Formação Automated Lipid bicamada da membrana Usando um polidimetilsiloxano Thin Film

Resumo

Nós demonstramos um sistema armazenável e transportável de lípidos em bicamada. Uma membrana de bicamada de lípido pode ser formado dentro de 1 hora com uma taxa de sucesso superior a 80% quando um precursor de membrana congelada é levada até à temperatura ambiente. Este sistema irá reduzir os processos laboriosos e conhecimentos associados com canais de íons.

Resumo

Uma bicamada lipídica artificial, ou membrana lipídica preto (BLM), é uma ferramenta poderosa para estudar canais iônicos e interações proteína, bem como para aplicações de biossensores. No entanto, técnicas de formação de BLM convencionais têm várias desvantagens e que muitas vezes exigem conhecimentos específicos e processos laboriosos. Em particular, MBL convencionais sofrem de taxas de sucesso de formação baixos e tempo de formação da membrana inconsistente. Aqui, nós demonstramos um sistema de formação de BLM armazenável e transportável com o tempo de desbaste-out controlado e maior taxa de formação de BLM, substituindo filmes tradicionais (politetrafluoretileno, polioximetileno, poliestireno) de polidimetilsiloxano (PDMS). Nesta experiência, um polímero poroso estruturado tal como película fina de PDMS é usado. Além disso, ao contrário de solventes convencionalmente utilizados com baixa viscosidade, o uso de esqualeno permitido um tempo de desbaste de saída controlada por via de absorção lenta solvente por PDMS, prolongando tempo de vida da membrana. Em anúnciodição, usando uma mistura de esqualeno e hexadecano, o ponto de congelação da solução de lípido foi aumentada (~ 16 ° C), além disso, os precursores de membrana foram produzidas, que pode ser armazenado indefinidamente e facilmente transportado. Estes precursores de membrana ter reduzido BLM tempo de formação de <1 h e alcançou uma taxa de formação de BLM de ~ 80%. Além disso, as experiências de canal iónico com gramicidina Um demonstraram a viabilidade do sistema de membrana.

Introdução

Artificial membrana bicamada lipídica, ou membrana lipídica preto (BLM), é uma ferramenta importante para a elucidação mecanismos de membranas celulares e canais iônicos, bem como para compreender as interacções entre canais de íons e íons / moléculas ^1-7 Embora o método de patch-clamp. é muitas vezes considerado o padrão ouro para estudos da membrana celular, é trabalhoso e requer operadores altamente qualificados para medições de canais de íons. ⁸ enquanto membranas bicamada lipídica artificialmente reconstituídos surgiram como ferramentas alternativas para estudos de canais iônicos, ^9,10 eles também estão associados com laboriosa processos e conhecimentos específicos. Além disso, as membranas são susceptíveis a perturbações mecânicas. Aplicações práticas, portanto, tecnologias bicamada lipídica introduzidas até à data têm limitado. ¹¹

A fim de aumentar a robustez e a longevidade das membranas de bicamada lipídica, Costello et al. ^12, e IDE e Yanagida ^{13 criaram uma bicamada lipídica free-standing apoiado por hidrogéis. Apesar da longevidade aumentada no entanto (<24 horas), bicamada robustez não melhorou. Jeon et al. 14 inventou uma membrana de hidrogel encapsulado (HEM), com íntimo contato bicamada lipídica hidrogel-, resultando em longevidade aumentada (até vários dias). Para aumentar ainda mais o tempo de vida da bainha, Malmstadt e Jeon et al. Criada uma membrana encapsulado-hidrogel com ligação hidrogel-lípido através in situ covalente conjugação (cgHEM). 15 Em ambos os sistemas, tempos de vida da membrana aumentou substancialmente (> 10 dias) . No entanto, os sistemas de formação de membrana não eram suficientemente robustos, e não pode ser armazenado ou entregue quando necessário para libertar experiência para o uso das bicamadas lipídicas.}

O desenvolvimento de uma plataforma de bicamada lipídica tem girado principalmente em torno crescente robustez e longevidade da MBL. Embora a longevidade de MBL tem sido substantially reforçada recentemente, as respectivas candidaturas foram limitadas devido à falta de transportabilidade e capacidade de armazenamento. Para superar esses problemas, Jeon et al. Criado um sistema de membrana armazenável e introduziu um precursor de membrana (MP). ¹⁶ Para construir uma MP, eles prepararam uma mistura de decano n- e hexadecano contendo 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn-glicero-3-fosfatidilcolina) para controlar o ponto de congelação da solução de lípido tal ordem que não congele a ~ 14 ° C (abaixo da temperatura ambiente, acima da temperatura do típico frigorifico). Nesta experiência, o PM foi espalhada sobre uma abertura pequena em um filme de politetrafluoroetileno (PTFE) e subsequentemente congelado num frigorífico a 4 ° C. Quando o PM foi levada até à temperatura ambiente, a MP descongeladas e uma bicamada de lípido foi formado automaticamente, eliminando a experiência tipicamente associados com a formação da membrana. No entanto, a taxa de sucesso de BLM feita a partir da MP era tão baixa quanto ~ 27%, e formatio membranaN foi inconsistente tempo (30 min a 24 h), o que limita as suas aplicações práticas.

Neste estudo, um polidimetilsiloxano (PDMS) de película fina é usado em vez de um filmes convencionais hidrofóbicos finas (PTFE, polioximetileno, polistireno) a (a) Tempo de controle de fabricação e (b) aumentar a taxa de sucesso da formação de BLM como previamente relatado por Ryu et al. ¹⁷ Aqui, a formação da membrana foi facilitada por extracção de solventes, devido à natureza porosa do PDMS, e o tempo necessário para a formação da membrana foi controlado com sucesso neste estudo. Neste sistema, como a solução de lípido foi absorvido pela película delgada de PDMS, um tempo de formação de membrana consistente foi alcançado. Além disso, a vida útil da membrana foi prolongada devido à absorção lenta de solventes para o PDMS de filme fino, um resultado da adição de esqualeno com a solução de lípido. Realizamos medições ópticas e elétricas para verificar se membranas formadas usando esta técnica são adequados para iem estudos de canais.

Protocolo

1. Preparação de Soluções

1. Preparação de solução tampão:
   1. Para formular uma solução tampão, dissolve-se 1 M de KCl (cloreto de potássio), Tris-HCl 10 (Tris-hidrocloreto), e 1 mM de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) em água destilada e ajustar o pH a 8,0.
   2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,20? M. Para esterilizar, autoclave a solução a 121 ° C durante 15 min.
2. Preparação da solução de lípidos para a pré-pintura:
   1. Para formular a solução de lípido para pré-pintura, dissolver 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl--sn-glicero-3-fosfatidilcolina) lípido (w: v) numa mistura de 2: 8 e n -decano hexadecano (v: v). Agita-se durante a noite utilizando um rotor.
3. Preparação da solução de lipidos para a formação da membrana:
   1. Para formular a solução de lipidos para a formação da membrana, dissolver 0,1% DPhPC (1, 2-sn-glicero diphytanoyl--3-fosfatidilcolina) lípido (w: v) numa mistura de 2: 8 squalene e hexadecano (v: v). Agita-se durante a noite utilizando um rotor.

2. Formação de um PDMS Thin Film

1. Misture PDMS e agente de cura numa proporção de 9: 1 (w / w) em um copo de mistura de modo a formar o pré-polímero de PDMS. Adicionar 5 g de pré-polímero de PDMS para uma placa de Petri de modo a formar o PDMS película fina (espessura de 200-250 um). Espalhe PDMS pré-polímero utilizando um revestidor de centrifugação a 800 rpm durante 10 segundos para formar uma película fina.
2. Colocar a placa de Petri num exsicador de vácuo a uma pressão de 100 mTorr durante 2 h, para remover as bolhas de ar. Para a polimerização a película fina de pré-polímero, cozer num forno durante 5 horas a 70 ° C.
3. A fim de fazer um PDMS quadrados de película fina, cortar a película fina PDMS polimerizado em 2 x 2 cm, ² quadrados. Usar um 500 um micro punção, para se fazer uma abertura no centro do PDMS de película fina. Aberturas pré-pintura com solução DPhPC lípido A 3% misturada em 2: 8 decano n- e hexadecano.

3. Fabricação Câmara e Assembly

1. Para fabricar a câmara de BLM, design dois blocos simétricos da câmara usando o software de desenho 3D com dimensões exteriores de 4 cm x 1,5 cm x 1 cm e dimensões internas poços de 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm ^17.
2. Criar a câmara usando um bloco de PTFE com uma máquina CNC e siga as instruções do fabricante.

4. Conjunto de câmara

1. Para montar a câmara, colocar a película fina pré-pintado-PDMS entre os dois blocos de PTFE de modo a que a abertura na película fina PDMS é alinhado com o orifício na câmara.
2. Selar as bordas exteriores da câmara utilizando uma tampa de vidro com massa (facilitando a observação óptica). Imobilizar a câmara montada utilizando parafusos e porcas.
   NOTA: Certifique-se de que a câmara for bem fechados para que não haja vazamento de líquido.

5. Formação de membrana Precursor com Formação Acelerada de auto-montagem (EMA)

1. Com uma pipeta, depositar 0,5ul de 0,1% de lípidos DPhPC misturado em 2: 8 n -decano: hexadecano para a abertura do PDMS de película fina montado com a câmara.
2. Antes de utilizar, guardar a câmara num congelador ou frigorífico abaixo de 10 ° C.

6. formação da membrana e Verificação

1. Para formar um BLM com MPES, retirar da câmara a partir do frigorífico e suspender a 2 ml de solução de tampão em cada lado da câmara. Defina a câmara de lado por <10 min até o precursor membrana congelada descongela.
2. Coloque a câmara para um micromanipulador para controlar com precisão a elevação com respeito à fonte de luz e ao microscópio. Iluminar um dos lados da câmara, como uma fonte de luz, utilizando um halogéneo iluminador de fibra óptica para iluminar a abertura do PDMS de película fina de observação óptica do processo de formação de BLM.
3. Por outro lado, coloque um microscópio digital verticalmente com respeito à fonte de luz para observar a formação de BLM (ampliar por 200 X).
4. Para confirmar a formação BLM, observar o centro da abertura, onde a cor torna-se mais brilhante do que o anel.

7. gravação elétrica

1. Para a medição elétrica, preparar eletrodos Ag / CL usando um fio de prata 208 um de espessura e água sanitária em hipoclorito de sódio para> 1 min. Colocar os eléctrodos de Ag / CL em cada lado da câmara a uma profundidade suficiente para ser mergulhado na solução tampão.
2. Ligue os eléctrodos ao amplificador de microeletrodos. Utilizando software de electrofisiologia, aplicar uma forma de onda triangular mV ± 10 através da membrana para adquirir uma onda quadrada. Definir a aplicação de tensão, clicando nas setas indicadas na V_clamp (mV).
3. Grave as propriedades elétricas da membrana, clicando no botão de registro (ícone de ponto vermelho). Prosseguir com a gravação até que uma onda quadrada uniforme é observada. Saia a gravação clicando no ícone quadrado preto.

8. Ion Canal Incorporação

NÃOE: Um gramicidina (GA) incorporação ocorre espontaneamente quando da formação de BLM, como GA é adicionado directamente à solução de lípido.

1. Para observar as actividades de canal Ga, aplicam-se 100 mV através da membrana a uma taxa de amostragem de 5 kHz para medir o potencial de membrana que prende. Definir a aplicação de tensão, clicando nas setas indicadas na V_clamp (mV).
2. Grave as propriedades elétricas da incorporação gA clicando no botão de registro (ícone de ponto vermelho). Continuar a gravação até saltos atuais é observado. Saia a gravação clicando no ícone quadrado preto.
3. Após a aquisição de dados elétricos, filtrar os dados com um filtro passa-baixa Bessel a 100 Hz usando um software de eletrofisiologia.
4. Observe saltos atuais na exploração dos dados potenciais filtrada (cada salto atual, ~ 0,15 NS, representa dimerização de um canal iônico GA) para verificar gA incorporação.

Resultados

Optimização das MPE Solução Composição
Diferentes composições de lípidos e solventes foram testados com sucesso para reconstituir membranas de bicamada lipídica da MPES. O sistema de MP com uma mistura de n- decano e hexadecano contendo 3% DPhPC ¹⁴ exibiram uma baixa taxa de sucesso de formação de membrana (~ 27%). Além disso, como o filme de PDMS extraiu-se continuamente solução de lípido, que era necessária para optimizar a c...

Discussão

Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.

As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,^20...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For buffer solution
Tris-hydrochloride	Sigma-Aldrich	1185-53-1	For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60-00-4	For buffer solution
n-decane	Sigma-Aldrich	44074-U	For lipid solution
Hexadecane	Sigma-Aldrich	544-76-3	For lipid solution
Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	For lipid solution
Gramicidin A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit	Dow Corning Asia		To produce PDMS thin film
0.2 μm filter	Satorius stedim	16534----------K	To filter buffer solution
Rotator	FinePCR	AG	To dissolve lipid homogeneously
Autoclave	Biofree	BF-60AC	To sterilize buffer solution
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator	Welch	2042-22	To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch	Harris Uni-Core	0.5	To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine	SME trading	SME 2518	To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator	Motic	MLC-150C	To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope	Digital blue	QX-5	To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode	A-M Systems		To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier)	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)