Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d'un Thin Film Polydiméthylsiloxane

Résumé

Nous démontrons un système stockable, transportable lipidique formation bicouche. Une membrane lipidique à deux couches peut être formée à l'intérieur de 1 heure avec un taux de succès supérieur à 80% lors d'un précurseur de membrane congelée est ramené à température ambiante. Ce système permettra de réduire les processus laborieux et expertise associés aux canaux ioniques.

Résumé

Une bicouche lipidique artificielle, ou d'une membrane lipidique noire (BLM), est un outil puissant pour étudier les canaux ioniques et les interactions entre protéines, ainsi que pour les applications de biocapteurs. Cependant, les techniques classiques de formation BLM présentent plusieurs inconvénients et ils nécessitent souvent une expertise spécifique et des processus laborieux. En particulier, BLM classiques souffrent de faibles taux de réussite de la formation et incohérente temps de formation de la membrane. Ici, nous démontrons un système de formation BLM stockable et transportable avec le temps d'éclaircissage contrôlé et amélioré le taux de formation BLM en remplaçant les films classiquement utilisés (polytétrafluoroéthylène, polyoxyméthylène, polystyrène) polydiméthylsiloxane (PDMS). Dans cette expérience, un polymère poreux structuré tel que le PDMS film mince est utilisé. En outre, par opposition aux solvants classiquement utilisés avec une faible viscosité, l'utilisation du squalène a permis un temps d'éclaircissage contrôlée par absorption par un solvant lent PDMS, ce qui prolonge la durée de vie de la membrane. En additioncondition, à l'aide d'un mélange de squalène et de l'hexadécane, du point de la solution lipidique de congélation est augmentée (~ 16 ° C), en outre, des précurseurs membranaires ont été produits qui peuvent être stockés indéfiniment et facilement transportable. Ces précurseurs membranaires ont réduit BLM temps de formation de <1 h et atteint un taux de formation BLM de ~ 80%. Par ailleurs, des expériences de canaux ioniques avec la gramicidine A ont démontré la faisabilité du système membranaire.

Introduction

Membrane artificielle bicouche lipidique ou membrane lipidique noire (BLM), est un outil important pour les mécanismes des membranes cellulaires et des canaux ioniques, élucidant ainsi que pour la compréhension des interactions entre les canaux ioniques et des ions / molécules ^1-7 Bien que la méthode patch-clamp. est souvent considéré comme l'étalon-or pour les études de la membrane cellulaire, il est laborieux et exige des opérateurs hautement qualifiés pour des mesures de canaux ioniques. ⁸ Alors reconstituées artificiellement des membranes bicouches lipidiques ont émergé comme des outils alternatifs pour les études des canaux ioniques, ^9,10 ils sont également associés à laborieuse des processus et des compétences spécifiques. Par ailleurs, les membranes sont sensibles aux perturbations mécaniques. Applications pratiques Ainsi, les technologies de bicouches lipidiques introduites à ce jour ont limité. ¹¹

Afin d'améliorer la robustesse et la longévité des membranes de bicouche lipidique, Costello et al. , ^12, et Ide et Yanagida ^{13 ont mis au point une bicouche lipidique autonome soutenue par hydrogels. Malgré une meilleure longévité cependant (<24 h), bicouche robustesse n'a pas été améliorée. Jeon et al. , 14 mis au point une membrane d'hydrogel enrobé (HEM) avec un hydrogel intime bicouche lipidique de contact, ce qui entraîne une longévité accrue (jusqu'à plusieurs jours). Pour augmenter encore la durée de vie du HEM, Malmstadt et Jeon et al. A créé une membrane d'hydrogel encapsulé avec la liaison hydrogel-lipidique par conjugaison covalente in-situ (cgHEM). 15 Dans les deux systèmes, la durée de vie membranaires ont sensiblement augmenté (> 10 jours) . Cependant, les systèmes de formation des membranes ne sont pas suffisamment robustes, et ne pouvaient pas être stockés ou livrés si nécessaire pour libérer l'expertise pour l'utilisation des bicouches lipidiques.}

Le développement d'une plate-forme bicouche lipidique a principalement tourné autour de plus en plus de robustesse et de longévité de BLM. Bien que la longévité de BLM a été substantially améliorée récemment, leurs applications ont été limitées en raison d'un manque de transportabilité et conservabilité. Pour surmonter ces problèmes, Jeon et al. A créé un système de membrane stockable et introduit un précurseur de membrane (MP). ¹⁶ Pour construire un député, ils ont préparé un mélange de décane n- et hexadécane contenant 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn - glycéro-3-phosphatidylcholine) pour contrôler le point de la solution lipidique telle qu'elle gèle à ~ 14 ° C ( en dessous de la température ambiante, supérieure à la température typique du réfrigérateur) congélation. Dans cette expérience, le député a été étalée sur une petite ouverture sur un polytétrafluoroéthylène (PTFE) Film et ensuite congelé dans un réfrigérateur à 4 ° C. Lorsque le MP est ramené à température ambiante, le MP décongelé et une bicouche lipidique est formée automatiquement, ce qui élimine l'expertise typiquement associée à la formation de la membrane. Cependant, le taux de succès de BLM fait de la MP était aussi bas que ~ 27%, et la membrane formation temps était incompatible (30 min à 24 h), ce qui limite ses applications pratiques.

Dans cette étude, un polydiméthylsiloxane (PDMS) film mince est utilisé à la place d'un des films classiques hydrophobes minces (PTFE, polyoxyméthylène, polystyrène) à (a) le temps de contrôle de la fabrication et (b) augmenter le taux de formation BLM succès comme rapporté précédemment par Ryu et al. ¹⁷ Ici, la formation de la membrane a été facilitée par l' extraction de solvants en raison de la nature poreuse de PDMS, et le temps nécessaire à la formation de la membrane a été contrôlée avec succès dans cette étude. Dans ce système, la solution lipidique a été absorbé dans le film mince PDMS, un temps de formation d'une membrane uniforme a été obtenue. De plus, la durée de vie de la membrane a été prolongée en raison de l'absorption lente des solvants dans les PDMS de film mince, un résultat de l'addition de squalène à la solution lipidique. Nous avons effectué des mesures optiques et électriques pour vérifier que les membranes formées en utilisant cette technique sont appropriés pour isur des études canaux.

Protocole

1. Préparation de la solution

1. Préparation de la solution tampon:
   1. À formuler une solution tampon, on dissout 1 M de KCl (chlorure de potassium), 10 mM de Tris-HCl (Tris-chlorhydrate) et 1 mM d'EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) dans l'eau distillée et ajuster le pH à 8,0.
   2. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,20 um. Pour stériliser, autoclave la solution à 121 ° C pendant 15 min.
2. Préparation de la solution lipidique pour prélaquage:
   1. Pour formuler la solution lipidique pour prélaquage, on dissout 3% DPhPC (1,2-sn - glycéro diphytanoyl--3-phosphatidylcholine) lipide (p: v) dans un mélange de 2: 8 et n décane hexadécane (v: v). Agiter pendant une nuit en utilisant un dispositif de rotation.
3. Préparation de la solution lipidique pour la formation de la membrane:
   1. Pour formuler la solution lipidique pour la formation de la membrane, dissoudre 0,1% DPhPC (1, 2-sn - glycéro diphytanoyl--3-phosphatidylcholine) lipide (p: v) dans un mélange de 2: 8 plet ualene hexadécane (v: v). Agiter pendant une nuit en utilisant un dispositif de rotation.

2. Formation d'un Thin Film PDMS

1. Mélanger PDMS et d'agent de durcissement dans un rapport de 9 à 1 (p / p) dans un récipient de mélange pour former le prépolymère PDMS. Ajouter 5 g de PDMS prépolymère dans une boîte de Pétri pour former le PDMS film mince (épaisseur 200-250 um). Étaler PDMS de pré-polymère à l'aide d'une tournette à 800 tours par minute pendant 10 secondes pour former un film mince.
2. Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur sous vide à une pression de 100 mTorr pendant 2 heures pour éliminer les bulles d'air. Pour polymériser le film mince pré-polymère, cuire au four pendant 5 heures à 70 ° C.
3. Afin de rendre un PDMS carrés de film mince, couper le PDMS polymérisés film mince en 2 x 2 cm ² carrés. Utilisez un micro poinçon 500 um pour faire une ouverture dans le centre du PDMS à film mince. Des ouvertures pré-peinture avec une solution à 3% DPhPC lipidique mélangé 2: 8 et le décane n- hexadécane.

3. Chambre Fabrication et Assembly

1. Pour fabriquer la chambre BLM, la conception de deux blocs symétriques de la chambre en utilisant un logiciel de dessin 3D avec des dimensions extérieures de 4 cm x 1,5 cm x 1 cm et des dimensions intérieures puits de 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm ^17.
2. Craft la chambre en utilisant un bloc de PTFE avec une machine CNC et suivez les instructions du fabricant.

4. Assemblée Chambre

1. Pour assembler la chambre, placer le film mince pré-peint-PDMS entre les deux blocs de PTFE tel que l'ouverture sur le PDMS film mince est aligné avec le trou dans la chambre.
2. Sceller les bords extérieurs de la chambre en utilisant un couvercle en verre avec de la graisse (ce qui facilite l'observation optique). Immobiliser la chambre assemblés à l'aide des écrous et des boulons.
   REMARQUE: Assurez-vous que la chambre est bien scellé de sorte qu'il n'y ait pas de fuite de liquide.

5. La formation de membrane Precursor avec Expedited auto-assemblage Formation (MPES)

1. En utilisant une pipette, déposer 0,5pi de 0,1% DPhPC lipide mélangé 2: 8 n décane: hexadécane sur l'ouverture du PDMS film mince assemblé avec la chambre.
2. Avant d'utiliser, stocker la chambre dans un congélateur ou un réfrigérateur en dessous de 10 ° C.

6. Membrane Formation et vérification

1. Pour former un BLM avec MPES, retirer la chambre du réfrigérateur et de suspendre 2 ml d'une solution tampon de chaque côté de la chambre. Réglez la chambre de côté pour <10 min jusqu'à ce que le précurseur de membrane congelée dégèle.
2. Placer la chambre sur un micromanipulateur pour contrôler avec précision la hauteur par rapport à la source lumineuse et le microscope. Illuminer un côté de la chambre comme une source de lumière en utilisant un halogène fibres optiques illuminateur pour illuminer l'ouverture du PDMS à couche mince pour l'observation optique du processus de formation BLM.
3. De l'autre côté, placez un microscope numérique verticalement par rapport à la source lumineuse pour observer la formation BLM (magnifier par 200X).
4. Pour confirmer la formation BLM, observer le centre de l'ouverture où la couleur devient plus lumineux que l'anneau.

7. Enregistrement électrique

1. Pour la mesure électrique, préparer des électrodes Ag / Cl en utilisant un fil d'argent 208 um d'épaisseur et de l'eau de Javel dans l'hypochlorite de sodium pendant> 1 min. Placer les électrodes Ag / Cl dans chaque côté de la chambre suffisamment profond pour être plongé dans la solution tampon.
2. Connecter les électrodes à l'amplificateur de microélectrodes. En utilisant le logiciel d'électrophysiologie, appliquer une forme d'onde triangulaire mV ± 10 à travers la membrane pour acquérir une onde carrée. Régler application d'une tension en cliquant sur les flèches indiquées sur V_clamp (mV).
3. Enregistrer les propriétés électriques de la membrane en cliquant sur le bouton d'enregistrement (rouge icône de point). Procéder à l'enregistrement jusqu'à ce qu'une onde carrée uniforme est observée. Quittez l'enregistrement en cliquant sur l'icône carré noir.

8. Ion Canal Incorporation

NE PASE: gramicidine A (gA) l'incorporation se fait spontanément lors de la formation de BLM, comme gA est ajouté directement à la solution lipidique.

1. Pour observer les activités de canal gA, appliquer 100 mV à travers la membrane à un taux de 5 kHz échantillon pour mesurer le potentiel de la membrane de maintien. Régler application d'une tension en cliquant sur les flèches indiquées sur V_clamp (mV).
2. Enregistrer les propriétés électriques de l'incorporation gA en cliquant sur le bouton d'enregistrement (rouge icône de point). Continuez l'enregistrement jusqu'à ce que les sauts en cours est observée. Quittez l'enregistrement en cliquant sur l'icône carré noir.
3. Après l'acquisition de données électriques, filtrer les données avec un filtre passe-bas de Bessel à 100 Hz en utilisant un logiciel d'électrophysiologie.
4. Observer les sauts de courant dans la détention de données potentiels filtré (chaque saut courant, ~ 0,15 nS, représente dimérisation d'un canal ionique gA) pour vérifier gA incorporation.

Résultats

Optimisation de la composition de solution MPES
Différentes compositions de lipides et les solvants ont été testés pour reconstituer avec succès des membranes bicouches lipidiques de MPES. Le système MP avec un mélange de décane n- et hexadécane contenant 3% DPhPC ¹⁴ présentait un faible taux de réussite de la formation de membrane (~ 27%). De plus, comme le film de PDMS extrait en continu la solutio...

Discussion

Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.

As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,^20...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For buffer solution
Tris-hydrochloride	Sigma-Aldrich	1185-53-1	For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60-00-4	For buffer solution
n-decane	Sigma-Aldrich	44074-U	For lipid solution
Hexadecane	Sigma-Aldrich	544-76-3	For lipid solution
Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	For lipid solution
Gramicidin A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit	Dow Corning Asia		To produce PDMS thin film
0.2 μm filter	Satorius stedim	16534----------K	To filter buffer solution
Rotator	FinePCR	AG	To dissolve lipid homogeneously
Autoclave	Biofree	BF-60AC	To sterilize buffer solution
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator	Welch	2042-22	To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch	Harris Uni-Core	0.5	To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine	SME trading	SME 2518	To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator	Motic	MLC-150C	To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope	Digital blue	QX-5	To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode	A-M Systems		To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier)	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)