L'isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

Résumé

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Résumé

La caractéristique de l'immunité humorale est de générer ASCs fonctionnels qui synthétisent et sécrètent Ab spécifique à un antigène (Ag), par exemple un agent pathogène, et sont utilisés pour la défense de l'hôte. Pour la détermination quantitative de l'état fonctionnel de la réponse immunitaire humorale d'un individu, à la fois sérique et d'ABS ASCs de circulation sont généralement mesurés comme des lectures fonctionnelles. Chez l'être humain, le sang périphérique est l'échantillon le plus commode et facilement accessible, qui peut être utilisé pour la détermination de la réponse immunitaire humorale induite par les cellules hôtes B. sous-ensembles distincts de lymphocytes B, y compris les ASC, peuvent être isolés directement à partir du sang périphérique par sélection avec des microbilles conjuguées à Ab spécifique à la lignée ou par tri cellulaire par cytométrie de flux. De plus, les cellules B naïves et mémoire purifiés peuvent être activées et différenciées en ASCs en culture. Les activités fonctionnelles des ASC pour contribuer à la sécrétion Ab peuvent être quantifiés par ELISpot, qui est un essai enzyme qui convergetest de immunoabsorbance lié en (ELISA) et les technologies de transfert de Western pour permettre l'énumération des ASCs individuelles au niveau d'une seule cellule. En pratique, le test ELISpot a été de plus en plus utilisé pour évaluer l'efficacité du vaccin à cause de la facilité de manipulation d'un grand nombre d'échantillons de sang. Les procédés d'isolement des cellules B humaines à partir de sang périphérique, de la différenciation des cellules B en ASCs in vitro, ainsi que l'emploi d' un test ELISPOT pour la quantification du nombre total IgM et IgG ASCs seront décrites ici.

Introduction

les cellules B jouent un rôle central dans le développement de l'immunité humorale. Ils se développent d'abord dans la moelle osseuse et entrent dans la circulation sanguine sous forme de cellules B naïves, qui peuvent migrer dans les tissus lymphoïdes, tels que la rate, les ganglions lymphatiques et amygdales, pour un développement ultérieur. Après Ag rencontre, certaines cellules B naïves migrent dans les follicules lymphoïdes, où les cellules du centre germinatif B peuvent se différencier en cellules de mémoire B et plasmoblastes (PBS) / cellules plasmatiques (PC). Alors que la plupart du PBS / PC de sortie dans le flux de sang, quelques éventuellement résident dans la moelle osseuse à subir une différenciation terminale dans les PC à long terme ^1. Les cellules B en circulation sont hétérogènes, et à l' état d' équilibre, PB / PC sont rares dans le sang périphérique ^2. En raison de la disponibilité de marqueurs de surface spécifiques à la lignée, la cytométrie de flux est devenue une méthode populaire pour l'identification et la caractérisation des sous-ensembles de cellules B dans le sang périphérique. Une application prolongée de cytometr de fluxy est l'addition d'une fonction de tri de cellules, ce qui permet la séparation et l'isolement des sous-ensembles individuels de cellules B avec une pureté élevée. Sur la base de l'expression de récepteurs de surface spécifiques à différents stades de développement, des cellules B humaines en circulation sont généralement classés en trois sous - populations principales: les cellules B naïves (CD19 ⁺ CD27 ^- CD38 ^-), de cellules B à mémoire (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), et PB / PC (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figure 1). Les cellules B naïves, par nature, ne sont pas rencontrées Ags. Cependant, ils peuvent être différenciées en cellules IgM ⁺ CD27 ⁺ B mémoire. Bien que les cellules B naïves sont homogènes en exprimant le récepteur de l' antigène des lymphocytes B (BCR) -Associated molécules (par exemple, CD19, CD20 et CD22) , ils sont hétérogènes dans leur répertoire d' immunoglobulines ^5. La majorité des cellules CD27 ⁺ B mémoires peuvent être différenciées en CD27+ / CD38 ⁺ salut PB / PC ^6. En outre, les cellules B mémoires et PB / PC sont polyclonaux et présentent une hétérogénéité de développement et fonctionnelle ^4-7. PB / PC en circulation sont normalement de courte durée et n'expriment CD138, mais celles faites à installer dans la moelle osseuse sera terminale différencier et de devenir à long terme. Terminally PC différenciées expriment CD138 et régulent les molécules de CD27 sur leurs surfaces ^8. Étant donné que PB et PC sont capables de sécréter Abs, dans de nombreuses occasions, ils sont collectivement désignées comme ASCs. En revanche, ni les cellules B naïves ni les cellules B mémoires peuvent produire des quantités appréciables de Abs ^9-10. Néanmoins, lorsqu'il est isolé, les deux cellules B naïves et mémoires peuvent être différenciées en ASCs en 3 - 10 jours lorsqu'il est placé dans les conditions de culture appropriées ^{6, 11-15.} En fait, ASCs dérivés d'actions in vitro de différenciation expressions de surface similaires de CD27 et CD38 avec ceux fr directement isoléle sang périphérique om ^6. En outre, les ASCs différenciées in vitro expriment un faible niveau de CD20 de surface, comme celle de circulation PB / PC ^6. Bien que les ASCs de culture dérivés sont de courte durée, ils peuvent sécrètent Abs, ce qui indique qu'ils sont fonctionnellement compétents et capables de contribuer à l'immunité humorale.

Les deux ELISA et ELISpot sont de loin les méthodes les plus couramment appliquées avec qui pour obtenir des informations fonctionnelles sur la réponse immunitaire humorale. ELISA est un test basé sur une plaque de 96 puits, et il est souvent utilisé pour mesurer les titres de sérum Abs Ag-spécifique et d' autres analytes (par exemple, des cytokines). Il est commode et évolutive. ELISA est conçu pour utiliser un dosage enzymatique en phase solide pour détecter la présence d'Ac ou d' autres substances, telles que le sérum, dans un échantillon liquide ^16. Les lectures de tests ELISA sériques ont été largement utilisés pour représenter la réponse immunitaire du corps. Un outil nécessaire pour l'acquisition de readouts de dosages ELISA est un lecteur de microplaques spectrophotométrique. Le lecteur peut déterminer la densité optique (DO) des produits finaux résultant généralement de la réaction de la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à Abs de détection et de leurs substrats spécifiques ^17. En ce qui concerne le rapport de la réponse immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA indiquent le collectif, mais pas individuelle, le rendement de l'ASC dans le corps. En outre, ELISA ne tient pas compte de la participation par les cellules B de mémoire, qui ne sécrètent pas Abs.

Comme ELISA, ELISpot est une méthode largement utilisée pour détecter et surveiller la réponse immunitaire dans des échantillons de sang périphérique ^17-18. ELISpot est une technique liée à un ELISA en sandwich. Dans ce document, les cellules sont placées dans le difluorure de polyvinylidène (PVDF) puits de membranes-backed de microplaques de 96 puits pour une culture à court terme. Le test ELISPOT est analogue à effectuer un transfert de Western sur une microplaque et developing, les taches sur la membrane de PVDF dans chaque puits. Un système de lecteur ELISpot automatisé ou un stéréomicroscope pour le comptage manuel est nécessaire. Le principal avantage d'un test ELISPOT pour la détection d'une réponse immunitaire est sa sensibilité exceptionnelle à la quantification des ASC et des cellules sécrétant des cytokines. Il rend compte de leurs activités fonctionnelles dans l'immunité humorale et cellulaire, respectivement. Dans la mesure de la fonction immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA et le nombre de ASCs énumérés par ELISpot sont souvent corrélées, mais les lectures de données de ces deux essais ont des différences dans les implications fonctionnelles ^19-20. Le principal avantage de ELISpot est sa sensibilité de la méthode. Le niveau de titres Ab sériques tel que rapporté par ELISA est présenté comme semi-quantitative des lectures de DO, indiquant le niveau Ab relative, ou plus quantitative, comme les lectures de concentration lorsqu'une quantité connue des isotypes appropriés de Abs est inclus pour référence. En revanche, les résultats d'un test ELISPOT sont presented comme le nombre absolu de ASCs dans un pool de cellules d'intérêt (par exemple, des cellules non fractionnées périphériques mononucléaires du sang (PBMC) et des cellules B purifiées à partir de PBMC). ELISpot peut détecter une seule ASC, mais nécessite des quantités ELISA Ab à partir ASCs pour atteindre des concentrations d'essai dépendant optimisées avant la mesure. Par conséquent, ELISpot est évidemment supérieure à ELISA de la sensibilité de la quantification. En outre, ELISpot est également adapté pour quantifier les ASCs différenciées in vitro à partir de cellules B à mémoire activés. les cellules mémoire B ne sécrètent pas Abs, mais peuvent se différencier en ASCs lors de l'activation; ils ont donc aucune contribution à Abs sériques détectés par ELISA. Ainsi, ELISpot est la méthode de choix pour la mesure de la réponse immunitaire des cellules circulantes B mémoires après son activation en culture. Elle permet la surveillance de l'entretien d'une immunité humorale à long terme.

Protocole

le sang périphérique humain doit être obtenu à partir de donneurs sains en vertu du consentement éclairé, et l'utilisation d'échantillons de sang doivent être conformes aux lignes directrices approuvées établies par différents conseils d'examen institutionnels. Dans cette étude, le protocole à utiliser le sang humain dans une démonstration des résultats de cytométrie de flux (Figure 1) et des tests ELISpot (figure 3) a été approuvé par la Commission de révision interne de National Taiwan University Hospital (numéro de protocole 201307019RINB).

1. Isolement et purification des cellules de sang périphérique humain B

1. Dessiner ~ 10 ml de sang de la veine médiane cubitale (dans le creux antérieur cubital du coude) dans un tube de 15 ml contenant du _K2EDTA (1,5 à 2,0 mg / mL de sang) et inverser immédiatement le tube plusieurs fois pour empêcher un caillot formation.
2. Ajouter 35 ml d'autoclave (121 ° C, 15 min) de globules rouges (RBC) de tampon de lyse (150 mM de _NH4CI, 10 mM de KHCO ₃ et 1 mM d' EDTA, pH 7,4) dans le tube contenant l'échantillon de sang frais (≥ 3: 1 volume / volume) et incuber à température ambiante (TA) pendant une durée de 5 min.
   NOTE: L'apparition de transmission de la lumière à travers le tube indique l'achèvement de RBC lyse.
3. Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Assurez-vous que la pastille est de couleur blanche.
4. Remettre en suspension le culot avec 10 ml de sérum physiologique autoclavée tamponnée au phosphate (PBS, NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na ₂ HPO ₄ et 1,47 mM de KH ₂ PO _4; pH 7,4) et centrifugation comme dans l' étape 1.3.
5. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille avec 10 ml de milieu RPMI 1640 (supplément: 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline / streptomycine, 0,25 pg / ml d'amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine), puis plaquer la cellules dans une boîte de culture de 10 cm (10 ml de sang par plat). Placer le récipient dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO ₂ pendant 30 minutes.
6. Remuer doucement la boîte de culture à quelques reprises et placer lemilieu de culture (cellules en suspension) dans des tubes coniques en matière plastique de 15 ml. Jeter les cellules adhérentes (principalement des macrophages) sur les boîtes de culture.
7. Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant.
8. Remettre en suspension le culot avec 1 ml de milieu RPMI 1640. Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé.
   REMARQUE: La viabilité des leucocytes isolés est normalement supérieure à 90% par exclusion au bleu trypan.
9. Centrifugeuse à l' étape 1.7 , et de remettre en suspension les cellules dans ~ 200 pi de tampon PBS froid (0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM d' EDTA) à la concentration de 5 - 10 x 10 ⁶ cellules / ml.
10. Ajouter 5 ul de cocktail biotinylée anti-humaine Ab spécifique aux cellules sanguines (pour la sélection négative des cellules B) pour 10 ⁶ cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes ^21.
    NOTE: Le cocktail Ab anti-humain doit comprendre au moins Abs spécifique à CD2 (ou CD3), CD14 et CD16.
11. Ajouter un volume en excès de 10 foisde PBS stérile aux cellules, centrifuger à 600 g pendant 5 min, et jeter le surnageant.
12. Ajouter des quantités égales de microbilles de streptavidine conjugué (5 pi par 10 ⁶ cellules) à la pastille et mélanger soigneusement.
13. Incuber sur de la glace pendant 30 min dans un tube conique de 15 ml en matière plastique.
14. Ajouter 2 mL de tampon PBS dans le tube.
15. Placer le tube dans un support magnétique et incuber à température ambiante pendant 8 min. Les microbilles brunes progressivement fixer à la paroi du tube à côté de l'aimant ^22.
16. Avec le tube restant dans le support magnétique, transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube stérile de 15 ml ^22.
17. Répétez les étapes de 1,14 à 1,16, et de combiner les deux surnageants qui contiennent les cellules intactes B. Jeter les microbilles.
18. Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant.
19. Reprendre le culot dans du milieu RPMI 1640 pour des expériences en aval.
    NOTE: En règle générale, 1 - 5 x 10 ⁵ cellules B witha pureté supérieure à 95% par rapport à 10 ml de sang périphérique ²³ peut être isolé.

2. Purification et séparation de la mémoire et de Naïf B Les cellules provenant des cellules isolées B

1. Utiliser des cellules purifiées à partir de l'étape 1 et de déterminer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique.
2. Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de tampon PBS froid après centrifugation à 600 x g et à température ambiante pendant 5 min.
3. Ajouter 1 - 2 pg de mAb biotinylé de CD27 par 10 ⁶ cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes.
4. Ajouter 10 ml de tampon PBS au tube et centrifuger à 600 g pendant 5 min.
5. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 ul de tampon PBS.
6. Ajouter des quantités égales de microbilles magnétiques de streptavidine (1 - 2 ng / 10 ⁶ cellules) à des cellules dans un tube conique de 15 ml en matière plastique.
7. Bien mélanger délicatement et incuber sur de la glace pendant 30 min.
8. Ajouter 2 - 3 ml de tampon PBS au tube.
9. Placer letube dans un support magnétique et incuber à température ambiante pendant 8 min pour permettre aux microbilles brunes pour fixer sur le côté le plus proche de l'aimant.
10. Avec le tube dans le support magnétique, transférer soigneusement la fraction de surnageant dans un nouveau tube stérile. Cette fraction contient le CD27 enrichi ^- cellules B naïves.
11. Ajouter 5 mL dans le tube contenant les microbilles et resuspendre doucement les microbilles (ie, la fraction enrichie de cellules CD27 ⁺ B mémoire) ^24-25.
12. Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Resuspendre les pellets avec RPMI 1640 pour les expériences en aval.
    NOTE: En règle générale, ~ 30 - 60% des cellules B peut être purifié en tant que cellules de mémoire CD27 ⁺ à partir des PBMC d'un donneur sain ^{7, 25-26.}

3. tri cellulaire pour la collecte de cellules Naïf B, cellules mémoire B et PB / PC

1. En utilisant les cellules purifiées à partir de l'étape 1, de déterminer le nombre de cellules en utilisant un hemocytometer ou un compteur de cellules automatique.
2. Remettre en suspension les cellules dans du tampon PBS froid à la concentration de 10 ⁷ par ml dans un tube en polystyrène de 5 ml.
3. Ajouter 1 - 2 pg d'IgG humaine par 10 ⁶ cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes pour le bloc Fc.
4. Ajouter 1 pg de chacun des anticorps anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323) et anti-CD38-PE (clone: HIT2) pour 10 ⁶ cellules; bien mélanger et incuber sur de la glace pendant 30 min ^{4, 27.}
5. Dans les 5 dernières minutes à l'étape 3.4, ajouter 5 pi du commerce 7-aminoactinomycine D (7-AAD).
6. Ajouter 2 mL de PBS dans le tube, vortex et centrifuger à 600 xg pendant 5 min.
7. Remettre en suspension les cellules dans un tampon de tri (PBS stérile avec 2% de BSA et 2 mM d' EDTA) à une concentration de 1 - 5 x 10 ⁷ cellules par mL dans un tube de 15 ml.
8. Filtrer les cellules à travers un tamis de maille de nylon (40 um de taille des pores) pour éliminer les amas de cellules.
9. Séparer les cellules avec une sorte cytométriqueer équipé de trois lasers: violet (405 nm), bleu (488 nm) et rouge (640 nm).
   NOTE: Seul le laser bleu est suffisant pour 3 couleurs cytométrie en flux ^27-28.
10. Trier les cellules en trois tubes de 15 ml (contenant 5 ml de milieu RPMI) pour la collecte simultanée des cellules B naïves (CD19 ⁺ CD27 ^-), les cellules mémoire B (CD19 ⁺ CD27 ⁺⁾ et PB / PC (CD19 ⁺ CD27 ^{+ /} CD38 ^{+ salut) 3-4, 28.}
    NOTE: les cellules B naïves et mémoire de classement peuvent être cultivées comme décrit à l'étape 4.

4. In Vitro Différenciation des cellules isolées CD19 Human ⁺ B, CD19 ⁺ CD27 ⁺ cellules mémoire B et CD19 ⁺ CD27 ^- Naïf B Cellules

1. En utilisant les cellules purifiées dans les étapes 1.19, 2.10, 2.11 et 3.10, déterminer le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique.
2. Resuspendre les cellules avec du milieu RPMI 1640à une concentration de 1 - 10 x 10 ⁵ par ml et aliquote les dans les puits d'une plaque de 12 puits.
3. Ajouter CpG (ODN 2006) à 5 ug / 10 ⁶ cellules / mL ^{18, 29.}
4. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO ₂ pendant 5 jours.
5. Récolter les cellules de chaque puits, placez-les séparément dans des tubes de 15 ml, ajouter 5 ml de PBS à chaque tube et centrifuger les à 600 xg et RT pendant 5 min.
6. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 - 10 x 10 ⁵ par ml avec du milieu RPMI 1640.

5. ELISpot Assay

1. Ajouter 30 ul de 35% d'éthanol dans de l'eau distillée à chaque puits des plaques ELISpot à 30 s.
   NOTE: Lorsque pipetage, évitez de toucher la membrane dans les puits en tout temps.
2. Inversez les plaques ELISpot pour éliminer l'éthanol.
3. Mettez 150 pi de ddH autoclavé ₂ O dans chaque puits et incuberelles à température ambiante pendant 5 min pour rincer de l'éthanol résiduel; suivre avec un lavage de PBS stérile à température ambiante pendant 3 min.
   REMARQUE: Les étapes 05.01 à 05.03 peut être en option, en fonction de la fabrication des plaques.
4. Mettre 50 pl de 5 pg / ml polyclonale F (ab ') ₂ fragment d'anticorps anti-Ig humaine (IgG + IgM + IgA) (dans du PBS) dans chaque puits des plaques ELISpot et de les incuber à 4 ° C pendant la nuit ( de préférence) ou 37 ° C pendant 2 h ^11.
   NOTE: Sceller les bords des plaques avec du Parafilm jusqu'à utilisation.
5. Inversez les plaques pour éliminer Abs non liée, ajouter 200 ul de PBS à chaque puits et incuber deux fois à température ambiante pendant 3 min à chaque fois.
6. Ajouter 200 ul de PBS avec 5% de BSA (ou le milieu RPMI 1640) à chaque puits pour bloquer, et incuber à température ambiante pendant 2 h.
7. Inversez les plaques pour enlever le tampon de blocage. Laver chaque puits deux fois avec 200 ul de PBS, comme dans l'étape 5.5.
8. Ajouter 100 ul de milieu RPMI 1640 à chaque puits et incuber à 37 ° C.
9. Lorsque vous êtes prêt à ensemencer les cellules, inverser les plaques pour éliminer le milieu RPMI 1640.
10. Semences de 100 pi (5 x 10 ^4), 50 ul (2,5 x 10 ^4), et 25 ul (1,25 x 10 ⁴⁾ des cellules ( à partir des étapes 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 et 4.6) dans les puits d'une plaque ELISpot. Avec RPMI 1640, porter le volume à 150 pl / puits.
    NOTE: Un minimum d'un ou deux 2 fois des dilutions en série pour l'étalement des cellules est recommandé.
11. Incuber les plaques dans un incubateur à 37 ° avec 5% de _CO2 pendant 8-14 h ^18. Évitez de déplacer les plaques pendant l'incubation.
12. Inverser les plaques pour éliminer les cellules et le milieu RPMI 1640.
13. Ajouter 200 pl / puits de PBS-T (PBS avec 0,05% de Tween 20) et incuber à température ambiante 5 fois, chaque fois pendant 3 min. Inversez la plaque pour enlever le tampon de lavage entre chacune des 5 lavages.
14. Ajouter la phosphatase alcaline IgG de chèvre anti-humaine (AP), Abs Fcy spécifique (pour la détection des IgG, 1: 5000 dans du PBS-T) Ou de chèvre anti-humain IgM-AP, Fcμ Ab spécifique à un fragment (pour la détection des IgM, 1: 5000 dans du PBS-T) dans les puits désignés et incuber à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité.
15. Laver chaque puits deux fois avec 200 ul de PBS, comme dans l'étape 5.5.
16. Ajouter 50 ul / puits de tétrazolium (BCIP / NBT) solution de substrat de phosphate nitro bromochloroindolyl. taches de couleur pourpre apparaissent normalement en 5-15 min.
17. Ajouter 100 pl / puits de ddH ₂ O pour empêcher le développement excessif de taches.
18. Rincer les plaques avec l'eau du robinet après le développement complet de toutes les taches.
19. Retirez le dalot des plaques et leur permettre de sécher à l'air dans l'obscurité.
20. Compter les taches en utilisant un lecteur de plaque automatique avec une unité acquisition d' image / d'analyse (par exemple, un scanner automatique ou manuellement via un microscope à dissection).
    NOTE: Les plaques peuvent être stockées à température ambiante dans l'obscurité et analysées plus tard.

Résultats

PBMC ont été appauvries en globules rouges et des cellules adhérentes (étapes 01.02 à 01.07). Une aliquote (2 x 10 ⁶⁾ des cellules ont été soumises à une analyse par cytométrie de flux pour illustrer les populations de cellules B naïves, les cellules B à mémoire, et le PBS / PC dans le sang périphérique (figure 1). Dans les CMSP de ce donneur, environ 10% des lymphocytes sont des cellules B CD19 ^+. Dans le compartiment des cellules B, ...

Discussion

L'isolement et la purification des cellules B du sang périphérique humain

Normalement, les globules rouges peuvent être efficacement éliminées par rompues et le tampon de lyse (étape 1.2). Il est important de ne pas laisser incuber les PBMC avec le tampon de lyse des globules rouges supérieure à 5 min, comme la viabilité des cellules peut être affectée par le chlorure d'ammonium. En variante, les globules rouges et les plaquettes peuvent être éliminés simultanément par le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 ml tube
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set	BD Biosciences	558007
Biotinylated CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Streptavidin magnetic microbeads	BD Biosciences	9000810
15 ml Falcon tubes	BD Falcon	352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-human CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-human CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-human CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-human CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-human CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-human CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinylated anti-human CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinylated anti-human CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	type B CpG
Recombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Recombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Recombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size	Merck Millipore	MSIPS4510	sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-095
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer	C.T.L.