הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

Summary

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Abstract

המאפיין העיקרי של חסינות לחות הוא ליצור ASCs התפקודית, אשר לסנתז ולהפריש Abs הספציפי לאנטיגן (Ag), כגון פתוגן, ומשמש הגנה מארחת. לקביעת כמותי של המצב התפקודי של התגובה החיסונית הלחות של אדם, הן Abs בסרום ASCs במחזור נמדדים בכינויו readouts פונקציונלי. אצל בני אדם, דם היקפיים הוא מדגם הנוחה ביותר ונגיש בקלות, שניתן להשתמש בהם לצורך קביעת התגובה החיסונית הלחות שהושרו על ידי תאי B המארח. B-cell ברור תת, כולל ASCs, ניתן לבודד ישירות מדם היקפי באמצעות בחירה עם microbeads שושלת ספציפית Ab מצומדות או באמצעות מיון תא עם cytometry זרימה. יתר על כן, תאי B נאיביים וזיכרון מטוהרים יכולים להיות מופעל בדיל לתוך ASCs בתרבות. הפעילות התפקודית של ASCs לתרום הפרשת Ab ניתן לכמת על ידי ELISPOT, המהווה assay כי מתכנס אנזיםassay immunoabsorbance -linked (ELISA) וטכנולוגיות מערביות סופג כדי לאפשר הספירה של ASCs הנפרד ברמת התא הבודד. בפועל, assay ELISPOT נעשה שימוש יותר ויותר להעריך יעילות החיסון בגלל הקלות של טיפול של מספר רב של דגימות דם. שיטות לבודד תאי B האדם מן הדם ההיקפיים, את הבידול של תאי B לתוך ASCs במבחנה, ואת העסקתם של ELISPOT כימות של IgM- סך IgG-ASCs שיתואר כאן.

Introduction

תאי B למלא תפקיד מרכזי בפיתוח של חסינות לחות. בהתחלה הוא לפתח במח העצם ולהיכנס לזרם הדם כמו תאי B נאיביים, אשר ניתן להעביר לתוך הרקמות הלימפה, כמו הטחול, בלוטות הלימפה, ואת שקדים, להמשך פיתוח. לאחר מפגש Ag, כמה תאי B נאיביים לנדוד לתוך זקיקי הלימפה, שם מרכז נבטי תאי B יכולים להתמיין לתאי B זיכרון plasmablasts (PBS) / תאי פלזמה (מחשבים). בעוד שרוב PBS / מחשבי היציאה לתוך זרם הדם, כמה בסופו של דבר להתגורר במח העצם כדי לעבור התמיינות מסוף מחשבי חיים ארוכים ^1. תאי B שבמחזור הם הטרוגניות, ו על מצב יציב, מחשבי PBS / הם נדירים בדם היקפי ^2. כתוצאת הזמינות של סמני משטח ספציפי שושלת, cytometry זרימה הפכה שיטה פופולר

Protocol

דם היקפי אדם יש לקבל מתורמים בריאים תחת הסכמה מדעת, ושימוש דגימות דם חייב לעמוד בהנחיות שאשרו שהקימו לוחות סקירה מוסדיים בודדים. במחקר זה, כי הפרוטוקול משתמשים בדם אדם בהפגנה של תוצאות cytometry זרימה (איור 1) מבחני ELISPOT (איור 3) אושרה על ידי המועצה לביקורת פנימית של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי בטייוואן (מספר פרוטוקול 201307019RINB).

בידוד וטיהור 1. של אדם תאי הדם ההיקפי B

1. צייר ~ 10 מ"ל של דם מהעורק cubital החציוני (ב הקדמי fossa cubital עד המרפק) לתוך

תוצאות

PBMCs היו מתרוקנים של RBCs ותאי חסיד (שלבים 1.2 כדי 1.7). דוגמא מתמיסה בסיסית (2 x 10 ⁶⁾ של תאים היו נתוני ניתוח התזרים cytometric כדי להמחיש את האוכלוסיות של תאי B נאיביים, תאי B הזיכרון, PBS / מחשבים בדם היקפי (איור 1). בשנת PBMCs של תורם זה, כ -10% של לימפוציטים ?...

Discussion

בידוד וטיהור של אדם תאי הדם ההיקפי B

בדרך כלל, RBCs ניתן מקרע ביעילות מסומן על ידי חיץ תמוגה (שלב 1.2). חשוב לא כדי לדגור PBMCs עם למאגר תמוגה RBC יותר מ -5 דקות, כפי כדאיות התא עלול להיות מושפע אמוניום כלוריד. לחלופין, RBCs וטסיות ניתן להסיר זמני?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 ml tube
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set	BD Biosciences	558007
Biotinylated CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Streptavidin magnetic microbeads	BD Biosciences	9000810
15 ml Falcon tubes	BD Falcon	352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-human CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-human CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-human CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-human CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-human CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-human CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinylated anti-human CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinylated anti-human CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	type B CpG
Recombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Recombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Recombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size	Merck Millipore	MSIPS4510	sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-095
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer	C.T.L.