JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bir depolanabilir, taşınabilir lipit iki katmanlı oluşum sistemi göstermektedir. Dondurulmuş bir membran ön-madde çevre sıcaklığına getirildiğinde bir lipid iki-tabakalı zar üzerinden% 80 başarı oranı ile 1 saat içinde oluşturulabilmektedir. Bu sistem iyon kanalları ile ilişkili zahmetli süreçler ve uzmanlık azaltacaktır.

Özet

Yapay bir lipit iki tabakalı ya da siyah lipid membran (BLM), iyon kanalları ve protein etkileşimleri incelemek, hem de biyosensör uygulamaları için çok güçlü bir araçtır. Ancak, geleneksel BLM oluşum teknikleri çeşitli dezavantajları var ve onlar genellikle belirli uzmanlık ve zahmetli süreçler gerektirir. Özellikle, geleneksel BLMs düşük oluşum başarı oranları ve tutarsız membran oluşumu zaman muzdarip. Burada, polidimetilsiloksan (PDMS) geleneksel olarak kullanılan filmler (politetrafloroetilen, polioksimetilen, polistren) değiştirerek kontrol inceltme çıkış süresi ve gelişmiş BLM oluşum hızı ile depolanabilir ve taşınabilir BLM oluşum sistemini göstermektedir. Bu deneyde, örneğin PDMS ince film gibi bir gözenekli yapılı bir polimer kullanılır. Düşük viskoziteli geleneksel olarak kullanılan çözücülere karşı ek olarak, skualenin kullanımı membran ömrünü uzatan PDMS yavaş çözücü emmesi ile kontrollü bir incelme Çıkış zaman izin. Reklamdakoşul, skualen ve heksadekan bir karışımını kullanarak, lipit çözeltisinin donma noktası süresiz olarak saklanabilir ve kolayca taşınabilir, membran ön üretilmiştir Buna ek olarak, (~ 16 ° C) arttırıldı. Bu zar öncüleri <1 saat BLM oluşumu süresini azalttı ve% 80 ~ bir BLM oluşum oranı elde ettik. Ayrıca, gramicidin A iyon kanal deneyleri membran sisteminin uygulanabilirliğini göstermiştir.

Giriş

Yapay çift katlı lipid membran ya da siyah lipid membran (BLM), hücre zarlarının ve iyon kanalları, mekanizmaların tanıtılması yanı sıra iyon kanalları ve iyonlar / molekülleri arasındaki etkileşimleri anlamak için önemli bir araçtır. Patch-kelepçe yönteminin rağmen 1-7 genellikle hücre zarı çalışmaları için altın standart olarak kabul edilir, bu zahmetli ve iyon kanal ölçümleri için çok yetenekli operatörleri gerektirir. 8 yapay yeniden çift katlı lipid membranlar iyon kanal çalışmaları için alternatif bir araç olarak ortaya çıkmıştır ederken, 9,10 onlar da zahmetli ile ilişkili süreçler ve özel uzmanlık. Ayrıca, membranlar mekanik tedirginlikler hassastırlar. Bu nedenle, bugüne kadar sunulan çift katlı lipid teknolojileri sınırlı pratik uygulamalar. 11

Çift katlı lipid membranlar Costello ve ark. 12 ve Ide ve Yanagida sağlamlığını ve uzun ömürlü artırmak amacıyla 13 hidrojeller tarafından desteklenen bir serbest duran lipid çift geliştirdiler. Ancak gelişmiş uzun ömürlü olmasına rağmen (<24 saat), iki tabakalı sağlamlığı gelişmiş değildi. Jeon ve ark., 14 (birkaç güne kadar) artmış uzun ömürlü sonuçlanan samimi hidrojel çift katlı lipid kişiyle hidrojel kapsüllü membran (HEM) tasarladı. Daha HEM ömrünü arttırmak için, Malmstadt ve Jeon ve ark., Hidrojel lipit Her iki sistemde de yerinde kovalent konjugasyon (cgHEM). 15 ile bağlama ile bir hidrojel kapsüllenmiş zar oluşturulur, membran ömürleri önemli ölçüde artmıştır (> 10 gün) . Ancak, membran oluşumu sistemleri yeterince güçlü değildi ve lipit bilayers kullanımı için uzmanlık kurtarmak için gerektiğinde depolanan veya teslim edilemedi.

bir lipid iki tabakalı platformunun geliştirilmesi öncelikle sağlamlığı ve BLMs uzun ömürlü etrafında dönüyordu etti. BLMs uzun ömürlü su olmasına rağmenbstantially gelişmiş son uygulamaları nedeniyle taşınabilirliği ve depolanamaması eksikliği sınırlı kalmıştır. Bu sorunları aşmak için, Jeon ve ark., Bir depolanabilir membran sistemi oluşturdu ve MP oluşturmak için bir membran öncüsü (MP). 16 tanıttı, onlar% 3 DPhPC (1,2-diphytanoyl- içeren n dekan ve heksadekan karışımı hazırladı SN -glisero-3-fosfatidilkolin) o ~ 14 ° C (oda sıcaklığının altında tipik soğutma sıcaklığının üstünde) dondurulması öyle ki, lipid çözeltisinin donma noktası kontrol edilebilir. Bu deneyde, MP politetrafloroetilen (PTFE), filmin küçük bir diyafram üzerinde yayılır ve daha sonra 4 ° C'de bir buzdolabı içinde dondurulmuştur. MP oda sıcaklığına getirildi, MP eritildi ve bir lipid iki katmanlı de otomatik olarak membran oluşumu ile bağlantılı uzmanlık ortadan oluşturulmuştur. Ancak, MP yapılan BLM başarı oranı ~% 27, ve membran Formatio gibi düşük oldun zaman, (30 dk saat 24) tutarsız pratik uygulamalarını sınırlayan.

Daha önce Ryu tarafından bildirilen bu çalışmada, bir polidimetilsiloksan (PDMS) ince film yerine (a) kontrol üretim süresi ve (b) BLM oluşum başarı oranını arttırmak için geleneksel bir hidrofobik ince filmler (PTFE, polioksimetilen, polistren) arasında kullanılır ve ark., 17, burada, hücre formasyonu nedeniyle PDMS gözenekli doğası çözücü ekstraksiyonu ile kolaylaştırılır, ve zar oluşumu için gerekli zaman başarılı bir şekilde bu çalışmada kontrol edilmiştir. Lipid çözeltisi PDMS ince film absorbe gibi bu sistemde, tutarlı bir membran oluşumu süresi elde edildi. Ayrıca, membran süresi nedeniyle PDMS ince film, yağ çözeltisine skualen ilavesinin bir sonucu olarak çözücülerin yavaş bir emme uzatılmıştır. Biz bu tekniği kullanarak oluşturulan membranlar i için uygun olduğunu doğrulamak için optik ve elektrik ölçümleri yapılmıştırkanal çalışmaları.

Protokol

1. Solüsyon Hazırlama

  1. Tampon çözeltisinin hazırlanması:
    1. Tampon çözeltisi formüle 1 M KCl (potasyum klorür), 10 mM Tris-HCl (Tris-hidroklorür) ve damıtılmış su içinde 1 mM EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) çözülür ve 8.0 pH ayarlamak için.
    2. 0.20 mikron filtre kullanarak çözüm Filtre. sterilize etmek için, 15 dakika boyunca 121 ° C'da, çözelti otoklav.
  2. boya öncesi lipid çözeltisinin hazırlanması:
    1. (A: h) DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glisero-3-fosfatidilkolin) lipit, boya öncesi lipid çözeltisi formüle% 3 çözünmesi için 2 karışımı içinde: 8 N -dekan ve heksadekan (hacim: h). Bir rotator kullanarak gece boyunca karıştırın.
  3. zar oluşumu lipid çözeltisinin hazırlanması:
    1. % 0.1 DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glisero-3-fosfatidilkolin) lipid çözülür, zar oluşumu lipid çözeltisi formüle etmek (a: h) 2 karışımı içinde: 8 kareualene ve heksadekan (hacim: hacim). Bir rotator kullanarak gece boyunca karıştırın.

PDMS İnce Film 2. oluşumu

  1. PDMS ön-polimerin oluşturulması için bir karıştırma bardak 1 (ağırlık / ağırlık) oranında bir 9 PDMS ve sertleştirme ajanı karıştırılır. PDMS ince film (- 250 um kalınlıkta 200) oluşturulması için bir Petri kabı PDMS prepolimerin 5 g ekleyin. ince bir film meydana getirmek üzere 10 saniye süre ile 800 rpm'de bir eğirme kaplayıcı kullanılarak PDMS nin önceden polimeri ayırmak.
  2. Hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için 2 saat boyunca 100 mTorr bir basınçta bir vakum kurutucu içerisine Petri tabağına yerleştirin. 70 ° C'de 5 saat boyunca bir fırın içinde pre-polimer ince film, fırında polimerize etmek için.
  3. Bir kare PDMS ince film yapmak için, 2 x 2 cm 2 kareler içine polimerize PDMS ince film kesti. PDMS ince film merkezinde bir açıklık olmak için 500 um mikro zımba kullanarak. 8 N- dekan ve heksadekan: 2 içinde karıştırılmıştır% 3 DPhPC lipid çözeltisi ile önceden boya delikler.

3. Odası İmalatı ve AsseCivata

  1. BLM odasını imal etmek, 4 cm x 1.5 cm x 1 cm x 1.3 cm x 0.8 cm 17 1,5 cm iç kuyu ölçüleri dış boyutları ile 3 boyutlu çizim yazılımı kullanarak odasının tasarımı iki simetrik blok.
  2. CNC makinesi ile bir PTFE bloğu kullanarak odasını zanaat ve üreticinin talimatlarına uyun.

4. Odası Meclis

  1. odasına monte etmek için, iki PTFE blokları arasında boyalı-PDMS ince film yerleştirmek PDMS ince film üzerinde açıklık odasındaki delik ile uyumlu olduğunu böyle.
  2. gres bir cam kapak (optik gözlem kolaylaştıran) kullanarak odasının dış kenarları mühür. somun ve cıvata kullanılarak monte odasına hareketsiz.
    NOT: Hiçbir sıvı sızıntısı olmaması için odacık iyi mühürlü olduğundan emin olun.

Hızlandırılmış Self-montaj Formasyonu ile Membran Öncü 5. Formasyonu (MPES)

  1. Bir pipet kullanarak, 0.5 yatırmak8 n -dekan: 2 içinde karıştırılmıştır,% 0.1 DPhPC lipid ul odasına monte PDMS ince film açıklığı üzerine heksadekan.
  2. Kullanımı bir dondurucu veya 10 ° C'nin altında bir buzdolabında bölme depolamak önce.

6. Membran Oluşumu ve Doğrulama

  1. MPE'lerin bir BLM'ye oluşturmak için, buzdolabı bölme çekme ve odanın her iki tarafındaki tampon çözeltisi 2 ml askıya. dondurulmuş membran habercisi thaws kadar <10 dakika boyunca bir kenara odasına ayarlayın.
  2. tam ışık kaynağı ve mikroskop ile ilgili yüksekliğini kontrol etmek için bir micromanipulator üzerine odasına yerleştirin. BLM oluşum sürecinde optik gözlem PDMS ince film açıklığı aydınlatmak için bir halojen fiber optik aydınlatıcı kullanan bir ışık kaynağı olarak odacığın bir tarafında aydınlatır.
  3. Diğer taraftan, bölüm oluşumu gözlemlemek için bir ışık kaynağına göre dikey dijital mikroskop yer (20 bozar0X).
  4. BLM oluşumunu doğrulamak için, renk annulus daha parlak hale gelir diyafram merkezini görüyoruz.

7. Elektrik Kayıt

  1. Elektrik ölçümü için,> 1 dakika sodyum hipoklorit bir 208 mikron kalınlığında gümüş tel ve çamaşır suyu kullanarak Ag / Cl elektrotlar hazırlar. yeterince derin odasının her tarafına Ag / Cl elektrotları yerleştirin tampon çözeltisi içine daldırma için.
  2. mikroelektrot amplifikatör elektrotlar bağlayın. elektrofizyoloji yazılımı kullanarak, bir kare dalga elde etmek için zarından ± 10 mV üçgen dalga formu uygulanır. V_clamp (mV) belirtilen okları tıklayarak gerilim uygulayarak ayarlayın.
  3. kayıt düğmesine (kırmızı nokta simgesi) tıklayarak membranın elektriksel özelliklerini kaydedin. düzgün bir kare dalga görülmektedir kadar kaydı ile devam edin. siyah kare simgesine tıklayarak kayıt çıkın.

8. İyon Kanal Ortaklığın

DEĞİLE: gA lipit solüsyonuna doğrudan ilave olarak Gramicidin bir (GA) dahil, BLM oluşması üzerine spontan olarak meydana gelir.

  1. , GA kanal faaliyetlerini gözlemlemek membran potansiyelini elinde ölçmek için 5 kHz örnekleme hızında zarından 100 mV uygulamak için. V_clamp (mV) belirtilen okları tıklayarak gerilim uygulayarak ayarlayın.
  2. kayıt düğmesine (kırmızı nokta simgesi) tıklayarak gA dahil elektriksel özelliklerini kaydedin. Geçerli sıçramalar görülmektedir kadar kayıt devam edin. siyah kare simgesine tıklayarak kayıt çıkın.
  3. elektrik verileri satın alınmasından sonra, bir elektrofizyoloji yazılımı kullanarak 100 Hz düşük geçiş Bessel filtresi ile verilere filtre.
  4. (~, Her akım atlama 0.15 NS gA iyon kanalının dimerizasyonunu gösterir) filtrelenmiş potansiyel verileri tutan mevcut atlar gözlemlemek gA birleşme doğrulamak için.

Sonuçlar

MPES çözelti bileşimi optimizasyonu
Lipidlerin ve çözücüler farklı bileşimler başarılı MPE'lerin lipid iki katmanlı membranlar yeniden yapılandırmak için test edilmiştir. DPhPC 14% 3 ihtiva eden n-dekan ve heksadekan karışımıyla MP sistemi zar oluşumu (~% 27), düşük bir başarı oranı göstermiştir. PDMS filmin sürekli lipit çözeltisinin ekstre Buna ek olarak, bir intakt lipid iki katmanlı membran korumak içi...

Tartışmalar

Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.

As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9333For buffer solution
Tris-hydrochlorideSigma-Aldrich1185-53-1For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-Aldrich60-00-4For buffer solution
n-decaneSigma-Aldrich44074-UFor lipid solution
HexadecaneSigma-Aldrich544-76-3For lipid solution
SqualeneSigma-AldrichS3626For lipid solution
Gramicidin ASigma-Aldrich11029-61-1Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids, Inc.850356For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kitDow Corning AsiaTo produce PDMS thin film
0.2 μm filterSatorius stedim16534----------KTo filter buffer solution
RotatorFinePCRAGTo dissolve lipid homogeneously
AutoclaveBiofreeBF-60ACTo sterilize buffer solution
Spin coaterShinu MstSP-60PTo spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccatorWelch2042-22To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punchHarris Uni-Core0.5To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machineSME tradingSME 2518To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminatorMoticMLC-150CTo illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscopeDigital blueQX-5To optically observe lipid bilayer membrane formation
ElectrodeA-M SystemsTo electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier)Axon InstrumentsAxopatch 200B AmplifierTo measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)

Referanslar

  1. Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
  2. Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
  3. Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
  4. Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
  5. Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
  6. Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
  7. Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
  8. Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
  9. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
  10. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
  11. Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
  12. Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
  13. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
  14. Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
  15. Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
  16. Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
  17. Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
  18. Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
  19. Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
  20. Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
  21. Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
  22. Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
  23. Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 113ift katl lipidBiyomimetik MembranSiyah Lipid Membranyon KanalUyu turucu Madde TaramaElektrofizyolojiGramicidin A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır