וציור מדויק של שערים יחיד צבע. ככזה, הוא מומלץ מאוד שולט בלא כתם יחיד צבע להיכלל כל ריצות ניסיון, ושהם - יחד עם דגימות מטופלים עם נוגדני ביקורת שווה אלוטיפ - לשמש בתחילה להקים פיצוי ספקטרלי ראוי וציור השערים. עם זאת, הלא ספציפי המכתים הוא מינימאלי על ידי פרוטוקול זה, ובכך שולט בלא כתם יחיד צבע מספיק בדיקה שיגרתית של שערים פעם הגדרות סדרן FACS ממוטבים.

לא מדויק נמשכים שערי SP הם תופעה מדאיגה במיוחד עם הגישה המתוארת בדוח זה. מחקרים קודמים הראו כי תאי גזע מולטיפוטנטיים להפגין בזרימת מועדף של Hoechst 17 ​​אדום, ויצרו את הבסיס הפיזיולוגי עבור הופעתם SP ידי FACS. הראינו תאי אנדותל hemogenic כי ו HSPC נמצא באופן דומה בתוך שבריר תא SP 5,11. סמים כגון תעלות סידן בhibitor Verapamil לחסום התנהגות בזרימת לצבוע Hoechst זה בתאים SP באמצעות חסימה של מגוון של מובילי ההתנגדות multidrug הטרנסממברני. בשנת תאי גזע אבות היווצרות הדם, זה קורה בעיקר דרך טרנספורטר ABCG2 / BCRP1 24. בדרך כלל verapamil גורמים> 50% חסימה של SP, עם זאת, מידת הכולל של בזרימת Hoechst והסתימה לאחר מכן על ידי Verapamil לראות הוכחה להיות מושפעות מעיתוי התפתחותית, ככל הנראה בשל שינוי ביטוי של סוגי טרנספורטר המרובה multidrug עמידים עם דיפרנציאל Hoechst יכולת בזרימה, ורגישות Verapamil 5. לכן, מומלץ מאוד כי Verapamil שטופל Hoechst מוכתם שלילי מלא להיכלל standardly כדי להבטיח gating SP הנכון: אם שער SP מופנה כראוי, הפחתה נכרתה את מספר תאי SP צריכה להתגלות בדגימות מוכתמות Hoechst ב בנוכחות Verapamil.

הראינו בעבר כי מסודרתאים SP מ שק החלמון murine E9.5 יש ~ 80 - 90 היכולת לקפל יותר לייצר HSPC בתרבות hematopoietic מבוססי methylcellulose כשמשווים מספר תואם של unfractionated E9.5, הלא Hoechst מוכתם י"ש רקמות תאים 5 כולו. אפיון נוסף של SP הוכיח כי שק החלמון בעכברים במהלך hematopoietic מוקדם ופיתוח כלי הדם ב E8.0, יש ביטוי ניכר של VE-cadherin ו FLK-1, אבל ביטוי נמוכה של גזע (c-Kit) וסמנים hematopoietic (CD45). לפיכך, בשעה timepoint התפתחותי זה, בראשיתי (לא hemogenic) EC, המוגדר FLK-1 + / CD31 + / CD45- הלא SP תאים שולטים. משמרות פרופיל ביטוי זה כמו ביטוי סמן אנדותל פוחתת CD45 ועליות ביטוי c-Kit, בד בבד עם יכולת הגדלת ליצור HSPC במבחנה בין E9.5 ו -5 E11.5. הדבר מצביע על פעילות hematopoietic של רקמות י"ש מוכל בתוך SP, נהיה ברור ביותר בין E9.5 ואת E11.5, ו occurring דרך הפסד מתוזמן של מאפיינים האנדותל רכישה הדרגתית של יכולת hematopoietic. ככזה, ביטוי של מובילי ההתנגדות multidrug שיוצרים את הפנוטיפ SP מהווים סמן פנוטיפי חשוב של האנדותל hemogenic 5; למעשה, תאים שאינם SP מן AGM אינם מציגים דם יוצרי 12 פוטנציאליים. לכן, בידוד מוצלח של SP באמצעות מכתים Hoechst הוא י"ש ו AGM מבטיח כי תאים ימוינו מהתא לתא גזע hematopoietic של רקמות נתונות, מכתים הנוגדן הבא של תאים בתוך שבריר זה יאפשר אפליה של hemogenic (FLK -1 + / c-Kit + / CD45-) לעומת HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) אוכלוסיות 5,11,12. יתר על כן, זה כבר ציין בעבר כי CD41 + תאים בתוך SP של צק חלמון ורקמות AGM מסוגלים היווצרות מושבה רבה שושלת בתרבות methylcellulose המבוססת 11,12. אנו מגדירים תאי אנדותל hemogenic כמו Flk1 + c-kit + תא CD45- SPים באמצעות CD45 כסמן המיועד של השושלת hematopoietic ולא CD41 נתון שלנו בא לידי ביטוי של Flk1 ו CD45 הוא כמעט שוללות זו 5,11. זה מאפשר בידוד טהור של תאים בתוך SP, כי יש שני האנדותל (FLK-1) גזע מאפיינים (c-Kit) דרושים האנדותל כדי מעבר hematopoietic אבל שטרם עבר את השינוי הזה, כפי שנקבע על ידי בהעדר CD45 ב אלה תאים. זה יהיה שימושי לשקול-חלוקה תת מהאוכלוסייה HSPC, המוגדר FLK-1- / c-Kit + / CD45 + / תאים SP, לתוך Csf1r + (מקרופאג רקמות) ו Csf1r- (HSC) שבר כפי שדווח לאחרונה על ידי גומז ועמיתיו 25, כמו זה יספק רזולוציה גדולה של HSPC נכון מול אוכלוסיות אבי מקרופאג רקמות, אבל זה לא אמור להשפיע על שלמות של שבריר התא hemogenic האנדותל אשר בידוד גיבשנו מאז Csf1r הוא סמן של אבות מקרופאג 26.

Hemogתאי אנדותל enic הם תת-אוכלוסייה נדירה בשני י"ש ו AGM (המהווים 1 - 3% של תאי אנדותל), ולכן אתגר גדול במחקרם של השניים היא תשואה התא מספיק עבור יישומים הבאים. פרוטוקול זה גורם בדרך כלל 70-80% של התאים הנותרים קיימא על ידי הזמן של מיון, מעין תא האנדותל hemogenic טיפוסי מרקמות ונקווה שמקורם בעוברים מרובים עשוי להניב רק כמה מאות תאים אפילו בתנאים אופטימליים עם רק 10-20% של לאחזר תאים מוטבע לתוך מושבות בייצור methylcellulose. כדי למקסם את מספר הסלולרי מיון, מומלץ מאוד כי החוקרים לנקוט בצעדים כדי להבטיח רקמות כדאיות התא לאורך כל צעד של ההליך: רקמות צריך להיות גזור במהירות ונקווה, דגימות צריך להיות כל הזמן על הקרח בכל הזדמנות אפשרית. דוגמאות צריכות להיות מוכנות טריות מייד לפני מיון FACS, מיון לתוך צינורות אוסף המכילים תוכן בסרום גבוה, או ישירות לתוך תרבות methylcellulose כמו לתארד 'לעיל. אם בעיות נמשכות כדאיות, צינורות איסוף יכולים להיות גם מראש מצופה עם סרום כדי לשפר את הישרדות תא מיון נוסף. אם תשואת תא hemogenic אנדותל נותרת נמוכה, מח עצם מבוגר או-זמינים מסחרי חרוזי fluorophore מצומדות יכול לשמש פיצוי רפאים במקום של בקרות צבע יחיד רקמת נגזרות העובריות כפי שתתוארנה בהמשך. אם תאים ממוינים מיועדים תרבות, תאי אנדותל hemogenic ו HSPC יש למיין ישירות לתוך בארות בתרבית רקמה. אם תאים ממוינים מיועדים DNA או ניתוח ביטוי גנים הקשורים RNA, hemogenic והלא hemogenic תאי האנדותל HSPC עשוי להיות מסודר ישירות לתוך צינורות אוסף המכיל חיץ מדגם תמוגה כדי להקטין את איבוד התא.

הטכניקה המתוארת התיר מוצלח (סימולטני) בידוד של בתאי האנדותל hemogenic והלא hemogenic, כמו גם HSPC ושברי תאי דם בוגרים מאותו הרקמות עובריות. גישה זו מאפשרת הרבעה נוספתy של הבסיס המולקולרי של המעברים הקריטיים המתרחשים בתאי האנדותל לייצר דם. תובנה ממחקרים התפתחותיות אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לשפר את שיטות ההדורות של תאי אנדותל hemogenic אדם וצאצאי HSPC מ פלוריפוטנטיים, ואפשרות עצמית, תאי גזע לטיפול בהפרעות hematopoietic נפוצות.

Disclosures

עבודה זו נתמכה על byNIH מענקים HL128064, HL096360, EB017103, וחידושים CT להעניק 15-יואן-YALE-04, כדי KKH, ו NICHD / NIH T32HD007094.

Acknowledgements

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)SigmaD5942TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling.
Absorbent bench underpadCovidien7134
#5 Straight ForcepsFine Science Tools11251-20
8.5 cm straight scissorsFine Science Tools14090-09
Isoflurane (Isothesia)Henry Schein 50033TOXIC inhalant: Use in fume hood.
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine) Invitrogen10378016
Type II CollagenaseWorthingtonLS004174
Falcon 70 μM nylon cell strainerCorningCLS431751
Anti-Mouse CD45-FITCeBioscience11-0451-81
Anti-Mouse CD31 - PEeBioscience12-0311-81
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7BD Pharmingen561259
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)Sigma14533TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use.
Verapamil HydrochlorideSigma1711202 TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling.   Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol.  Store at -20 °C until ready for use 
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning352235
MethoCult GF M3434Stem Cell Technologies3434Thaw and aliquot per manufacturer's instructions
Modified Giemsa StainSigmaGS500TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution.
Cytospin CentrifugeThermo ScientificA78300003
Clipped Funnel Starter KitThermo Scientific3120110Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge
Anti-Mouse B-220 - FITCBD Pharmingen553088
Anti-Mouse Gr-1-FITCeBioscience11-5931-85
Anti-Mouse Ter-119-FITCeBioscience11-5921-85
Gibco Fetal Bovine SerumThermo Scientific10437-077
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L)Life Technologies 11965-092
Hank's Buffered Salt SolutionLife Technologies 14175-095
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plateEMD MilliporePIFB24P05
IgG2A-PEBD Pharmingen553930
IgG2B-FITCBD Pharmingen556923

References

  1. Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
  2. Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
  5. Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
  6. Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564 (2013).
  7. Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
  8. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  9. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  10. de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
  11. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  12. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  13. Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
  14. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
  15. Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
  16. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  17. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  18. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
  19. Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
  20. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  21. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  22. Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
  23. Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
  24. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  25. Gomez Perdiguero, ., E, , et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  26. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112hemogenichematopoiesisFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved