גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

Summary

אנו מדגימים מערכת היווצרות bilayer שומנים שאפשר לשמור, יבילה. קרום bilayer השומנים יכול להיווצר בתוך שעה 1 עם למעלה מ -80% אחוזי הצלחה כאשר מבשר קרום קפוא מובא טמפרטורת הסביבה. מערכת זו תפחית תהליכי מייגע ומומחיות הקשורים תעלות יונים.

Abstract

Bilayer שומנים מלאכותי, או קרום שומנים שחור (BLM), הוא כלי רב עצמה ללימוד תעלות יוני אינטראקציות חלבון, כמו גם עבור יישומי biosensor. עם זאת, טכניקות היווצרות BLM קונבנציונליות יש כמה חסרונות ולעתים קרובות הם דורשים מומחיות ספציפית ותהליכים מייגעים. בפרט, BLMs הקונבנציונלי סובל משיעורי הצלחת היווצרות נמוכים וזמן היווצרות קרום עקבי. הנה, אנחנו מדגימים מערכת היווצרות BLM שאפשר לשמור יביל עם זמן דליל יוצא שיהיה בשליטת וקצב היווצרות BLM משופרת על ידי החלפת סרטים כמקובל בשימוש (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, קלקר) כדי polydimethylsiloxane (PDMS). בניסוי זה, פולימר נקבובי מובנה כגון סרט דק PDMS משמש. בנוסף, בניגוד ממסים כמקובל בשימוש עם צמיגות נמוכה, השימוש הסקוואלין מותר זמן דליל-אאוט נשלט באמצעות קליטת ממס איטית ידי PDMS, הארכת חי קרום. במודעהdition, באמצעות תערובת של סקוואלין hexadecane, נקודת הקיפאון של הפתרון השומנים הוגדל (~ 16 ° C), בנוסף, מבשרי קרום הופקו שניתן לאחסן ללא הגבלת זמן והובל בקלות. מבשרי קרום אלה צמצמו זמן היווצרות BLM של <1 hr והשיגו קצב היווצרות BLM של ~ 80%. יתר על כן, ניסויי ערוץ יון באות A gramicidin הדגימו את ההיתכנות של מערכת הממברנה.

Introduction

קרום bilayer שומנים מלאכותי, או קרום שומנים שחור (BLM), הוא כלי חשוב עבור הבהרת מנגנונים של קרום תא תעלות יונים, כמו גם להבנת אינטראקציות בין תעלות יונים ויונים / מולקולות. ^1-7 למרות ששיטת תיקון- clamp לעתים קרובות נחשב את תקן הזהב עבור מחקרים קרום התא, זה מייגע ודורש מפעילים מיומנים מאוד למדידות ערוץ יון. ⁸ בעוד ממברנות bilayer השומנים מחדש באופן מלאכותי התפתחו כמו כלים חלופיים ללימודי ערוץ יון, ^9,10 הם קשורים גם עם מייגע תהליכי התמחות ספציפית. יתר על כן, ממברנות רגישים להפרעות מכאניות. לפיכך, טכנולוגיות bilayer שומנים הציגו עד כה יישומים מעשיים מוגבלות. ¹¹

על מנת לשפר את חוסנו ואת תוחלת החיים של ממברנות bilayer השומנים, קוסטלו et al. ^12, ו אידה Yanagida ^{13 פתח bilayer שומנים שעמדו חופשי בתמיכת הידרוג'ל. למרות אריכות ימים משופרים לעומת זאת (<24 שעות), איתנות bilayer לא השתפרו. ג'און et al. 14 פתח קרומי כמוס הידרוג'ל (HEM) עם קשר bilayer הידרוג'ל-שומנים אינטימיים, וכתוצאה מכך אריכות ימים משופרים (עד כמה ימים). כדי להגביר עוד יותר את משך החיים של שולי, Malmstadt ו ג'און et al. נוצר קרום כמוס-הידרוג'ל עם שומנים בדם הידרוג'ל מחייב באמצעות in-situ נטיה קוולנטיים (cgHEM). 15 בשני מערכות, חיים הממברנה גדל באופן משמעותי (> 10 ימים) . עם זאת, מערכות היווצרות קרום לא היו מספיק חזקות, ולא יכולות להיות מאוחסנות או מועברות שבו נדרשו לשחרר מומחיות לשימוש של bilayers השומנים.}

פיתוח פלטפורמת bilayer שומנים סבב בעיקר סביב איתנות הגדלת תוחלת חיים של BLMs. למרות תוחלת החיים של BLMs כבר substantially משופר לאחרונה, הבקשות שלהן עדיין מוגבלות בשל חוסר יביל ו storability. כדי להתגבר על בעיות אלה, ג'און et al. יצר מערכת קרום שאפשר לשמור והציג מבשר הממברנה (MP). ¹⁶ כדי לבנות MP, הכינו תערובת של decane n- ו hexadecane המכיל 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphatidylcholine) לשלוט נקודת הקיפאון של הפתרון השומנים כך שהוא יקפיא ב ~ 14 ° C (מתחת לטמפרטורת החדר, מעל טמפרטורת המקרר אופייני). בניסוי זה, חבר הפרלמנט התפרש על צמצם קטן על סרט polytetrafluoroethylene (PTFE) ובהמשך קפוא במקרר ב 4 ° C.. כאשר MP הובא לטמפרטורת חדר, חבר הפרלמנט מופשר לבין bilayer שומנים הוקם באופן אוטומטי, ביטול המומחיות הקשורות בדרך כלל היווצרות קרום. עם זאת, שיעור ההצלחה של BLM עשוי MP היה נמוך כמו ~ 27%, ואת קרום formation הזמן היה עקבי (30 דק 'ל -24 שעות), הגבלת היישומים המעשיים שלה.

במחקר זה, polydimethylsiloxane (PDMS) סרט דק משמש במקום סרטים קונבנציונאלי הידרופובי דק (PTFE, polyoxymethylene, קלקר) עד (א) בקרת זמן ייצור (ב) להגדיל את שיעור ההצלחה של היווצרות BLM כפי שדווח בעבר על ידי ריו et al. ¹⁷ בזאת, היווצרות קרום התאפשרה על ידי מיצוי בממסים בשל האופי הנקבובי של PDMS, ואת הזמן הנדרש להיווצרות קרום נשלט בהצלחה במחקר זה. במערכת זו, כפתרון השומנים נטמע הסרט הדק PDMS, זמן היווצרות קרום עקבי הושג. יתר על כן, חי קרום הוארכו עקב ספיגה איטית של ממסים לתוך PDMS סרט דק, עקב תוספת הסקוואלין לפתרון השומנים. ערכנו מדידות אופטיות וחשמליות לאמת כי קרומים נוצרו באמצעות טכניקה זו מתאימים iעל מחקרי ערוצים.

Protocol

1. פתרון כנה

1. הכנת פתרון חיץ:
   1. כדי לגבש פתרון חיץ, לפזר 1 M KCl (פוטסיום כלוריד), 10 מ"מ טריס- HCl (טריס-hydrochloride), ו 1 mM EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) במים מזוקקים כדי להתאים את pH 8.0.
   2. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.20 מיקרומטר. כדי לעקר, חיטוי הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
2. הכנת פתרון שומנים עבור ציור מראש:
   1. כדי לגבש את הפתרון השומנים עבור ציור מראש, לפזר 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphatidylcholine) שומנים בדם (w: נ) בתערובת של 2: 8 n -decane ו hexadecane (נ: v). מערבבים לילה באמצעות הכתף.
3. הכנת פתרון שומנים להיווצרות קרום:
   1. כדי לגבש את הפתרון השומנים להיווצרות קרום, לפזר 0.1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphatidylcholine) שומנים בדם (w: נ) בתערובת של 2: 8 מ"רualene ו hexadecane (v: v). מערבבים לילה באמצעות הכתף.

2. כינונה של סרט דק PDMS

1. מערבבים PDMS וסוכן ריפוי בתוך 9: 1 (w / w) יחס בכוס ערבוב כדי ליצור את prepolymer PDMS. הוסף 5 גרם של prepolymer PDMS כדי בצלחת פטרי כדי ליצור את PDMS סרט דק (עובי 200 - 250 מיקרומטר). מורחים PDMS מראש פולימר באמצעות coater ספין ב 800 סל"ד במשך 10 שניות כדי ליצור סרט דק.
2. מניחים את צלחת פטרי לתוך ואקום ייבוש בלחץ של 100 mTorr עבור שעה 2 כדי להסיר בועות אוויר. כדי לפלמר סרט דק מראש פולימר, ואופים בתנור במשך 5 שעות על 70 מעלות צלזיוס.
3. כדי לעשות סרט מרובע PDMS דק, לחתוך את סרט דק PDMS polymerized לתוך 2 x 2 ס"מ ² ריבועים. השתמש אגרוף מייקרו 500 מיקרומטר לעשות צמצם במרכז של PDMS סרט דק. פתחים טרום צבע עם 3% DPhPC שומני פתרון מעורב 2: 8 n- decane ו hexadecane.

3. ייצור קאמרי Assembly

1. כדי לפברק תא BLM, עיצוב שני רחובות סימטרי של החדר באמצעות תוכנת ציור 3D עם מידות החיצוני של 4 ס"מ x 1.5 ס"מ x 1 ס"מ ומימדים הפנימי היטב של 1.5 ס"מ x 1.3 ס"מ x 0.8 ס"מ ^17.
2. לעצב את החדר באמצעות בלוק PTFE עם מכונת CNC ופעל לפי הוראות היצרן.

4. אסיפה קאמרית

1. כדי להרכיב את התא, למקם את הסרט הדק מראש צבוע-PDMS בין שני גושי PTFE כך הצמצם על סרט PDMS הדק מיושר עם החור בתא.
2. חותם את הקצוות החיצוניים של החדר באמצעות זכוכית לכסות עם גריז (הקלת תצפית אופטית). לשתק את התא נאסף באמצעות ברגים ואומים.
   הערה: ודא הקאמרי הוא חתום היטב כך שאין דליפת נוזלים.

גיבוש 5. של המבשר ממברנה עם דחוף הרכבה עצמית גיבוש (השגיאות המרביות המותרות)

1. בעזרת פיפטה, להפקיד 0.5μl של שומני 0.1% DPhPC המעורבים 2: 8 n -decane: hexadecane על הצמצם של סרט PDMS הדק התאסף עם הקאמרי.
2. לפני השימוש, לאחסן בתא במקפיא או במקרר מתחת ל -10 מעלות צלזיוס.

6. גיבוש ממברנה ואימות

1. כדי ליצור BLM עם השגיאות המרביות המותרות, למשוך את תא מהמקרר להשעות 2 מ"ל של תמיסת חיץ בכל צד של החדר. הגדר את התא בצד <10 דק 'עד מבשר הקרום הקפוא מפשיר.
2. מניחים את החדר על micromanipulator לשלוט העלאת דווקא ביחס למקור אור המיקרוסקופ. להאיר צד אחד של החדר כמקור אור באמצעות פנס סיבים אופטי הלוגן כדי להאיר את הצמצם של PDMS הסרט דק להסתכלות אופטית של תהליך היווצרות BLM.
3. בצד השני, למקם מיקרוסקופ דיגיטלי אנכי ביחס למקור האור להתבונן היווצרות BLM (להגדיל ב -200x).
4. כדי לאשר היווצרות BLM, להשקיף על מרכז של הצמצם שבו הצבע הופך בהיר יותר annulus.

7. הקלטת חשמל

1. למדידת חשמל, להכין אלקטרודות Ag / Cl באמצעות חוט כסף בעובי מיקרומטר 208 וחומר הלבנת חומצת סודיום> 1 דקות. הנח את האלקטרודות Ag / Cl לתוך מכל צד של החדר העמוק מספיק כדי להיות טבל פתרון החיץ.
2. חברו את האלקטרודות למגבר microelectrode. באמצעות תוכנה אלקטרופיזיולוגיה, להחיל צורת גל משולש ± 10 mV דרך הממברנה לרכוש גל מרובע. גדר החלת מתח על ידי לחיצה על החצים הצביעו על V_clamp (mV).
3. רשמו את התכונות החשמליות של קרום על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה (סמל נקודה אדומה). המשך עם הקלטה עד גל מרובע אחיד הוא ציין. צא ההקלטה על ידי לחיצה על סמל הריבוע השחור.

8. ערוץ יון התאגדות

לֹאE: A Gramicidin (GA) התאגדות מתרחשת באופן ספונטני עם התהוותן של BLM, כמו GA מתווסף ישירות פתרון השומנים.

1. כדי להתבונן בפעילות ערוץ GA, להחיל 100 mV דרך הממברנה בקצב דגימה של 5 kHz למדוד מחזיק הפוטנציאל של הממברנה. גדר החלת מתח על ידי לחיצה על החצים הצביעו על V_clamp (mV).
2. רשום את המאפיינים החשמליים של התאגדות GA-ידי לחיצה על כפתור ההקלטה (סמל נקודה אדום). המשך ההקלטה עד קפיצות נוכחיות הוא ציינה. צא ההקלטה על ידי לחיצה על סמל הריבוע השחור.
3. לאחר רכישת נתונים חשמל, לסנן את הנתונים עם מסנן נמוך לעבור Bessel ב 100 הרץ באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה.
4. שים קפיצות נוכחיות בנתוני פוטנציאל החזקת המסוננים (כל קפיצה הנוכחית, ~ 0.15 nS, מייצג dimerization של ערוץ יון ג'י אי) לאמת התאגדות GA.

תוצאות

אופטימיזציה של הרכב תמיסות השגיאות המרביות המותרות
בהרכבים שונים של שומנים וממיסים נבדקו בהצלחה כדי לשקם ממברנות bilayer השומנים מן השגיאות המרביות המותרות. מערכת MP בתערובת של decane n- ו hexadecane המכיל 3% DPhPC ¹⁴ הציגה שיעור הצלחה נמוך ש...

Discussion

Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.

As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,^20...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For buffer solution
Tris-hydrochloride	Sigma-Aldrich	1185-53-1	For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60-00-4	For buffer solution
n-decane	Sigma-Aldrich	44074-U	For lipid solution
Hexadecane	Sigma-Aldrich	544-76-3	For lipid solution
Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	For lipid solution
Gramicidin A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit	Dow Corning Asia		To produce PDMS thin film
0.2 μm filter	Satorius stedim	16534----------K	To filter buffer solution
Rotator	FinePCR	AG	To dissolve lipid homogeneously
Autoclave	Biofree	BF-60AC	To sterilize buffer solution
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator	Welch	2042-22	To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch	Harris Uni-Core	0.5	To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine	SME trading	SME 2518	To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator	Motic	MLC-150C	To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope	Digital blue	QX-5	To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode	A-M Systems		To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier)	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)