水中の内分泌活性のスクリーニング市販の使い方<em&gt;インビトロ</em&gt;トランスバイオアッセイ

要約

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

要約

試験管内トランスバイオアッセイではしかし、彼らの採用および広範囲のアプリケーションが原因で標準化された方法で堅牢な、ユーザーフレンドリーな技術の利用可能性の欠如に部分的に妨げられてきた、水質監視ツールとして有望であることが示されました。本研究では、市販されている、分割逮捕された細胞株を定量的環境の質の専門家への関心の水試料中に存在する化学物質の内分泌活性をスクリーニングするために使用しました。総合的な品質保証/品質管理（QA / QC）のチェックを含め、単一の、標準化されたプロトコルは、細胞ベースの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）アッセイを用いて（それぞれERおよびGR）エストロゲンおよびグルココルチコイド受容体活性のために開発されました。カリフォルニア（米国）での淡水システムから処理された下水排水や地表水のサンプルは、固相抽出を用いて抽出し、標準化されたプロトを使用して、内分泌活性について分析しましたCOL。背景とエンドポイント固有の参照化学物質の用量反応は、信頼性の高い測定のために必要と認められるQA / QCのガイドラインを満たしました。地表水試料のバイオアッセイスクリーニング応答は、主に検出されませんでした。これとは対照的に、二次処理工場からの流出物サンプルは、ERのための392 ngのデキサメタゾンGR用/ Lおよび17 ngの17βエストラジオール/ Lまでの推定バイオアッセイ同等の濃度（BEQs）で、最高の測定可能な活性を有していました。三次流出物サンプルのためのバイオアッセイ応答は、高度処理後の内分泌アクティブな化学物質の低い残留を示し、二次排水のために測定されたものよりも低かったです。このプロトコルは、市販の利用ビトロトランスバイオアッセイで 、分割逮捕セル「キット」、水中の内分泌活性をスクリーニングするために適合させることができることを示しました。

概要

現在の水質のモニタリングを正確かつ精密に野生動物とヒトへの暴露の代用としての化学汚染物質の発生を測定する能力を前提としています。しかし、この化学・バイ・化学的モニタリングと評価のパラダイムは、我々が直面して刻々と変化する化学の世界でペースを維持することはできません。私たちは、合成および天然の化学物質の運命と影響についての詳細を学ぶように、私たちは期待生物学的影響に対処測定ツールを探し続け、同時にそれは、化学物質の生産、使用状況や環境入力の変化に免疫があります。このようなツールは、未知または新規化学物質、および変換製品は、私たちの注目に値するかどうかを理解するために特に関連しています。また、水中に存在する化学物質の複雑な混合物はあまり個々の化学モニタリングによって対処されます。したがって、私たちはより良い表層水の股関節にこれらの問題に対処するために既存の監視ツールボックスの近代化の課題に直面しますトン下水処理水排水と都市/雨水流出の排出を受けます。

近年、生物分析技術は、水の品質評価のためのスクリーニングツールとして有望であることが示されています。知ら介して作用する化学物質への対応、特に、in'vitroバイオアッセイでは、アクション^1,2の特定のモードは、環境モニタリングのコミュニティ³に大きな関心が持たれています。多数の調査は飲酒、表面および廃水^{4 -6}の内分泌活性を定量化するためにインビトロバイオアッセイで使用しています。また、バイオアッセイの数は、分子の開始イベントを（ 例えば、受容体活性化）、潜在的に有害な結果の経路を介して有害な影響にリンクさせることができる^7,8を分析対象としています。

水質評価のためのbioscreeningの進化は、in vitroバイオアッセイのエンドポイントでの異なる数百人が彼らのために評価されたと、比較的急速にされていますユーティリティ^9,10。水質^5,6の間で分化する能力を発揮しながら、現在、バイオアッセイのほんの一握りは、（研究所内）、良好な測定精度を達成することが示されています。特に下水処理水排水のために、エストロゲンおよびグルココルチコイドステロイドの発生に成功ビトロトランスアッセイ^11,12 に用いて会計処理されています。しかし、現在までのほとんどの研究は、その細胞株独自のもの（したがって、広く利用可能ではない）バイオアッセイを採用しており、継続的なケアと操作、またはその両方が必要です。その結果、プロトコルを標準化研究室間のキャリブレーション演習を行い、最終的に水資源のコミュニティに、このスクリーニング技術を転送する能力は、ヒンダードまま。

米国ToxCastプログラムを通じて吟味のin vitroバイオアッセイの少なくとも1つのサプライヤは、使いやすい「凍結融解で¹³市販されています。4;フォーマット。これらの分割阻止セル「キット」は、処置¹⁴の異なるレベルを表す水から抽出された化学物質の活性を測定することで堅牢であることが示されています。ベンダープロトコルは、個々の化学物質または混合物の生物活性をスクリーニングするために利用可能であるが、それらは、水サンプルに適用する前に、それらのいくつかは、修正を必要とします。下水処理水の流出物^15、雨水流出^16、受信水は^17,18そして最近再生水の^19,20水質コミュニティに関心のある水性媒体の主な例です。

本研究では、市販されている使用して、水試料中の内分泌活性を測定するための単一の、標準化されたプロトコルを提示し、分割逮捕ビトロトランスバイオアッセイで 。私たちは、TWの応答の背景、用量応答性と再現性を総合的に評価を通じてプロトコルの堅牢性を実証しました特に関心のエストロゲンとグルココルチコイド受容体トランスのOエンドポイント（ERおよびGR、それぞれ）。プロトコルは、カリフォルニアの淡水システムから下水処理水排水と表面水の画面サンプルに適用しました。

プロトコル

1.収集し、プロセス水サンプル（エッシャーらから変更された^。9）

1. 関心の水試料でトップに1グラムのアジ化ナトリウムおよび50mgのアスコルビン酸を含む清浄な1 Lアンバーガラスボトルを埋めます。 72時間内のショップ4°Cでのサンプルおよびプロセス。
   注：アジ化ナトリウムは非常に毒性があり、慎重に取り扱わなければなりません。保護具（目/顔、手袋、衣服）を使用し、適切に機能してヒュームフード内で重量を量ります。計量のための金属へらを使用しないでください。
2. 1.6μmのガラス繊維フィルターを通して試料を通過した後、5-10 ml /分の流速で前処理固相抽出（SPE）カートリッジを通して。流量を制御するために、真空ポンプの圧力を調整します。
3. 真空を15分間カートリッジを乾燥させます。
4. ヘキサン（1：1、v / v）のアセトン10ml、続いてメタノール10mlでカートリッジを溶出します。
5. 高純度窒素の穏やかな流れの下で〜1mlに溶出液を濃縮します。溶媒ジメチルスルホキシド（DMSO）500μlのを追加し、ダウンを500μlの抽出液を蒸発させることによって交換。
6. アンバーガラスオートサンプラーバイアルに抽出液を転送します。 -20℃で保管してください。

2.アッセイ特定の参照化学物質の希釈液と水抽出物を準備します

1. 検量線用の9希釈液を調製します。
   1. 100％DMSO中のアッセイ特定の参照化学物質の原液を作ります。最終濃度は、ERアッセイのために2μM17βエストラジオール、およびGRアッセイのために、100μMデキサメタゾンでなければなりません。 -20℃でストック溶液を保管してください。
   2. （チューブ＃1）滅菌チューブにアッセイ培地285μlに適切な参照化学株式の15μLを加えます。上下にピペッティングすることによって、サンプルを混ぜます。
   3. 8追加のチューブ（チューブ＃2-9）でアッセイ培地中で5％のDMSO溶液200μlを追加します。
   4. 浴槽を通してチューブ＃2にチューブ＃1からの100μlのアリコートを転送E＃9は、3倍希釈系列を実行します。各希釈サンプルは、一定分量を取り、次のチューブに追加する前に、ピペットで十分に混合しなければなりません。
2. アッセイ培地190μlのDMSOを10μlを混合することにより、溶媒対照サンプルを準備します。
3. 各水抽出するための4つの希釈液を調製します。
   1. 第1のチューブでは、アッセイ培地の95μLの水抽出物の5μLを加え、よく混ぜます。 3他のチューブにアッセイ培地中で5％のDMSO 50μLを加えます。
   2. 次へ1管から溶液50μlを転送することにより2倍希釈を行います。

3. FRETバイオアッセイを実施するために細胞懸濁液を準備します

1. 製造元の指示に従ってアッセイ特定のメディアを準備します。アッセイ培地は4℃​​で保存し、使用前に水浴中で37℃に温めなければなりません。
2. 極低温自由のうち、ERまたはGR分裂停止細胞のバイアルを取りますZERは、穏やかに攪拌しながら2分間、37℃の水浴中でバイアルを配置することによって、迅速に細胞を解凍し、。 70％エタノールでバイアルを除染し、クラスII生物学的安全キャビネットに入れてください。
3. 無菌技術を使用して、バイアルを開き、アッセイ培地10mlに細胞を移します。
4. 5分間200×gで遠心分離します。
5. 滅菌ガラスピペットを用いて上清を吸引し、アッセイ培地6ml中に細胞ペレットを再懸濁します。
6. 生体染色溶液5μlの細胞懸濁液の5μLを混合し、計数室にアリコートを追加します。
7. 光学顕微鏡または自動細胞カウンターを使用して生細胞の数をカウントし、細胞懸濁液中の生細胞の密度を推定します。アッセイ培地1ml当たり55万生細胞の最終濃度を得るために、必要に応じて希釈します。

4.プレート96ウェル黒壁透明底プレート中の細胞と希釈し、水エキスを追加します。

1. プレートを作成します。各水抽出物についての較正曲線、QA / QCサンプルと複数の希釈特定9ポイントアッセイを含むレイアウト。 96ウェルプレートのレイアウトの例が図1に示されています。
2. 複製細胞を含まない対照ウェルにアッセイ培地90μlのを追加します。
3. 無菌分注容器内の細胞懸濁液を注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して他のウェルに細胞懸濁液90μlを添加します。
4. 適切なウェルへのステップ2の間に調製した希釈サンプルの10μlのを追加します。ウェル当たりDMSOの最終濃度は0.5％、最大でなければなりません。
5. 蓋付きのプレートをカバーし、16時間、37℃で5％CO ₂インキュベーターに入れてください。

図1：96ウェルプレートのレイアウトの例のマルチウェルプレートは、3種類のアッセイ特定の較正曲線を含むように設計されています。QA / QCコントロールのと水抽出物あたり4希釈（メディアのみ、DMSO中のきれいな培地中の細胞と細胞が培地をスパイクしました）。各制御および水抽出物の希釈は三連ウェルで分析されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

5.ローディング溶液を準備し、各ウェルに追加

1. インキュベーション後、プレートを室温に平衡化することができます。このFRETバイオアッセイのために、5.6を介して5.2が直接光の不存在下で行われるべきであるステップ。
2. 製造元の指示に従って6×ローディング溶液を準備します。
3. 各ウェルに6×ローディング溶液20μlを追加します。
4. 希釈した水抽出物の細胞毒性を評価するために、各ウェルに細胞生存性試薬10μlのを追加します。
5. アルミニウム接着フィルムでプレートを密封します。
6. 2時間室温で暗所でプレートをインキュベートします。

6.メジャーの細胞毒性および内分泌活動レスポンス

1. 製造業者の指示に従って下読み取り機能を備えたマイクロプレートリーダーを設定します。
2. FRETトランスバイオアッセイのために、青色の蛍光（460分の409 nmの励起（例）/発光（EM）波長）と緑（409例/ 530エムnm）のチャネルを測定します。
3. 細胞傷害性アッセイのために、560例/ 590エムnmで蛍光を測定します。

7.データの品質を決定するために、QA / QCチェックを評価します

1. 平均生の無細胞（専用メディア）の蛍光および細胞のみ（きれいなアッセイ培地中の細胞）を対照と比較します。メディアのみのバックグラウンド蛍光は、細胞のみの対照の応答よりも少なくとも25％低いことが必要です。
2. 生FRETデータを処理します。 「青」と「グリーン」データセットの両方について、よく含むすべての細胞からの細胞を含まない対照ウェルの平均蛍光を引きます。計算各実験ウェルについての青/緑比。
3. DMSOコントロールを持つ唯一の細胞 - 細胞の青/緑比を比較してください。これらのコントロールの蛍光値は、15％相対標準偏差（RSD）の範囲内でなければなりません。
4. ログ分子量（Mをログ）として表現試料濃度に対する青/緑比などのアッセイ特定の較正曲線をプロットします。スロープ、R ^2を計算し、EC _50（50％影響濃度）を記録します。較正パラメータは、 表1に記載予想範囲内であるべきです。
5. すべての三連のウェルのためのRSDを計算します。レプリケート間のばらつきが20％未満であるべきです。
6. 細胞毒性データ（560例/ 590エムnm）のために、すべての細胞を含むウェルからの細胞を含まない対照の平均（すなわち、メディアの背景を）引きます。
7. 各サンプルの平均バックグラウンドを差し引いた蛍光を計算します。 DMSO対照のパーセントとして得られる蛍光データをプロットします。サンプル希釈はいけません細胞のみで、DMSO対照と比較して20％以上の細胞死を示します。

8.データ分析

1. 最小キャリブレーション応答に加えて、その応答の平均値の2標準偏差として検出（LOD）の測定限界を計算します。
2. 用量反応を示す試料について、EC _50を導出_します  基準化学物質の10と50％効果濃度と較正曲線の線形回帰の傾きを用いて、水抽出物。
3. / EC水サンプルの₅₀参照化学物質のBEQ = EC _50：式を使用して、バイオアナリティカル当量濃度（BEQ）を計算します。

結果

本研究では、処理された都市下水排水の4倍24時間の複合サンプル、南カリフォルニアの淡水システムからの地表水の6グラブサンプルおよび超純水からなるフィールドブランクは、このプロトコルを説明するために選択しました。 4廃液試料の3は、従来の活性汚泥排水処理プラント（「二次流出液」）、および砂/炭素ろ過追加後の生物学的処理（「三次流出液」）と?...

ディスカッション

このようなNG / L濃度^23,24でこれらの化学物質のための17βエストラジオール（E2）、ワラントのスクリーニングなどの環境エストロゲン、のよく文書効力。本研究では、汚水排水（BEQ範囲：2.3〜17 ngのE2 / L）のためのER応答は、オーストラリアのWWTPs ²⁰から二次処理水のために報告されたものよりやや高かった、表面水のBEQs一方（<0.5〜4 ngのE2 / L ^{）16（<1〜11} ngのE2 / L?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneBLAzer ER alpha DA assay kit	ThermoFisher	K1393	Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
GeneBLAzer GR DA assay kit	ThermoFisher	K1391	Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
PrestoBlue cell viability reagent	ThermoFisher	A-13261
Trypan blue, 0.4% in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Also available at ThermoFisher
Corning 96-well black wall, clear-bottom plate	Corning	3603	Individually wrapped, sterile with lid
Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM	Sigma-Aldrich	WHA1820025
Microplate aluminum sealing film	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent	Waters	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Ascorbic acid	Fisher Scientific	A61-100	Also available at Sigma-Aldrich
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Molecular grade
Solvents (acetone, hexane, methanol)	Fisher Scientific		HPLC grade
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore.
Automated cell counter or hemocytometer	Various*		Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.
Class II biological safety cabinet	Various*
CO2 incubator	Various*
Cryogenic freezer	Various*		Liquid nitrogen storage dewar is recommended.
Fluorescence microplate-reader	Various*		The reader must have bottom read capabilities.
* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.