L'isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

Riepilogo

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Abstract

Il segno distintivo dell'immunità umorale è generare ASC funzionali, che sintetizzano e secernono Abs specifici per un antigene (Ag), come un agente patogeno, e sono utilizzati per difesa dell'ospite. Per la determinazione quantitativa dello stato funzionale della risposta immunitaria umorale di un individuo, sia Abs siero e ASC circolanti sono comunemente misurati come letture funzionali. Negli esseri umani, sangue periferico è il campione più conveniente e facilmente accessibile che può essere utilizzato per la determinazione della risposta immunitaria umorale indotta da cellule ospiti B. sottoinsiemi delle cellule B distinte, tra cui ASC, possono essere isolate direttamente dal sangue periferico mediante selezione con microsfere Ab-coniugati specifici lineage o tramite cella di smistamento con citometria a flusso. Inoltre, purificato le cellule B naive e memoria possono essere attivati ​​e differenziate in ASC nella cultura. Le attività funzionali di ASC per contribuire alla Ab secrezione può essere quantificata ELISpot, che è un metodo che converge enzimasaggio linked immunoabsorbance (ELISA) e le tecnologie di Western blotting per consentire l'enumerazione dei singoli ASC a livello di singola cellula. In pratica, il saggio ELISPOT è stato usato sempre per valutare l'efficacia del vaccino a causa della facilità di trattamento di un gran numero di campioni di sangue. I metodi di isolare cellule B umane da sangue periferico, la differenziazione delle cellule B in ASC in vitro, e l'impiego di ELISpot per la quantificazione del totale IgM e IgG-ASC verranno descritte qui.

Introduzione

cellule B svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di immunità umorale. Inizialmente si sviluppano nel midollo osseo ed entrano nel flusso sanguigno come cellule naive B, che possono migrare nei tessuti linfoidi, come la milza, i linfonodi, tonsille e, per un ulteriore sviluppo. Su Ag incontro, alcune cellule B naïve migrano in follicoli linfoidi, dove il centro germinale cellule B possono differenziarsi in cellule di memoria B e plasmablasts (PBS) / plasmacellule (PC). Mentre la maggior parte dei PC PBS / uscita nel flusso sanguigno, alcuni infine risiedono nel midollo osseo di sottoporsi a differenziazione terminale nei PC di lunga durata ^1. Cellule B in circolazione sono eterogenei, e allo stato stazionario, PBS / PC sono rari nel sangue periferico ^2. Come risultato della disponibilità di marcatori di superficie specifici lineage, citometria a flusso è diventato un metodo popolare per l'identificazione e la caratterizzazione dei sottoinsiemi B-cellule nel sangue periferico. Un'applicazione estesa di cytometr flussoy è l'aggiunta di una funzione cell sorter, che permette la separazione e l'isolamento di singoli sottogruppi di cellule B con elevata purezza. Sulla base della espressione dei recettori di superficie specifici a diversi stadi di sviluppo, che circolano cellule B umane sono generalmente classificati in tre sottopopolazioni principali: le cellule B naive (CD19 ⁺ CD27 ^- CD38 ^-), le cellule B di memoria (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), e PBS / PC (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figura 1). le cellule B naïve per natura non hanno incontrato Ags. Tuttavia, possono essere differenziate in cellule IgM ⁺ CD27 ⁺ B di memoria. Anche se le cellule B naïve sono omogenei nell'esprimere recettore per l'antigene delle cellule B (BCR) molecole -associated (ad esempio, CD19, CD20 e CD22) siano eterogenei nella loro immunoglobuline repertorio ^5. La maggior parte delle cellule CD27 ⁺ B di memoria può essere differenziato in CD27+ / hi CD38 ⁺ PBS / PC ^6. Inoltre, le cellule B di memoria e PBS / PC sono policlonali ed esibiscono evolutiva e funzionale l'eterogeneità ^4-7. PBS / PC in circolazione sono normalmente di breve durata e non esprimono CD138, ma quelli fatti di stabilirsi nel midollo osseo saranno terminali differenziare e diventare di lunga durata. Terminalmente differenziate PC esprimono CD138 e giù-regolano le molecole CD27 sulla loro superficie ^8. Dal momento che sia PB e PC sono in grado di secernere Abs, in molte occasioni sono collettivamente indicati come ASC. Al contrario, né le cellule B naïve né cellule B di memoria in grado di produrre quantità apprezzabili di Abs ^9-10. Tuttavia, quando isolato, entrambe le cellule B naive e memoria possono essere differenziati in ASC in 3 - 10 giorni, quando sono immessi nelle condizioni di coltura appropriate ^{6, 11-15.} Infatti, ASC derivati da in vitro la differenziazione delle azioni simili espressioni superficiali di CD27 e CD38 con i diretti isolato frsangue periferico om ^6. Inoltre, le ASC differenziate in vitro esprimono un basso livello di CD20 superficie, simile quella di PBS / PC ⁶ in circolazione. Anche se le ASC cultura di derivazione sono tutti di breve durata, possono secernono Abs, che indica che essi sono funzionalmente competenti e in grado di contribuire alla immunità umorale.

Sia ELISA e ELISpot sono di gran lunga i metodi più comunemente applicato con cui ottenere informazioni funzionali sulla risposta immunitaria umorale. ELISA è un test piastra base 96 pozzetti, ed è utilizzato frequentemente per misurare i titoli di siero Abs Ag-specifica ed altri analiti (ad esempio, citochine). E 'conveniente e scalabile. ELISA è progettato per utilizzare un saggio enzimatico in fase solida per rilevare la presenza di Abs o altre sostanze, quali siero, in un campione liquido ^16. Le letture da ELISA siero sono stati ampiamente utilizzati per rappresentare la risposta immunitaria del corpo. Uno strumento necessario per l'acquisizione di riadouts da ELISA test è un lettore spettrofotometrico. Il lettore può determinare la densità ottica (OD) dei prodotti finali tipicamente risultanti dalla reazione di perossidasi di rafano (HRP) coniugata Abs rilevamento e loro substrati specifici ^17. Per quanto riguarda la segnalazione della risposta immunitaria umorale, livelli sierici Ab determinati mediante ELISA denotano collettivo, ma non individuale, prestazioni di ASC nel corpo. Inoltre, ELISA non tiene conto della partecipazione dalle cellule B di memoria, che non secernono Abs.

Come ELISA, ELISpot è un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione e il monitoraggio della risposta immunitaria nei campioni di sangue periferico ^17-18. ELISpot è una tecnica relativa a un sandwich ELISA. In esso, le cellule vengono inseriti nella difluoruro di polivinilidene (PVDF) pozzi membrana-backed di 96 pozzetti per una cultura a breve termine. Il saggio ELISPOT è analogo all'esecuzione di western blotting su una micropiastra e developing le macchie sulla membrana PVDF in ogni pozzetto. è richiesto un sistema di lettore ELISpot automatico o uno stereomicroscopio per il conteggio manuale. Il vantaggio principale di ELISpot nel rilevare una risposta immunitaria è la sua eccezionale sensibilità nella quantificazione di ASC e cellule secernenti citochine. Riporta le loro attività funzionali in immunità umorale e cellulare, rispettivamente. Nella misurazione della funzione immunitaria umorale, livelli sierici Ab determinati mediante ELISA e il numero di ASC enumerate da ELISpot sono spesso correlati, ma le letture dati da questi due saggi hanno alcune differenze nelle implicazioni funzionali ^19-20. Il vantaggio principale di ELISpot è la sua sensibilità del metodo. Il livello di siero titoli Ab come riportato da ELISA è presentato semi-quantitativamente come letture OD, che indica il livello Ab relativa, o più quantitativamente, come letture di concentrazione quando una quantità nota dei propri isotipi di Abs è incluso per riferimento. Al contrario, i risultati di ELISpot sono Presented come il numero assoluto di ASC in un pool di cellule di interesse (ad esempio, le cellule mononucleate del sangue periferico non frazionate (PBMC) e le cellule B purificate da PBMC). ELISpot può rilevare una singola ASC, ma ELISA richiede quantità Ab da ASC raggiungere concentrazioni dosaggio-dipendente ottimizzate prima della misura. Quindi, ELISpot è ovviamente superiore a ELISA nella sensibilità di quantificazione. Inoltre, ELISpot è adatto anche per quantificare le ASC differenziate in vitro da cellule B di memoria attivate. le cellule B di memoria non secernono Abs ma possono differenziarsi in ASC al momento di attivazione; non hanno quindi alcun contributo di Abs siero rilevati da ELISA. Così, ELISpot è il metodo di scelta nella misurazione della risposta immunitaria delle cellule B della memoria circolanti dopo l'attivazione in coltura. Esso consente il monitoraggio del mantenimento dell'immunità umorale a lungo termine.

Protocollo

sangue periferico umano deve essere ottenuto da donatori sani sotto il consenso informato, e l'uso di campioni di sangue deve essere conforme alle linee guida approvate stabiliti dalle singole schede di revisione istituzionale. In questo studio, il protocollo da utilizzare sangue umano in una dimostrazione dei risultati di citometria a flusso (Figura 1) e saggi ELISPOT (Figura 3) è stato approvato dal Consiglio riesame interno della National Taiwan University Hospital (numero di protocollo 201307019RINB).

1. isolamento e la purificazione delle cellule del sangue umano periferico B

1. Draw ~ 10 ml di sangue dalla vena mediana cubitale (nella fossa anterior cubitale al gomito) in una provetta da 15 ml contenente K ₂ EDTA (da 1,5 a 2,0 mg / ml di sangue) e immediatamente invertire la provetta diverse volte per impedire coagulo formazione.
2. Aggiungere 35 ml di autoclave (121 ° C, 15 min) di globuli rossi (RBC) tampone di lisi (150 mm NH ₄ Cl, 10 mM KHCO _3, e 1 mM EDTA; pH 7.4) per il tubo contenente il campione di sangue fresco (≥ 3: 1 vol / vol) e incubare a temperatura ambiente (RT) per non più di 5 min.
   NOTA: L'aspetto della trasmissione della luce attraverso il tubo indica il completamento di RBC lisi.
3. Centrifugare a 600 xg a temperatura ambiente per 5 min. Assicurarsi che il pellet è di colore bianco.
4. Risospendere il pellet con 10 ml di autoclavato PBS (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na ₂ HPO _4, e 1,47 mM KH ₂ PO _4, pH 7.4) e centrifugare come al punto 1.3.
5. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet con 10 ml di terreno RPMI 1640 (integratori: 10% di siero fetale di vitello, 100 U / mL di penicillina / streptomicina, 0,25 mg / ml di amfotericina B, e 2 mM L-glutammina), e poi piastra del le cellule in una capsula di Petri di 10 cm (10 ml di sangue per ogni piatto). Posizionare il piatto in un incubatore a 37 ° con 5% di CO ₂ per 30 min.
6. Agitare delicatamente il piatto cultura un paio di volte e posizionare ilterreno di coltura (cellule in sospensione) in tubi conici di plastica da 15 ml. Eliminare le cellule aderenti (per lo più macrofagi) sulle piastre di coltura.
7. Centrifugare a 600 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il surnatante.
8. Risospendere il pellet con 1 ml di RPMI 1640 medium. Contare il numero di cellule con un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
   NOTA: La vitalità dei leucociti isolati è normalmente superiore al 90% per esclusione trypan blu.
9. Centrifugare come al punto 1.7 e risospendere le cellule in ~ 200 ml di tampone PBS freddo (0,5% di siero albumina bovina (BSA) e 2 mM EDTA) alla concentrazione di 5 - 10 x 10 ⁶ cellule / ml.
10. Aggiungere 5 ml di biotinilato Ab cocktail anti-umano specifico per le cellule del sangue (per la selezione negativa di cellule B) per 10 ⁶ cellule e incubare su ghiaccio per 30 min ^21.
    NOTA: L'Ab cocktail anti-umano dovrebbe includere almeno Abs specifico per CD2 (o CD3), CD14, CD16 e.
11. Aggiungere un volume in eccesso di 10 voltedi PBS sterile per le cellule, centrifugare a 600 xg per 5 min, e scartare il surnatante.
12. Aggiungere la stessa quantità di microperle streptavidina coniugato (5 ml per 10 ⁶ cellule) al pellet e mescolare accuratamente.
13. Incubare in ghiaccio per 30 min in una provetta conica da 15 ml in plastica.
14. Aggiungere 2 ml di tampone PBS nella provetta.
15. Posizionare il tubo in un supporto magnetico e incubare a temperatura ambiente per 8 min. Le microsfere marrone gradualmente allegare alla parete del tubo accanto al magnete ^22.
16. Con il tubo rimanente nel supporto magnetico, trasferire accuratamente il surnatante in una nuova provetta sterile da 15 mL ^22.
17. Ripetere i passaggi 1,14-1,16, e combinare le due surnatanti che contengono le cellule B incontaminati. Eliminare le microsfere.
18. Centrifugare a 600 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il surnatante.
19. Risospendere il pellet in terreno RPMI 1640 per esperimenti a valle.
    NOTA: in genere, 1 - 5 x 10 ⁵ B cellule ingegnoah purezza superiore al 95% da 10 mL di sangue periferico può essere isolata ^23.

2. Le cellule purificazione e separazione della Memoria e della Naïve B da cellule B isolate

1. Utilizzare le cellule purificate dal punto 1 e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatica.
2. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone PBS freddo dopo centrifugazione a 600 xg ed RT per 5 min.
3. Aggiungere 1 - 2 mg di biotinilato mAb CD27 per 10 ⁶ cellule e incubare su ghiaccio per 30 min.
4. Aggiungere 10 ml di tampone PBS nella provetta e centrifugare a 600 xg per 5 min.
5. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 50 ml di tampone PBS.
6. Aggiungere la stessa quantità di microsfere magnetiche streptavidina (1 - 2 mg / 10 ⁶ celle) alle cellule in una provetta di plastica conico da 15 ml.
7. Delicatamente mescolare bene e incubare in ghiaccio per 30 min.
8. Aggiungere 2 - 3 mL di tampone PBS al tubo.
9. Posiziona iltubo in un supporto magnetico e incubare a temperatura ambiente per 8 minuti per consentire le microsfere marrone da allegare al lato più vicino al magnete.
10. Con il tubo nel supporto magnetico, trasferire accuratamente il surnatante in una nuova provetta sterile. Questa frazione contiene il CD27 arricchito ^- le cellule B naïve.
11. Aggiungere 5 mL alla provetta contenente le microsfere e risospendere delicatamente le microsfere (cioè, la frazione arricchita di cellule CD27 ⁺ B memoria) ^24-25.
12. Centrifugare a 600 xg a temperatura ambiente per 5 min. Risospendere il pellet con RPMI 1640 medium per gli esperimenti a valle.
    NOTA: Tipicamente, ~ 30 - 60% della cellule B può essere purificato come celle di memoria CD27 ⁺ dalle PBMC di un donatore sano ^{7, 25-26.}

3. separazione delle cellule per la raccolta di cellule naive B, cellule B di memoria, e PBS / PC

1. Utilizzando le cellule purificate dal punto 1, determinare il numero di cellule utilizzando un hemocytometer o un contatore di cellule automatica.
2. Risospendere le cellule in tampone PBS freddo alla concentrazione di 10 ⁷ per ml in provette di polistirene da 5 mL.
3. Aggiungere 1 - 2 mg di IgG umana per 10 ⁶ cellule e incubare su ghiaccio per 10 min per il blocco Fc.
4. Aggiungere 1 mg ciascuno di anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323), e anti-CD38-PE (clone: HIT2) per 10 ⁶ cellule; mescolare bene e incubare in ghiaccio per 30 min ^{4, 27.}
5. Negli ultimi 5 minuti al punto 3.4, aggiungere 5 ml di 7-aminoactinomycin commerciale D (7-AAD).
6. Aggiungere 2 ml di PBS al tubo, vortex e centrifugare a 600 xg per 5 min.
7. Risospendere le cellule in classificare tampone (PBS sterile con 2% BSA e 2 mM EDTA) ad una concentrazione di 1 - 5 x 10 ⁷ cellule per ml in un tubo da 15 ml.
8. Filtrare le cellule attraverso un colino cella di rete di nylon (40 micron dimensione dei pori) per eliminare grumi di cellule.
9. Separare le cellule con un flusso citometria sortaER dotato di tre laser: viola (405 nm), blu (488 nm), e rosso (640 nm).
   NOTA: il solo laser blu è sufficiente per 3 colori citometria a flusso ^27-28.
10. Ordina le cellule in tre tubi da 15 ml (contenenti 5 ml di terreno RPMI) per la raccolta simultanea di cellule B naive (CD19 ⁺ CD27 ^-), celle di memoria B (CD19 ⁺ CD27 ^+), e PBS / PC (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / hi} CD38 ^{+) 3-4, 28.}
    NOTA: Ordinati cellule B naive e della memoria possono essere coltivate come descritto al punto 4.

4. La differenziazione in vitro di cellule CD19 isolati umana ⁺ B, CD19 ⁺ CD27 ⁺ cellule B di memoria, e CD19 ⁺ CD27 ^- cellule naive B

1. Utilizzando le cellule purificate nei passaggi 1.19, 2.10, 2.11 e 3.10, determinare il numero di cellule con un emocitometro o un contatore di cellule automatica.
2. Risospendere le cellule con RPMI 1640 mediumad una concentrazione di 1 - 10 x 10 ⁵ per mL e Aliquotare nei pozzetti di una piastra 12 pozzetti.
3. Aggiungere CpG (ODN 2006) a 5 mg / 10 ⁶ cellule / ml ^{18, 29.}
4. Cultura le cellule in un incubatore a 37 ° con 5% di CO ₂ per 5 giorni.
5. Raccogliere le cellule di ogni bene, metterli separatamente in provette da 15 ml, aggiungere 5 ml di PBS in ogni provetta, e centrifugare a 600 xg e RT per 5 min.
6. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatica. Risospendere le cellule a una concentrazione di 1 - 10 x 10 ⁵ per ml con RPMI 1640 medium.

5. ELISpot Assay

1. Aggiungere 30 ml di 35% di etanolo in acqua distillata a ciascun pozzetto di piastre ELISPOT per 30 s.
   NOTA: quando pipettando, evitare di toccare la membrana nei pozzetti in ogni momento.
2. Capovolgere le piastre ELISPOT per rimuovere l'etanolo.
3. Mettere 150 ml di DDH autoclave ₂ O in ciascun pozzetto e incubareli a temperatura ambiente per 5 minuti per lavare via l'etanolo residuo; seguire con un lavaggio di PBS sterile a temperatura ambiente per 3 min.
   NOTA: I passaggi da 5.1 a 5.3 possono essere opzionali, a seconda della fabbricazione delle piastre.
4. Mettere 50 ml di 5 mg / mL policlonale (ab ') F ₂ frammento di antiumano Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in ciascun pozzetto delle piastre ELISPOT e incubare a 4 ° C per una notte (preferito) o 37 ° C per 2 h ^11.
   NOTA: Sigillare i bordi delle piastre con parafilm fino al momento dell'uso.
5. Capovolgere le piastre per rimuovere Abs non legato, aggiungere 200 ml di soluzione salina in ogni pozzetto e incubare per due volte a temperatura ambiente per 3 minuti ogni volta.
6. Aggiungere 200 ml di PBS con 5% BSA (o RPMI 1640 medium) a ciascun pozzetto per il blocco, e incubare a temperatura ambiente per 2 h.
7. Capovolgere le piastre per rimuovere il tampone di bloccaggio. Lavare ogni pozzetto due volte con 200 ml di PBS, come al punto 5.5.
8. Aggiungere 100 ml di RPMI 1640 medium ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C.
9. Quando si è pronti a seminare le cellule, capovolgere le piastre per rimuovere il supporto RPMI 1640.
10. Seme 100 microlitri (5 x 10 ^4), 50 ml (2,5 x 10 ^4), e 25 ml (1,25 x 10 ⁴⁾ delle celle (dai passi 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 e 4.6) nei pozzetti di una piatto ELISpot. Con terreno RPMI 1640, portare il volume a 150 ml / pozzetto.
    NOTA: Un minimo di uno o due diluizioni seriali di 2 volte per la placcatura le cellule è raccomandato.
11. Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° con 5% di CO ₂ per 8 - 14 h ^18. Evitare di spostare le piastre durante l'incubazione.
12. Capovolgere le piastre per rimuovere le cellule e RPMI 1640 medium.
13. Aggiungere 200 microlitri / pozzetto di PBS-T (PBS con 0,05% Tween 20) e incubate a temperatura ambiente per 5 volte, ogni volta per 3 min. Capovolgere la piastra per rimuovere il tampone di lavaggio tra ciascuna delle 5 lavaggi.
14. Aggiungere o fosfatasi alcalina IgG di capra anti-umano (AP), Abs Fcy-specifico (per il rilevamento IgG, 1: 5000 in PBS-T) O di capra anti-IgM umane-AP, Fcμ specifico frammento Abs (per il rilevamento IgM, 1: 5000 in PBS-T) nei pozzetti ed incubare a temperatura ambiente per 2 ore al buio.
15. Lavare ogni pozzetto due volte con 200 ml di PBS, come al punto 5.5.
16. Aggiungere 50 ml bromochloroindolyl soluzione di substrato / pozzetto di fosfato-nitro blu tetrazolio (BCIP / NBT). macchie viola-colorati appaiono normalmente in 5 - 15 min.
17. Aggiungere 100 microlitri / pozzetto di DDH ₂ O per evitare l'eccessivo sviluppo di macchie.
18. Lavare i piatti con acqua corrente dopo lo sviluppo completo di tutti i punti.
19. Rimuovere la underdrain delle piastre e consentire loro di aria secca nella scura.
20. Contare le macchie utilizzando un lettore di piastre automatizzato con una unità di immagine di acquisizione / analisi (ad esempio, uno scanner automatico o manualmente tramite un microscopio da dissezione).
    NOTA: Le piastre possono essere conservati a RT al buio e analizzati in seguito.

Risultati

PBMC sono state esaurite di globuli rossi e cellule aderenti (passi 1,2-1,7). Una aliquota (2 x 10 ⁶⁾ di cellule sono stati sottoposti ad analisi citofluorimetrica per illustrare le popolazioni di cellule naive B, cellule B di memoria, e PBS / PC nel sangue periferico (Figura 1). In PBMC di questo donatore, circa il 10% dei linfociti erano cellule CD19 ⁺ B. Nel vano B-cell, la percentuale di CD19 ⁺ CD27 ^- cellule B naive era di...

Discussione

Isolamento e la purificazione delle cellule del sangue umano periferico B

Normalmente, globuli rossi possono essere efficacemente rotti e liquidati con tampone di lisi (passo 1,2). È importante non incubare PBMC con il tampone di lisi RBC più di 5 minuti, come vitalità cellulare può essere influenzata dal cloruro di ammonio. In alternativa, globuli rossi e piastrine possono essere contemporaneamente rimossi dalla seguente protocollo.

Mescolare sangue intero fres...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 ml tube
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set	BD Biosciences	558007
Biotinylated CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Streptavidin magnetic microbeads	BD Biosciences	9000810
15 ml Falcon tubes	BD Falcon	352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-human CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-human CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-human CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-human CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-human CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-human CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinylated anti-human CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinylated anti-human CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	type B CpG
Recombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Recombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Recombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size	Merck Millipore	MSIPS4510	sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-095
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer	C.T.L.