Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Özet

humoral bağışıklık damgasını sentez ve bir patojen olarak bir antijen (Ag), özel Abs salgılar ve ana savunma için kullanılan fonksiyonel TSK, üretmektir. Bir bireyin hümoral bağışıklık tepkisinin fonksiyonel kantitatif tayini, serum Abs ve dolaşan TSK hem yaygın fonksiyonel çıktılan olarak ölçülür. İnsanlarda, çevresel kan ana B hücreleri tarafından ortaya hümoral bağışıklık tepkisinin saptanması için kullanılabilecek en uygun ve kolayca erişilebilir bir örneğidir. TSK kapsamda, farklı B hücresi alt-gruplar, akış sitometrisi ile sıralama seri spesifik Ab-konjuge mikro-veya hücre aracılığıyla seçim yoluyla periferal kandan doğrudan izole edilebilir. Ayrıca, arıtılmış naif ve bellek B hücreleri, aktive edilmiş ve kültür TSK olarak ayırt edilebilir. Ab salgılama katkıda TSK fonksiyonel aktivitesi, Enzim yakınsar bir deney olan, elispot testi ile tayin edilebilirB-bağlı immunoabsorbance deneyi (ELISA) ve Western lekeleme teknolojileri tek hücre düzeyinde tek tek TSK numaralandırılmasına sağlamaktır. Uygulamada, ELISPOT testi artan için kan örnekleri, çok sayıda kullanım kolaylığı aşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Periferik kandan insan B hücrelerini izole edilmesi yöntemleri, in vitro TSK olarak B hücrelerinin farklılaşmasını ve toplam IgM- IgG-TSK miktarının ELISPOT istihdam burada tarif edilecektir.

Giriş

B hücreleri, humoral bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynar. Onlar başlangıçta kemik iliğinde gelişir ve daha da geliştirilmesi için naif gibi dalak gibi lenfoid dokularda geçebilecek B hücreleri, lenf düğümleri ve bademcikler, kan akışı girin. Ag karşılaşma üzerine, bazı naif B hücreleri germinal merkez B hücreleri bellek B hücreleri ve plazmablastlar (PB) / plazma hücrelerinin (PC) içine ayırt edebilirsiniz lenfoid follikül içine göç ederler. En PB / PC'ler kan akışına çıkış yaparken, birkaç sonunda uzun ömürlü PC'ler 1 içine terminal farklılaşma geçmesi kemik iliğinde bulunur. Dolaşımdaki B hücreleri heterojen ve kararlı durumda, PB / PC'ler, periferik kanda 2 nadirdir. seri spesifik yüzey markerlerinin durumunu bir sonucu olarak, akış sitometrisi periferik kanda B-hücresi alt kümelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için uygun bir yöntem haline gelmiştir. Akış cytometr bir genişletilmiş uygulamaY, yüksek saflıkta ayrılmasını ve B hücrelerinin tek tek alt kümelerinin izole edilmesine izin veren, bir hücre sıralayıcı fonksiyonu eklenmesidir. İnsan dolaşımdaki B hücreleri, genel olarak üç temel alt popülasyonları sınıflandırılır farklı gelişim aşamalarında spesifik yüzey reseptörlerinin ekspresyonu göre: bellek B hücreleri (CD19 + CD27 + CD38 -) saf B hücreleri - (- CD38 CD19 + CD27) ve PB / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Şekil 1). doğası gereği Naif B hücreleri Ag'lerini karşılaşmadım. Bununla birlikte, IgM + CD27 + bellek B hücrelerine ayırt edilebilir. Naif B hücreleri B-hücresi antijen reseptörü (BCR) -associated molekülleri (örneğin, CD19, CD20 ve CD22) onların immünoglobulin repertuarı 5 heterojen ifade homojen olmasına rağmen. CD27 + bellek B hücrelerinin büyük bir çoğunluğu CD27 olarak ayırt edilebilir+ / hi CD38 + PB / PC'ler 6. Buna ek olarak, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC poliklonal ve gelişimsel ve fonksiyonel heterojenliği 4-7 sergiler. dolaşımda PB / PC'ler normalde kısa ömürlü ve CD138 ifade etmezler, ancak kemik iliğinde yerleşmek için yapılanlar ölümcül farklılaştırmak ve uzun ömürlü olacaktır. Terminal farklılaşmış PC'ler CD138 ifade ve yüzeyleri 8 CD27 molekülleri aşağı-düzenler. PB ve PC'ler hem Abs salgılayan yeteneğine sahip olduğundan, pek çok kez onlar topluca TSK olarak belirtilir. Buna mukabil, naif B hücreleri de bellek B hücreleri de Abs 9-10 kayda değer miktarda üretebilir. Uygun kültür koşulları 6, 11-15 yerleştirildiğinde 10 gün - izole Yine de, hem naif ve bellek B hücreleri 3 TSK içine ayırt edilebilir. Aslında, TSK bu doğrudan izole fr ile CD27 ve CD38 in vitro farklılaştırma payı benzer yüzey ifadeler türetilmişom periferik kan 6. Buna ek olarak, in vitro farklılaşan TSK bu PBS / PC 6 dolaşan benzer yüzey CD20 düşük seviyede eksprese eder. kültür kaynaklı TSK tüm kısa ömürlü olmasına rağmen, onlar işlevsel yetkin ve hümoral bağışıklık katkıda mümkün olduğunu belirten Abs salgılar olabilir.

kadar en sık uygulanan yöntemler hümoral immün yanıta fonksiyonel bilgi elde etmek için ELISA ve ELISpot hem de. ELISA 96 gözlü plaka bazlı deney, ve sık sık, serum Ag-spesifik Abs ve diğer analitler (örneğin, sitokinler) titreleri ölçmek için kullanılır. Bu uygun ve ölçeklenebilir. ELISA Sıvı bir numunede 16, ABS veya serum gibi diğer maddelerin varlığını tespit etmek için bir katı-faz enzim tahlili kullanmak üzere tasarlanmıştır. Serum ELISA ile ilgili okumalar yaygın vücudun bağışıklık tepkisini temsil etmek için kullanılmaktadır. yeniden kazanılması için gerekli bir araçELISA tahlilleri ile ilgili adouts bir spektrofotometrik mikroplaka okuyucu. Okuyucu, tipik olarak yaban turbu peroksidazı (HRP) ile birleştirilmiş bayır algılama Abs ve spesifik alt tabakalar 17 reaksiyonundan elde edilen son ürünlerin optik yoğunluk (OD) belirleyebilir. humoral immün tepkisi raporlama ile ilgili olarak, ELISA ile tespit serum antikor düzeyleri vücutta TSK toplu, ancak tek tek değil, performans belirtmektedir. Buna ek olarak, ELISA dikkate Abs salgılar yok bellek B hücreleri tarafından katılımını almak için başarısız olur.

ELISA gibi, ELISpot tespit ve periferik kan örnekleri 17-18 bağışıklık yanıtı izlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. ELISPOT bir sandviç ELISA ile ilgili bir tekniktir. İçinde hücre polivinilidin diflorin (PVDF) kısa süreli bir kültür 96 çukurlu mikrolevhaların membran destekli kuyu içine yerleştirilir. ELISpot tahlil bir mikroplaka ve developin batı blotting gerçekleştirmeden benzerdirg her kuyuda PVDF zarı üzerinde lekeler. Bir otomatik ELISpot okuyucu sistemi veya elle sayım için bir stereomikroskopta gereklidir. bir bağışıklık tepkisinin tespit bölgesindeki ELISPOT ana avantajı TSK ve sitokin salgılayan hücrelerin miktarının onun süper hassasiyettir. Sırasıyla, humoral ve hücresel bağışıklık işlevsel faaliyetlerini bildirir. Hümoral bağışıklık fonksiyonu ölçümünde, ELISA ve ELISPOT tarafından numaralandırılan TSK sayısına göre belirlenir serum Ab düzeyleri sıklıkla ilişkilidir, ancak bu iki deneyleri veri readouts fonksiyonel etkileri 19-20 bazı farklılıklar var. ELISPOT ana avantajı yönteminin onun hassasiyetidir. Abs uygun izotiplerinin bilinen bir miktarı, referans olarak dahil edildiğinde, ELISA ile belirlendiği şekilde, serum antikor titrelerinin seviyesi konsantrasyon çıktılan olarak, daha çok nicel göre antikor seviyesi gösteren OD çıktılan olarak da yarı-nicel olarak sunulmaktadır, ya da. Bunun aksine, ELISPOT sonuçları presente olanilgi konusu bir hücre havuzu TSK mutlak sayısı D (ör bölünmemiş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ve PBMC'lerden Saflaştırılmış B hücreleri) içerir. ELISpot tek ASC algılayabilir, ancak ELISA ölçümden önce optimize tahlil bağımlı konsantrasyonları ulaşmak için TSK dan Ab miktarda gerektirir. Bu nedenle, ELISpot ölçümü duyarlılığı ELISA besbelli üstündür. Ayrıca, ELISPOT, aynı zamanda aktive edilmiş hafıza B hücreleri in vitro farklı TSK ölçülmesi için uygundur. Bellek B hücreleri Abs salgılar yok ama aktivasyon üzerine TSK içine ayırt edebilirsiniz; bu nedenle ELISA ile tespit edilen serum Abs hiçbir katkısı var. Bu nedenle, ELISPOT kültüründe aktif hale bellek B hücrelerinin, dolaşımdaki bağışıklık tepkisinin ölçümü tercih edilen bir yöntemdir. Uzun vadeli humoral bağışıklığın bakım izlenmesi için izin verir.

Protokol

İnsan periferal kan aydınlatılmış onam altında sağlıklı donörlerden elde edilen edilmeli ve kan örneklerinin kullanılması bireysel kurumsal inceleme kurulları tarafından kurulan onaylanan yönergelere uyması gerekir. Bu çalışmada, protokol Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi İç İnceleme Kurulu (protokol numarası 201307019RINB) tarafından onaylandı akış sitometri (Şekil 1) ve ELISpot deneyleri (Şekil 3) sonuçlarının bir gösteriye insan kanı kullanmak için.

1. İzolasyon ve insan çevre kan B hücreleri ile saflaştırılması

  1. K 2 EDTA (1,5-2,0 mg / ml kan) içeren bir 15 ml tüp içine (dirsek kübital fossa anterior) medyan kübital damardan kan ~ 10 mL çizme ve Tüp hemen pıhtı önlemek için birkaç kez ters çevirin oluşumu.
  2. Kırmızı kan hücresi (RBC), tampon (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3 ve 1 mM EDTA lizis (121 ° C, 15 dakika) otoklava 35 mL ekleme sTaze kan örneği (≥ 3 içeren tüp H 7.4): 1 hacim / hacim) ve bundan sonra daha 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir.
    NOT: tüp aracılığıyla ışık geçirgenliği görünümü RBC lizis tamamlandığını gösterir.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. pelet beyaz renklidir olduğundan emin olun.
  4. 10, otoklavdan geçirilmiş fosfat tamponlu tuz mL pelletini (PBS, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4 ve 1.47 mM KH 2 PO 4; pH 7.4) ve 1.3 adım olarak santrifüj.
  5. Süpernatantı atın ml RPMI 1640 ortamında (takviyeleri:% 10 fetal buzağı serumu, 100 U / ml penisilin / streptomisin, 0.25 ug / ml amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin) 10 pelletini, ve sonra plaka 10 cm'lik bir kültür tabağı içine hücreleri (tabak başına 10 ml kan). 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör çanak yerleştirin.
  6. Yavaşça kültür çanak birkaç kez girdap ve koyun15 ml plastik konik tüpler içine kültür ortamı (süspansiyon hücreleri). kültür yemekleri yapışık hücrelere (çoğunlukla makrofajlar) atın.
  7. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
  8. RPMI 1640 ortamı içinde 1 mL pelletini. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını sayın.
    Not: İzole lökositlerin canlılığı normal tripan mavi dışlama% 90 daha büyüktür.
  9. Aşama 1.7 olarak santrifüj ve 5 konsantrasyonda soğuk PBS tampon (% 0.5 inek serumu albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) içinde ~ 200 uL hücreler tekrar süspansiyon - 10 x 10 6 hücre / mL idi.
  10. 10 6 hücre başına (B hücrelerinin negatif seçim için) kan hücrelerine spesifik biyotinile edilmiş anti-insan antikor kokteyli 5 uL ilave edin ve 30 dakika 21 buz üzerinde inkübe edilir.
    Not: Anti-insan antikor kokteyli, en azından CD2 (ya da CD3), CD14, CD16 özgü Abs içermelidir.
  11. 10 kat fazla hacim eklemesteril PBS hücreleri, 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ve süpernatant atmak.
  12. Eşit streptavidin-konjuge mikroboncuk miktarda pelet (10 6 hücre başına 5 uL) ilave edin ve iyice karıştırın.
  13. 15 ml plastik konik bir tüp içinde, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  14. tüpe PBS tamponu 2 mL ekleyin.
  15. Manyetik bir stand içine tüp yerleştirilir ve 8 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Kahverengi mikroboncuklarının yavaş yavaş yanında mıknatıs 22 tüp duvar eklenecektir.
  16. Manyetik stand kalan tüp ile, dikkatli bir şekilde yeni bir steril 15-ml tüp 22 içine süpernatant aktarın.
  17. Tekrarlayın 1.16 ile 1.14 arasındaki adımları ve el değmemiş B hücrelerini içeren iki süpernatantlar birleştirir. mikrobilyeleri atın.
  18. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
  19. alt deneyler için RPMI 1640 ortamında pelletini.
    NOT: Genellikle, 1-5 x 10 5 B hücreleri zekâhektar periferik kan, 10 mL% 95 daha yüksek saflıkta 23 izole edilebilir.

İzole B Hücreleri 2. saflaştırılması ve Bellek Ayırma ve naif B Hücreleri

  1. Adım 1 saflaştırılmış hücreleri kullanın ve bir hemasitometre ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayısını belirlemek.
  2. 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ve oda sonra soğuk PBS tampon 100 ul hücrelerin tekrar.
  3. Kapalı 1 - 10 6 hücre başına biyotinile CD27 mAb'nin 2 ug ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  4. 5 dakika boyunca 600 x g'de tüp ve santrifüj PBS tamponu 10 mL ekleyin.
  5. Süpernatantı atın ve PBS tampon 50 mcL hücreleri tekrar süspansiyon.
  6. 15 ml plastik konik tüp hücrelere - (2 ug / 10 6 hücre 1) streptavidin manyetik mikro boncuklar eşit miktarda ekleyin.
  7. Yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  8. tüpe PBS tamponu 3 mL - 2 ekleyin.
  9. YeriManyetik bir stand içine boru ve kahverengi bir mikro-mıknatıs en yakın tarafına takmak için izin 8 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  10. manyetik stand tüp ile, dikkatli bir şekilde yeni bir steril tüpe süpernatant fraksiyonu aktarın. Naif B hücreleri - Bu fraksiyon zenginleştirilmiş CD27 içerir.
  11. Mikroboncuklar içeren tüp 5 ml ilave edilir ve yavaşça, mikro-boncuklar tekrar süspansiyon (örneğin, CD27 + bellek B hücrelerinin zenginleştirilmiş fraksiyon) 24-25.
  12. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. alt deneyler için RPMI 1640 ortamı ile pelet yeniden süspanse edin.
    Not: Genellikle, ~ 30 - B hücreleri% 60 sağlıklı donörden 7, 25-26 PBMC'lerden CD27 + bellek hücresi saflaştırılabilir.

Naif B Hücreleri, Bellek B Hücreleri ve PB / PC'ler Tahsil sıralama 3. Hücre

  1. 1 aşamasından gelen arıtılmış, hücreleri kullanarak, bir hemocytome kullanılarak hücre sayısını belirlemekter ya da otomatik hücre sayacı.
  2. 5 ml polistiren tüp içinde 10 7'deki mL konsantrasyonda soğuk PBS tamponunda tekrar süspansiyon hücreleri.
  3. Kapalı 1 - 10 6 hücre başına, insan IgG 2 ug ve Fc blok için, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  4. 1 ug her bir ekleme, anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323) ve anti-CD38-PE (klon: HIT2), 10 6 hücre başına; karıştırın ve 30 dakika 4, 27 için buz üzerinde inkübe edilir.
  5. Adım 3.4 son 5 dakika içinde, ticari 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 5 mcL ekleyin.
  6. 5 dakika boyunca 600 x g'de tüp, girdap ve santrifüj 2 mL PBS ekleyin.
  7. 15 ml bir tüp içinde mL başına 5 x 10 7 hücre - 1 bir konsantrasyonda (% 2 BSA ve 2 mM EDTA ile, steril PBS) tampon sıralama tekrar süspansiyon hücreleri.
  8. hücre kümeleri ortadan kaldırmak için bir naylon örgü hücre süzgecinden (40 mikron gözenek boyutu) aracılığıyla hücrelere Filtre.
  9. bir akış sitometri tür hücreleri ayırınmor (405 nm), mavi (488 nm) ve kırmızı (640 nm): er üç lazer ile donatılmış.
    NOT: 3 renkli sitometri 27-28 akış yalnız mavi lazer yeterlidir.
  10. Sıralama, üç saf B hücrelerinin aynı anda toplama (5 ml RPMI ortamı ihtiva eden) 15 ml tüpler (CD19 + CD27 -) içine hücreleri, hafıza B hücreleri (CD19 + CD27 +), ve PBS / PC (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28.
    Not: Aşama 4'te tarif edildiği gibi kriteri naif ve bellek B hücreleri, kültürlenebilir.

Naiv B hücreleri - izole edilmiş insan CD19 + B hücreleri, CD19 + CD27 + hafıza B hücreleri, ve CD19 + CD27 in vitro ayrımında 4.

  1. adımlarda 1.19, 2.10, 2.11 ve 3.10 olarak saflaştırılmış hücreleri kullanarak, bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını belirlemek.
  2. RPMI 1640 ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri1 bir konsantrasyonda - ve ml başına 10 X 10 5, 12 oyuklu plakanın kuyularına kısım.
  3. / Ml 18, 29 5 mg / 10 6 hücre CpG (ODN 2006) ekleyin.
  4. Kültür, 5 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör hücreleri.
  5. Her bir oyuğa hücreleri hasat 15 ml tüpler içinde ayrı ayrı yer, her tüpe 5 ml PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 600 x g'de ve oda sıcaklığında santrifüj.
  6. Hemasitometre ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak. RPMI 1640 ortamı ile mL başına 10 X Ekim 5-1 arasında bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri.

5. ELISPOT testi

  1. 30 s için ELISPOT levhaların her çukuruna damıtılmış su içinde% 35 etanol içinde 30 uL ekleyin.
    NOT: pipetlerken zaman her zaman kuyularda membran dokunmaktan kaçının.
  2. etanol kaldırmak için ELISpot plakları ters çevirin.
  3. Her kuyuya 150 ul otoklava GKD 2 O koyun ve inkübe5 dakika boyunca oda sıcaklığında bunları bakiye Etanol temizlemek için; 3 dakika boyunca oda sıcaklığında steril PBS yıkama ile takip edin.
    NOT: 5.3 5.1 plakaların imalatı bağlı isteğe bağlı olabilir adımlar.
  4. Adına 5 ug / ml poliklonal F (ab ') anti-insan Ig (IgG + IgM + IgA) 2 fragmanı, 50 uL bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe (PBS içinde) ELISPOT plakaların her kuyuya ve (tercih edilir) ya da 2 saat 11 süreyle 37 ° C.
    NOT: kullanılıncaya kadar Parafilm ile plakaların kenarları mühür.
  5. 3 dakika her zaman için oda sıcaklığında iki bağlanmamış Abs kaldırmak her iyi PBS 200 mcL ekleyin ve bunları inkübe plakları ters çevirin.
  6. de bloke edilmesi için her bir% 5 BSA (ya da RPMI 1640 ortamı) 200 ul PBS ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe.
  7. engelleme tampon kaldırmak için plakları ters çevirin. Aşama 5.5 olarak PBS, 200 uL her bir iki kez yıkayın.
  8. Her bir oyuğa RPMI 1640 ortamı, 100 uL ilave edin ve 37 ° C'de inkübe.
  9. hazır hücreleri tohum olduğunda, RPMI 1640 orta kaldırmak için plakları ters çevirin.
  10. Tohum 100 uL (5 x 10 4), 50 uL (2.5 x 10 4) ve bir kuyu içine 25 uL hücre (1.25 x 10 4) (adımlar 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 ile ilgili ve 4.6) ELISpot plaka. RPMI 1640 ortamı ile, / oyuk 150 uL hacim getir.
    Not: hücreleri kaplama için bir ya da iki 2-kat seri seyreltiler en az tavsiye edilir.
  11. 14 saat 18-8 için% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör inkübe edin. inkübasyon sırasında plakalar hareket kaçının.
  12. hücreleri ve RPMI 1640 orta kaldırmak için plakları ters çevirin.
  13. 3 dakika boyunca, oda sıcaklığında, her zaman 5 kez (% 0.05 Tween 20 ile PBS) 200 uL / ​​göz PBS-T ilave edin ve inkübe. 5 yıkar her biri arasındaki yıkama tamponu çıkarmak için plakayı ters çevirin.
  14. Keçi anti-insan IgG-alkalin fosfataz (AP), Fcy özgü Abs ya ekleme (IgG tespiti, 1: 5000 PBS-T içinde) Ya da keçi anti-insan IgM-AP, Fcμ fragmanı spesifik Abs (IgM algılama, 1: PBS-T içinde 5,000) tahsis edilen gözleri içinde ve karanlıkta, 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  15. Aşama 5.5 olarak PBS, 200 uL her bir iki kez yıkayın.
  16. 50 uL / ​​oyuk bromochloroindolyl fosfat nitro mavi tetrazolyum (BCIP / NBT) alt-tabaka çözeltisi ekleyin. 15 dakika - Mor renkli lekeler normalde 5 görünür.
  17. Noktalar aşırı gelişimini önlemek için 100 uL / oyuk GKD 2 O ekleyin.
  18. tüm noktalar tam gelişiminden sonra akan musluk suyu ile plakaları durulayın.
  19. Plakaların Alt drenaj çıkarın ve onları karanlıkta kuru hava için izin verir.
  20. Bir görüntü alıcı / analiz ünitesi (örneğin, otomatik bir tarayıcı veya manuel bir mikroskop ile) ile otomatik bir plaka okuyucusu kullanılarak noktalar sayın.
    NOT: plakalar, karanlıkta oda sıcaklığında saklanır ve daha sonra analiz edilebilir.

Sonuçlar

PBMC'ler eritrosit ve yapışık hücrelere (1.7 1.2 adımlar) tükenmiş bulundu. Hücrelerin bir tümböleni (2 x 10 6) periferal kan (Şekil 1) saf B hücreleri, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC popülasyonunu gösteren bir akış sitometrik analizi yapıldı. Bu vericinin PBMC'ler olarak, lenfositler, yaklaşık% 10 CD19 + B hücreleri idi. B-hücresi bölümünde, CD19 + CD27 yüzdesi - naif B hücreleri% 50 civar...

Tartışmalar

İzolasyon ve İnsan periferal kan B hücrelerinin saflaştırılması

Normalde, RBCs verimli rüptüre ve lizis tamponu (adım 1.2) tarafından silinebilir. hücre canlılığı amonyum klorür ile etkilenebilir gibi, 5 dakika daha uzun RBC parçalama tamponu ile PBMC'ler inkübe önemlidir. Seçenek olarak ise, RBC ve trombositlerin aynı zamanda aşağıdaki protokol ile temizlenebilir.

asit dekstroz sitrat (ACD) tamponu taze tam kan karıştırın (39 mM sit...

Açıklamalar

The author declares no competing financial interests.

Teşekkürler

This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Vacutainer K2EBD Biosciences36752510 ml tube
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solutionBiological Industries03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment setBD Biosciences558007
Biotinylated CD27 mAbBiolegend302804clone O323
Streptavidin magnetic microbeadsBD Biosciences9000810
15 ml Falcon tubesBD Falcon352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μmBD Falcon352340
Anti-human CD19-APCBiolegend302212clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450eBioscience48-0279-42clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7Biolegend303516clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7BD Biosciences560677clone HIT2 
Anti-human CD45-FITCBiolegend304006clone HI30
Anti-human CD45-FITCBD Biosciences555482clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5Biolegend124213clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5BD Biosciences65429clone L128
Anti-human CD19-FITCMiltenyi Biotec130-098-064clone LT19
Anti-human CD19-FITCGeneTexGTX75599clone LT19
Anti-human CD20-FITCBD Biosciences555622clone 2H7
biotinylated anti-human CD27Biolegend302804clone O323
biotinylated anti-human CD27eBioscience13-0279-80clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)BD Biosciences559925
CpG (ODN 2006) InvivoGentlrl-2006type B CpG
Recombinant human IL-2PeproTech200-02
Recombinant human IL-10PeproTech200-10
Recombinant human IL-21PeproTech200-21
Recombinant human sCD40LPeproTech310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC)Sigma-Aldrich82526
Pokeweed mitogen (PWM)Sigma-AldrichL9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore sizeMerck MilliporeMSIPS4510sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solutionSigma-AldrichB6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrateMerck MilliporeES006
Human IgGJackson ImmunoResearch009-000-003
Human IgG, Fc fragmentJackson ImmunoResearch009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)Jackson ImmunoResearch109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specificJackson ImmunoResearch109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specificJackson ImmunoResearch109-055-095
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specificJackson ImmunoResearch109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specificJackson ImmunoResearch109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kitBD Biosciences551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzerC.T.L.

Referanslar

  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
  21. Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ImmunologySay 118T pnsan tedavisindeh moral imm niteperiferal kan monon kleer h creleriB h crezolasyonfarkl la maantikor salg layan h crelerenzim ba l imm nospotenzime ba l Immunoabsorbance deneyiak m sitometrisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır