Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

Zusammenfassung

Wir zeigen eine speicherbare, transportierbar Lipid-Doppelschicht Bildungssystem. Eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann mit mehr als 80% Erfolgsquote innerhalb von 1 h gebildet werden, wenn eine gefrorene Membran Vorläufer auf Umgebungstemperatur gebracht wird. Dieses System wird mühsamen Prozesse reduzieren und Know-how mit Ionenkanälen verbunden.

Zusammenfassung

Eine künstliche Lipiddoppelschicht oder schwarze Lipidmembran (BLM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Ionenkanäle und Protein-Wechselwirkungen, sowie für Biosensor-Anwendungen für die Untersuchung. Jedoch weisen herkömmliche BLM Bildungstechniken mehrere Nachteile, und sie erfordern häufig spezifische Know-how und eine aufwendige Arbeit. Insbesondere leiden herkömmliche BLMs von niedrigen Bildung Erfolgsraten und inkonsistent Membranbildung Zeit. Hier zeigen wir eine speicherbare und transportierbare BLM Erzeugungssystem mit kontrolliertem Ausdünnungs Zeit und verbesserte BLM Bildungsrate von üblicherweise verwendeten Folien ersetzt (Polytetrafluorethylen, Polyoxymethylen, Polystyrol) zu Polydimethylsiloxan (PDMS). In diesem Experiment wird ein poröser strukturierte Polymer wie PDMS-Dünnfilm verwendet. Zusätzlich, im Gegensatz zu konventionell verwendeten Lösungsmitteln mit niedriger Viskosität, erlaubt die Verwendung von Squalen eine kontrollierte Ausdünnungs Zeit über langsame Lösungsmittelabsorption durch PDMS, Membranlebensdauer verlängert wird. In der Werbunghinaus, indem eine Mischung aus Squalen und Hexadecan verwendet wurde, wurde der Gefrierpunkt der Lipidlösung erhöht (~ 16 ° C), außerdem wurden Membranvorläufern hergestellt, die auf unbestimmte Zeit gelagert werden können und ohne weiteres transportiert werden. Diese Membranvorstufen BLM Bildungszeit von reduzierten <1 h und erreicht eine BLM-Bildungsrate von ~ 80%. Außerdem zeigten Ionenkanal Gramicidin A Versuche mit der Durchführbarkeit des Membransystems.

Einleitung

Künstliche Lipiddoppelschichtmembran oder schwarze Lipidmembran (BLM), ist ein wichtiges Werkzeug für die Mechanismen von Zellmembranen und Ionenkanäle, sowie für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Ionenkanälen und Ionen / Moleküle. ^1-7 Obwohl der Patch-Clamp - Methode Aufklären künstrekonstruierte Membranen Lipid - Doppelschicht als Alternative Werkzeuge für die Ionenkanal - Studien wird häufig der Goldstandard für die Zellmembran Studien betrachtet, ist es mühsam ist und hoch qualifizierten Operatoren für Ionenkanal - Messungen erfordert. ⁸ Während entstanden sind, sind ^9,10 sie auch mit mühsamen assoziiert Prozesse und spezifisches Know-how. Darüber hinaus sind Membranen auf mechanische Störungen anfällig. Daher Lipid - Doppelschicht - Technologien bisher eingeführt haben nur begrenzte praktische Anwendungen. ¹¹

Um die Robustheit und Langlebigkeit der Lipidmembranen, Costello et al zu verbessern. ¹² und Ide und Yanagida ^{13 haben eine freistehende Lipid - Doppelschicht von Hydrogelen unterstützt entwickelt. Trotz verbesserte Langlebigkeit jedoch (<24 h) wurde Bilayer Robustheit nicht verbessert. Jeon et al. 14 entwickelt ein Hydrogel verkapselt Membran (HEM) mit intimen Hydrogel-Lipid - Doppelschicht Kontakt, zu einer erhöhten Lebensdauer erreicht wird (bis zu mehrere Tage). Um die Lebensdauer des HEM erhöhen, Malmstadt und Jeon et al. Erstellt ein Hydrogel verkapselt Membran mit Hydrogel-Lipid - Bindung über in-situ kovalente Konjugation (cgHEM). 15 In beiden Systemen Membranlebensdauer deutlich erhöht (> 10 Tage) . Jedoch waren die Membranbildungssysteme nicht ausreichend robust und nicht gespeichert werden könnten oder geliefert, wo der Lipid-Doppelschichten für die Verwendung zu befreien Know-how erforderlich.}

Die Entwicklung einer Lipid-Doppelschicht-Plattform hat sich um zunehmende Robustheit und Langlebigkeit der BLMs in erster Linie drehte. Obwohl die Langlebigkeit der BLMs hat su gewesenbstantially kürzlich verbessert wurden ihre Anwendungen wegen mangelnder Transportfähigkeit und Lagerbarkeit begrenzt. Um diese Probleme zu überwinden, Jeon et al. Eine speicherbare Membransystem erzeugt und stellte eine Membran Vorläufers (MP). ¹⁶ auf einen MP konstruieren, bereiteten sie ein Gemisch aus n- Decan und Hexadecan , enthaltend 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn - glycero-3-Phosphatidylcholin) zur Steuerung des Gefrierpunktes der Lipidlösung , so dass sie bei ~ 14 ° C (unterhalb der Raumtemperatur, oberhalb typischen Kühlschranktemperatur einfrieren würde). In diesem Experiment wurde die MP verteilt auf eine kleine Öffnung auf eine Polytetrafluorethylen (PTFE) -Folie und anschließend in einem Kühlschrank bei 4 ° C eingefroren. Wenn der MP auf Raumtemperatur gebracht wurde, aufgetaut die MP und eine Lipiddoppelschicht automatisch gebildet wurde, die Expertise Eliminieren typischerweise mit Membranbildung verbunden. Allerdings war die Erfolgsquote der BLM vom MP gemacht so günstig wie ~ 27%, und die Membran Formation war inkonsistent (30 min bis 24 h), die Begrenzung der praktischen Anwendungen.

In dieser Studie wird ein Polydimethylsiloxan (PDMS) Dünnfilm anstelle einer herkömmlichen hydrophoben dünnen Filmen (PTFE, Polyoxymethylen, Polystyrol) bis (a) Steuerherstellungszeit und (b) erhöhen die Erfolgsrate der BLM Bildung verwendet, wie zuvor von Ryu berichtet et al. ¹⁷ Hierin wurde die Membranbildung durch Extraktion von Lösungsmitteln erleichtert aufgrund der porösen Natur des PDMS, und die Zeit für die Membranbildung erforderlich war erfolgreich in dieser Studie kontrolliert. In diesem System, da die Lipidlösung in die PDMS-Dünnfilm, eine konsistente Membranbildungszeit absorbiert wurde, wurde erreicht. Außerdem wurde Membranlebensdauer verlängert durch langsame Absorption von Lösungsmitteln in die PDMS-Dünnfilm, ein Ergebnis der Zugabe von Squalen zu der Lipidlösung. Wir führten optischen und elektrischen Messungen zu überprüfen, dass Membranen mit dieser Technik sind für i geeignet gebildetauf den Kanälen Studien.

Protokoll

1. Herstellung der Lösung

1. Herstellung der Pufferlösung:
   1. Formulierung Pufferlösung aufzulösen 1 M KCl (Kaliumchlorid), 10 mM Tris-HCl (Tris-Hydrochlorid) und 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in destilliertem Wasser und pH-Einstellung auf 8,0.
   2. Filtern Sie die Lösung, die ein 0,20 um-Filter. Zu sterilisieren, autoklaviert die Lösung bei 121 ° C für 15 min.
2. Herstellung von Lipid-Lösung für Pre-Malerei:
   1. Um die Lipidlösung für Vorlackierung formulieren, lösen sich 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn - glycero-3-Phosphatidylcholin) Lipid (w: v) in einer Mischung von 2: 8 n decan und Hexadecan (v: v). Rühre über Nacht einen Rotator verwenden.
3. Herstellung von Lipid-Lösung für die Membranbildung:
   1. Um die Lipidlösung für die Membranbildung zu formulieren, lösen sich 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn - glycero-3-Phosphatidylcholin) Lipid (w: v) in einer Mischung von 2: 8 squalene und Hexadecan (v: v). Rühre über Nacht einen Rotator verwenden.

2. Bildung eines PDMS Thin Film

1. Mischungs PDMS und Härter in einem 9: 1 (w / w) -Verhältnis in einem Mischbecher das PDMS-Präpolymer zu bilden. In 5 g PDMS-Präpolymer in eine Petrischale der PDMS-Dünnfilm zu bilden (Dicke von 200 bis 250 & mgr; m). Verbreiten PDMS Vorpolymer einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung bei 800 Upm für 10 sec mit einem dünnen Film zu bilden.
2. Platzieren Sie die Petrischale in einem Vakuumexsikkator bei einem Druck von 100 mTorr für 2 h Luftblasen zu entfernen. das Vorpolymer Dünnschicht, bake in einem Ofen für 5 h bei 70 ° C zu polymerisieren.
3. Um ein Quadrat PDMS dünnen Film zu machen, schneiden Sie die polymerisierte PDMS - Dünnfilm in 2 x 2 cm ² Plätzen. Verwenden Sie einen 500 & mgr; m Mikro Stanze eine Öffnung in der Mitte der PDMS dünnen Film zu machen. Pre-Farbe Öffnungen mit 3% DPhPC Lipidlösung gemischt in 2: 8 n- Decan und Hexadecan.

3. Kammer Herstellung und Assembly

1. Zur Herstellung der BLM Kammer, Design zwei symmetrische Blöcke der Kammer mit Hilfe von 3D Zeichensoftware mit Außenabmessungen von 4 cm x 1,5 cm x 1 cm und Innen gut Abmessungen von 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm ^17.
2. Craft die Kammer einen PTFE-Block mit einer CNC-Maschine und den Anweisungen des Herstellers folgen.

4. Kammerversammlung

1. Um die Kammer montieren, stellen Sie den vorlackiertes-PDMS-Dünnschicht zwischen den beiden PTFE-Blöcke, so dass die Öffnung auf dem dünnen Film PDMS ist mit dem Loch in der Kammer ausgerichtet ist.
2. Verschließen Sie die Außenkanten der Kammer ein Deckglas mit Fett mit (optische Beobachtung zu erleichtern). Unbeweglichkeitseffekt die zusammengesetzte Kammer Muttern und Schrauben verwenden.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kammer gut abgedichtet, so dass es keine Flüssigkeit austritt.

5. Bildung von Membran Precursor mit Beschleunigter Selbstorganisation Formation (MPES)

1. Mit einer Pipette deponieren 0,5ul 0,1% DPhPC Lipid gemischt in 2: 8 n decan: Hexadecan auf die Apertur des dünnen Films PDMS mit der Kammer montiert.
2. Vor der Verwendung speichern die Kammer in einem Gefrierschrank oder Kühlschrank unter 10 ° C.

6. Membranbildung und Verifikation

1. Um einen BLM mit MPES bilden, ziehen Sie die Kammer aus dem Kühlschrank und suspendieren 2 ml Pufferlösung in jeder Seite der Kammer. Stellen Sie die Kammer beiseite für <10 min, bis die gefrorene Membran Vorläufer auftaut.
2. Platzieren Sie die Kammer auf einen Mikromanipulators genau zu steuern die Höhe in Bezug auf die Lichtquelle und das Mikroskop. Ausleuchten einer Seite der Kammer als eine Lichtquelle eine Halogenfaseroptischen Illuminator mit der Apertur der PDMS-Dünnfilm für eine optische Beobachtung der BLM Bildungsprozesses zu erhellen.
3. Auf der anderen Seite, legen Sie ein digitales Mikroskop vertikal in Bezug auf die Lichtquelle BLM Bildung zu beobachten (vergrößern um 200X).
4. Um BLM Bildung bestätigen, beachten Sie die Mitte der Öffnung, wo die Farbe heller als der Ringspalt wird.

7. Elektrische Aufnahme

1. Für die elektrische Messung vorbereiten Ag / Cl Elektroden eine 208 um dicke Silberdraht und Bleichmittel in Natriumhypochlorit> 1 min verwendet wird. Platzieren Sie die Ag / Cl Elektroden in jeder Seite der Kammer, tief genug eingetaucht werden in die Pufferlösung.
2. Die Elektroden an der Mikroelektrode Verstärker. Mit Elektro Software, wenden Sie einen ± 10 mV Dreieckwellenform über die Membran eine Rechteckwelle zu erwerben. Stellen Sie Anlegen einer Spannung durch die Pfeile auf V_clamp (mV) angegeben klicken.
3. Notieren Sie sich die elektrischen Eigenschaften der Membran durch die Record-Taste (roter Punkt-Symbol) klicken. Fahren Sie mit der Aufzeichnung, bis eine einheitliche Rechteckwelle beobachtet wird. Beenden Sie die Aufnahme durch das schwarze Quadrat-Symbol klicken.

8. Ionenkanal-Incorporation

NICHTE: Gramicidin A (gA) der Einbau erfolgt spontan bei der Bildung von BLM als gA ist direkt mit der Lipidlösung zugegeben.

1. gA Kanal Aktivitäten gelten 100 mV über die Membran bei einer Abtastrate von 5 kHz zu messen Haltepotential der Membran zu beobachten. Stellen Sie Anlegen einer Spannung durch die Pfeile auf V_clamp (mV) angegeben klicken.
2. Notieren Sie sich die elektrischen Eigenschaften des gA-Einbau durch die Record-Taste (roter Punkt-Symbol) klicken. Gehen Sie die Aufzeichnung, bis der Strom Sprünge beobachtet wird. Beenden Sie die Aufnahme durch das schwarze Quadrat-Symbol klicken.
3. Nach dem elektrischen Datenerfassung, die Daten filtern, mit einem Tiefpass-Bessel-Filter bei 100 Hz eine Elektro Software.
4. Beachten Sie Stromsprünge in der gefilterten Haltepotential Daten (jeder Stromsprung, ~ 0,15 nS, stellt Dimerisierung eines gA Ionenkanal) gA Einbau zu überprüfen.

Ergebnisse

Optimierung der MPES Lösung Zusammensetzung
Verschiedene Zusammensetzungen von Lipiden und Lösungsmittel wurden getestet, um erfolgreich Lipid-Bilayer-Membranen aus MPES rekonstituieren. Das MP - System mit einem Gemisch aus n- Decan und Hexadecan , enthaltend 3% DPhPC ¹⁴ zeigte eine geringe Erfolgsrate der Membranbildung (~ 27%). Zusätzlich kann, wie kontinuierlich Lipidlösung extrahiert die PDMS-Film war es erforderlich, die Lösungsmitte...

Diskussion

Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.

As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,^20...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For buffer solution
Tris-hydrochloride	Sigma-Aldrich	1185-53-1	For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60-00-4	For buffer solution
n-decane	Sigma-Aldrich	44074-U	For lipid solution
Hexadecane	Sigma-Aldrich	544-76-3	For lipid solution
Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	For lipid solution
Gramicidin A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit	Dow Corning Asia		To produce PDMS thin film
0.2 μm filter	Satorius stedim	16534----------K	To filter buffer solution
Rotator	FinePCR	AG	To dissolve lipid homogeneously
Autoclave	Biofree	BF-60AC	To sterilize buffer solution
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator	Welch	2042-22	To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch	Harris Uni-Core	0.5	To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine	SME trading	SME 2518	To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator	Motic	MLC-150C	To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope	Digital blue	QX-5	To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode	A-M Systems		To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier)	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)