סיקור הפעילות האנדוקרינית במים באמצעות מסחרי-זמין<em&gt; במבחנה</em&gt; Transactivation bioassays

Summary

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Abstract

ב bioassays transactivation במבחנה הראתה הבטחה ככלים לניטור איכות מים, אולם יישומם ואת היישום נרחב התעכב בין היתר בשל חוסר שיטות סטנדרטיות וזמינות של טכנולוגיה חזקה, ידידותי למשתמש. במחקר זה, זמין מסחרי, שורות תאים נעצר חלוקה הועסקו להקרין כמותית לפעילות האנדוקרינית של כימיקלים נוכחים דגימות מים המעניינות מקצוע איכות סביבה. פרוטוקול יחיד, סטנדרטי שכלל אבטחת איכות מקיפה / בקרת איכות (QA / QC) בדיקות פותחתה עבור פעילות קולטן אסטרוגן Glucocorticoid (ER ו GR, בהתאמה) באמצעות העברת אנרגית תהודת קרינה מבוססת תאים assay (סריג). דוגמאות של השפכים שפכים עירוניים מטופלים ומים עיליים ממערכות מים מתוקים בקליפורניה (ארה"ב), חולצו באמצעות מיצוי שלב מוצק ונותחו לפעילות האנדוקרינית באמצעות פרוטו סטנדרטיתcol. רקע מנה-תגובה עבור כימיקלי התייחסות ספציפי נקודות קצה עומדים בכללי QA / QC כנחוץ למדידה אמינה. תגובת הקרנת מבדק עבור דגימות מים עיליות הייתה במידה רבה לא ניתן לגילוי. לעומת זאת, דגימות שפכים ממפעלים טיפול שניוני היו הפעילות למדידה הגבוהה ביותר, עם ריכוזים המקבילה מבדק משוער (BEQs) עד 392 ng dexamethasone / L עבור GR ו -17 ng 17β-אסטרדיול / L עבור ER. תגובת המבדק למדגמת שליישונים בשפכים הייתה נמוכה מזה שנמדד לקולחים משניים, מה שמעיד על התחתונה שיורית של כימיקלים האנדוקרינית פעילים לאחר טיפול מתקדם. פרוטוקול זה הראה כי ב bioassays transactivation במבחנה לנצל זמינים מסחרית, תא נעצר חלוקה "ערכות", ניתן להתאים למסך פעילות אנדוקרינית במים.

Introduction

לניטור איכות מים הנוכחי מבוסס על היכולת בודדת ומדויק למדוד את המופע של מזהמים כימיים כמו פרוקסי לחשיפת חיות ובני האדם. עם זאת, ניטור הפרדיגמה הערכה כימי-ידי-זה כימי לא יכול לעמוד בקצב עם היקום הכימי המשתנה שאנו מתמודדים איתה. ככל שאנו לומדים יותר על הגורל ואת ההשפעות של כימיקלים סינטטיים וטבעיים, אנו ממשיכים לחפש כלי מדידה שכתובת צפויות השפעות ביולוגיות, וכי בעת ובעונה האחת חסינים לשינויי ייצור כימיקלים, שימוש קלט סביבתי. כלים כאלה הם רלוונטיים במיוחד להבנה אם כימיקלים ידועים או חדשים, ומוצרים טרנספורמציה, ראויים לתשומת לבנו. יתר על כן, תערובות מורכבות של כימיקלים הנמצאים במים מופנות כהלכה על ידי ניטור כימי יחיד. לפיכך, אנו עומדים בפני האתגר של מודרניזציה של ארגז כלי בקרה קיים לכתובת טובה יותר את הנושאים הללו tha מים עילייםt לקבל הזרמת השפכים קולחין נגר עירוני / stormwater.

בשנים האחרונות, טכניקות bioanalytical הראו הבטחה ככלי הקרנה להערכת איכות מים. בפרט, bioassays in'vitro המגיב כימיקלים מתנהגים באמצעות ידוע, מצבי פעולה ספציפיים ^1,2 הם עניין רב לקהילת הניטור הסביבתי ^3. מספר מחקרים מועסקים bioassays במבחנה לכמת את הפעילות האנדוקרינית של שתייה, משטח wastewaters ^{4 -6.} יתר על כן, מספר bioassays למקד אירועים מולקולריים ייזום (למשל, הפעלת קולטן) אשר ניתן לקשר פוטנציאל להשפעות המזיקות באמצעות מסלול תוצאה שלילי מנתח ^7,8.

האבולוציה של bioscreening להערכת איכות מים כבר יחסית מהירה, עם מאה שונים קצה מבדק במבחנה לאחר הוערכה עבור שלהםשירות ^9,10. נכון לעכשיו, רק קומץ של מבדקים הוכח להשיג דיוק מדידה טוב (בתוך מעבדות) תוך הפגנת היכולת להבחין בין איכויות מי ^5,6. לקבלת קולחים קולחים בפרט, את המופע של אסטרוגנים סטרואידים בסטרואידים כבר היוו בהצלחה באמצעות מבחני transactivation במבחנה ^11,12. עם זאת, רוב המחקרים שנערכו עד כה, המועסקים bioassays שורות תאים אשר הנם רכוש (ובכך אינו זמין נרחב), דורשים טיפול מתמשך ומניפולציה, או שניהם. כתוצאה מכך, היכולת לבצע סטנדרטיזציה פרוטוקולים, לבצע תרגילי כיול הבינה-מעבדה, ובסופו של דבר להעביר טכנולוגית הקרנה זה למשאבי מי הקהילה נשארה הפריעה.

לפחות ספק אחד של מבדקים במבחנה בדקה באמצעות תכנית ToxCast ארה"ב זמין מסחרי ¹³ קל לשימוש "הקפאת הפשרה4; פורמטים. חטיבת-נעצר אלו תא "ערכות" הוכחו להיות חזקים מדידת פעילותם של כימיקלים המופקים מים המייצגים רמות שונות של טיפול ^14. למרות פרוטוקולי הספק זמינים להקרין את הפעילות הביולוגית של כימיקלים או תערובות בודדים, חלקם דורשים שינויים לפני שהם יכולים להיות מיושמים על דגימות מים. קולחים שפכים ^15, נגר stormwater ^16, קבלת המים ^17,18 ועוד ^19,20 מים ממוחזרים לאחרונה הם דוגמאות מובהקות של התקשורת מימית כי הם בעלי עניין לקהילה איכות המים.

מחקר זה מציג פרוטוקול יחיד, סטנדרטי למדוד את הפעילות האנדוקרינית בדגימות מים באמצעות זמינים מסחריים, חטיבה-נעצרה bioassays transactivation במבחנה. הפגנו חוסנו של פרוטוקול באמצעות הערכה מקיפה של הרקע, תגובתיות המינון ואת הדירות של התגובה twנקודות קצה o של אסטרוגן עניין מיוחד ו transactivation קולטן Glucocorticoid (ER ו GR, בהתאמה). הפרוטוקול היה מוחל על דגימות מסך השפכים קולחין ומים עיליים ממערכות מים מתוקים בקליפורניה.

Protocol

1. איסוף דגימת מי תהליך (השתנה מ Escher et al. ⁹⁾

1. מלאו בקבוק זכוכית ענבר נקי 1 L המכיל אזיד הנתרן 1 גרם ו -50 מ"ג חומצה אסקורבית לפסגה עם דגימת מים של עניין. מדגם חנות ב 4 מעלות צלזיוס, תהליך בתוך 72 שעות.
   הערה: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד ויש לטפל בזהירות. השתמש בציוד מגן (העיניים / פנים, כפפות, ביגוד) ולשקול בתוך קטר-ברדס מתפקד כראוי. אין להשתמש מרית מתכת לשקילה.
2. להעביר את המדגם דרך פילטר סיבי זכוכית 1.6 מיקרומטר ולאחר מכן באמצעות מיצוי שלב preconditioned מוצק דיו (SPE) בקצב זרימה של 5-10 מ"ל / דקה. התאם את הלחץ של משאבת ואקום כדי לשלוט על קצב הזרימה.
3. אבק לייבש את המחסנית במשך 15 דקות.
4. Elute את מחסנית עם 10 מ"ל של מתנול, ואחריו 10 מ"ל של אצטון: הקסאן (1: 1, V / V).
5. תתרכז eluate ל ~ 1 מ"ל תחת זרם עדין של חנקן טוהר גבוהה. מֵמֵסהחליפין על ידי הוספת 500 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO) ו מתאדים לחלץ עד 500 μl.
6. מעביר את תמצית בקבוקון autosampler כוס ענבר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.

2. כן דילולים של כימיקלי הפנית Assay הספציפיים חלץ מים

1. כן 9 דילולים עבור עקומת הכיול.
   1. כן פתרון מניות של כימיקל ההתייחסות הספציפי assay ב 100% DMSO. הריכוז הסופי חייב להיות 2 מיקרומטר 17β-אסטרדיול עבור assay ER, ו- 100 מיקרומטר dexamethasone עבור assay GR. אחסן את פתרונות המניה ב -20 ° C.
   2. הוסף 15 μl של מניית התייחסות הכימית המתאימה ל 285 μl של מדיום assay בתוך שפופרת סטרילית (צינור # 1). מערבבים את המדגם על ידי pipetting למעלה ולמטה.
   3. הוסף 200 μl של פתרון של 5% DMSO במדיום assay ב 8 צינורות נוספים (צינורות # 2-9).
   4. העברת aliquot 100 μl מהצינור # 1 עד הצינור # 2 באמצעות גיגיתדואר # 9 לבצע סדרת דילול של פי 3. כל דגימה בדילול חייב להיות מעורב באופן יסודי עם טפטפת לפני נטילת aliquot והוספתה הצינור הבא.
2. כן מדגם שליטה ממס על ידי ערבוב 10 μl של DMSO ב 190 μl של מדיום assay.
3. הכן ארבעה דילולים עבור כל תמצית מים.
   1. בצינור הראשון, להוסיף 5 μL של תמצית המים 95 μL של המדיום assay ומערבבים היטב. הוסף 50 μl של 5% DMSO במדיום assay בשלושה צינורות אחרים.
   2. בצע דילול פי 2 על ידי העברת 50 μl של פתרון מהצינור אחד למשנהו.

3. מכינים את תרחיף תא לנהל את המבדק סריג

1. הכן את המדיום הספציפי assay פי הוראות היצרן. בינוני assay חייב להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, חימם עד 37 ° צלזיוס באמבט מים לפני השימוש.
2. קח בקבוקון של תאים נעצר חלוקת ER או GR מתוך חינם קריוגניזר להפשיר את התאים במהירות על ידי הצבת את הבקבוקון א-אמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות עם תסיסה עדינה. לטהר את הבקבוקון עם 70% אתנול ומניח אותו בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II.
3. פתח את בקבוקון שימוש בטכניקות aseptic ולהעביר את התאים לתוך 10 מ"ל של מדיום assay.
4. צנטריפוגה ב g 200 x למשך 5 דקות.
5. לשאוב supernatant באמצעות pipet זכוכית סטרילית resuspend התא גלולה ב 6 מ"ל של מדיום assay.
6. מערבבים 5 μl של ההשעיה תא עם 5 μl של פתרון הכתם חיוני ולהוסיף aliquot לתוך תא הספירה.
7. ספירת תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ אור או נגד תא אוטומטי להערכת הצפיפות של תאי חי השעית התא. לדלל במידת צורך להשיג צפיפות סופית של 550,000 תאים חיים לכל מיליליטר של מדיום assay.

4. פלייט תאים פלייט נקה התחתונה קיר שחור 96-היטב ומוסיפים מים תמצית מדולל

1. צור צלחתפריסה הכוללת עקומת כיול ספציפי assay 9 נקודות, דגימות QA / QC דילולים מרובים עבור כל תמצית מים. דוגמה של פריסת צלחת 96-היטב מוצג באיור 1.
2. להוסיף 90 μl של מדיום assay אל בארות שליטת תא ללא לשכפל.
3. יוצק את השעית תא מאגר pipetting סטרילי ולהוסיף 90 μl של השעית תא אל הבארות האחרות באמצעות פיפטה רבה.
4. הוסף 10 μl של הדגימות בדילול המוכנות במהלך שלב 2 עד הבארות המתאימות. הריכוז הסופי של DMSO לכל טוב חייב להיות לכל היותר 0.5%.
5. מכסים את הצלחת עם מכסה ומניחים אותו בתוך חממה 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

איור 1:. דוגמא של פריסת פלייט 96-גם הצלחת רבה גם נועדה לכלול עקומת כיול ספציפית assay, 3 סוגיםבקרות QA / QC (מדיה בלבד, תאים בינוניים ותאי נקי ב DMSO ממוסמרים בינונית) ו -4 דילולים לכל תמצית מים. מלאות דילול כל תמצית מים מנותח בבארות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. מכינים את פתרון טעינה הוסף כל טוב

1. לאחר דגירה, לאפשר את הצלחת לאזן RT. עבור מבדק סריג זה, צעדים 5.2 דרך 5.6 צריכים להתנהל בהיעדר האור הישיר.
2. כן פתרון טעינת 6x פי הוראות היצרן.
3. הוסף 20 μl של פתרון טעינת 6x היטב כל אחד.
4. הוסף 10 μl של מגיב כדאיויות תא היטב כל להעריך את הרעילות של מי תמצית המדוללת.
5. חותם את הצלחת עם סרט דבק אלומיניום.
6. דגירת הצלחת בחושך ב RT עבור שעה 2.

6. Cytotoxicity מדוד ותגובה פעילות האנדוקרינית

1. הגדר את קורא microplate עם היכולות תחתונות הקריאה הבאות הוראות היצרן.
2. עבור מבדק transactivation הסריג, למדוד קרינה הכחולה (409/460 ננומטר, עירור (Ex) / פליטה (Em גל)) וירוק (409 Ex / 530 Em ננומטר) ערוצים.
3. עבור assay cytotoxicity, למדוד קרינה ב 560 Ex / 590 ננומטר Em.

7. להעריך QA / בדיקות QC כדי לקבוע את איכות הנתונים

1. השווה את קרינת הגלם הממוצעת של (מדיה בלבד) ללא תא ותאי בלבד (תאים בינוניים assay נקי) שולט. קרינת הרקע בתקשורת בלבד צריכה להיות לפחות 25% נמוכות יותר מאשר בתשובתו של שליטת התאים בלבד.
2. לעבד את נתוני סריג הגלם. עבור שני "הכחול" ואת מערכי הנתונים 'הירוקים', להפחית את הקרינה הממוצעת של בארות שליטה ללא תאים מכל התא המכיל גם. חשב אתיחס כחול / ירוק עבור כל טוב ניסיוני.
3. השוואת כחול / ירוק יחס של תאים בלבד ותאים עם פקדי DMSO. ערכי קרינה של בקרות אלה צריכים להיות בתוך 15% סטיית תקן יחסית (RSD).
4. שרטט את עקומת הכיול הספציפית assay כמו יחס כחול / ירוק נגד ריכוז המדגם המבוטא מסה מולקולרית יומן (log M). לחשב את השיפוע, R ² והיכנס EC ₅₀ (ריכוז אפקט 50%). פרמטרי כיול צריכים להיות בטווח הצפוי המפורט בטבלת 1.
5. חשב את RSD לכל בבארות בשלושה עותקים. ההשתנות בין משכפל צריכות להיות פחות מ -20%.
6. לנתוני cytotoxicity (560 Ex / 590 Em ננומטר), להפחית את הממוצע מלא ללא תאים (רקע בתקשורת כלומר) מכל בארות התא המכיל.
7. חשב את קרינת רקע-מופחתים הממוצעים עבור כל דגימה. מגרש את נתוני הקרינה וכתוצאה כאחוז השליטה DMSO. דילולים מדגמים לא צריכיםבתצוגות יותר תמותת תאים 20% בהשוואה לקבוצת ביקורת תאים בלבד ו DMSO.

8. ניתוח נתונים

1. חשב את מגבלת assay של זיהוי (לוד) כתגובת כיול המינימום בתוספת שתי סטיות תקן של הממוצע של בתגובה כי.
2. לקבלת דוגמיות מראה מנת תגובה, לגזור את EC ₅₀   של תמצית המים באמצעות שיפוע רגרסיה ליניארית של עקומת הכיול בין 10 ו -50 ריכוזי השפעת% של כימיקל ההתייחסות.
3. חשב את הריכוז Equivalent Bioanalytical (רר"מ) באמצעות הנוסחה: רר"מ = ₅₀ EC של כימיים התייחסות / EC ₅₀ של דגימת מים.

תוצאות

במחקר הנוכחי, דגימות מרוכבי 4x 24 שעות של שפכי שפכים עירוניים מטופלים, 6 דגימות לתפוס מים עיליים ממערכות מים מתוקות בדרום קליפורניה שדה ריק המורכב מי ultrapure נבחרו כדי להמחיש בפרוטוקול זה. 3 מתוך 4 דגימות השפכים היו מצמחי טיפול בשפכי בוצה קונבנציונליים מו...

Discussion

עוצמתה המתועדת היטב של אסטרוגנים סביבתיים, כגון 17β-אסטרדיול (E2), הקרנת כתבים לכימיקלים אלה בריכוזי ng / L ^23,24. במחקר זה, תגובת ER לקולחי שפכים (טווח רר"מ: 2.3 כדי 17 ng E2 / L) היה גבוה במעט ודווח שפכים משניים מן WWTPs האוסטרלי ^20, ואילו BEQs במים עיליים (<0.5 כדי -4 ננוגרם E2 /...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneBLAzer ER alpha DA assay kit	ThermoFisher	K1393	Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
GeneBLAzer GR DA assay kit	ThermoFisher	K1391	Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
PrestoBlue cell viability reagent	ThermoFisher	A-13261
Trypan blue, 0.4% in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Also available at ThermoFisher
Corning 96-well black wall, clear-bottom plate	Corning	3603	Individually wrapped, sterile with lid
Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM	Sigma-Aldrich	WHA1820025
Microplate aluminum sealing film	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent	Waters	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Ascorbic acid	Fisher Scientific	A61-100	Also available at Sigma-Aldrich
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Molecular grade
Solvents (acetone, hexane, methanol)	Fisher Scientific		HPLC grade
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore.
Automated cell counter or hemocytometer	Various*		Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.
Class II biological safety cabinet	Various*
CO2 incubator	Various*
Cryogenic freezer	Various*		Liquid nitrogen storage dewar is recommended.
Fluorescence microplate-reader	Various*		The reader must have bottom read capabilities.
* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.