Скрининг на эндокринную активность в воде с использованием коммерчески доступного<em&gt; In Vitro</em&gt; Трансактивационную Биотесты

Резюме

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Аннотация

В пробирке трансактивации биопроб показали обещание в качестве инструментов мониторинга качества воды, однако их принятие и широкое применение было затруднено отчасти из - за отсутствия стандартизированных методов и наличия надежной, удобной технологии. В этом исследовании, имеющиеся в продаже, подразделение арестованы клеточные линии были использованы для количественного скрининга эндокринной активности химических веществ, присутствующих в пробах воды, представляющих интерес для профессионалов качества окружающей среды. Единый, стандартизированный протокол, который включал гарантии всеобъемлющего качества / контроля качества (QA / QC) проверяет, был разработан для активности Эстроген и глюкокортикоидных рецепторов (ER и ГР, соответственно) с использованием клеток на основе флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) анализа. Образцы очищенных коммунально-бытовых сточных вод стоков и поверхностных вод из пресноводных систем в Калифорнии (США), были извлечены с использованием экстракции твердой фазы и анализировали на эндокринную активность с использованием стандартизированного протоцвет Предпосылки и доза-реакция для конечных конкретных эталонных химических веществ встретились руководящие принципы ОК / КК считаются необходимыми для надежного измерения. Реакция биопроба скрининг проб поверхностных вод был в значительной степени не обнаруживается. В отличие от стоков пробы из вторичных очистных сооружений имели самую высокую активность измеримое, с оцениваемыми биопроб эквивалентных концентрациях (BEQs) до 392 нг / л дексаметазон для GR и 17 нг 17β-эстрадиол / L для ER. Ответ на количественное определение биологической активности третичного отходящем образца была ниже, чем измеренная для вторичных стоках, что указывает на меньшую остаточную эндокринных активных химических веществ, после того, как доочистку. Этот протокол показал , что в пробирке трансактивации биопроб , которые используют коммерчески доступный, разделением задержан клетка "наборы", могут быть приспособлены для скрининга на эндокринную активность в воде.

Введение

Текущий контроль за качеством воды основывается на способности точно и точно измерить возникновение химических загрязнителей в качестве прокси для воздействия на диких животных и людей. Тем не менее, это химическое вещество, по-химического мониторинга и оценки парадигма не может идти в ногу с постоянно меняющейся химической вселенной, что мы сталкиваемся. Чем больше мы узнаем о судьбе и воздействии синтетических и природных химических веществ, мы продолжаем искать средства измерения, которые касаются ожидаемых биологических воздействий, и что в то же время имеют иммунитет к изменениям в химическом производстве, эксплуатации и окружающей среды ввода. Такие инструменты особенно важны для понимания того, неизвестные или новые химические вещества и продукты преобразования, заслуживают нашего внимания. Кроме того, сложные смеси химических веществ, присутствующих в воде плохо решаются в рамках отдельных химического мониторинга. Таким образом, перед нами стоит задача модернизации существующего инструментария мониторинга для более эффективного решения этих проблем в поверхностных водах тхат получают сброс очищенных сточных вод сточных вод и городского / ливневых стоков.

В последние годы Биоаналитическая методы показали обещание как скрининг инструменты для оценки качества воды. В частности, in'vitro биопроб , которые реагируют на химические вещества , действующие с помощью известно, конкретные способы действия ^1,2 представляют большой интерес для мониторинга окружающей среды сообщества ^3. Многочисленные исследования использовали в пробирке биопроб для количественного определения эндокринную активность питьевой, поверхностных и сточных водах ^{4 -6.} Кроме того, ряд биопробы целевых молекулярных исходных событий (например, активация рецептора) , которые потенциально могут быть связаны с пагубными последствиями через неблагоприятный исход пути анализа ^7,8.

Эволюция биологического скрининга для оценки качества воды было относительно быстрым, с сотнями различных в пробирке биопроб конечных точек будучи оценены по ихУтилита ^9,10. В настоящее время лишь несколько биопробы было показано , для достижения хорошей точности измерений ( в пределах лаборатории), демонстрируя при этом способность различать среди водных качеств ^5,6. Для получения очищенных сточных вод сточных вод , в частности, возникновение эстрогенов и глюкокортикоидных стероидов было успешно учитываются с использованием в пробирке трансактивации ^11,12. Тем не менее, большинство исследований на сегодняшний день использовали биопробы, чьи клеточные линии, являются собственностью компании (и, следовательно, не получили широкого распространения), требуют постоянного ухода и манипуляции, или обоих. В результате, возможность стандартизации протоколов, выполнять межлабораторных калиброванию, и в конечном итоге передать эту технологию скрининга в водных ресурсах сообщества по-прежнему затруднены.

По крайней мере один поставщик биопроб в пробирке , прошедших проверку в рамках программы США ToxCast является коммерчески доступным ¹³ в простой в использовании "замораживании и оттаивании4; форматов. Эти разделением арестованы клетка "наборы" , как было показано , чтобы быть надежными в измерении активности химических веществ , извлеченных из воды , представляющих различные уровни обработки ^14. Хотя протоколы поставщика доступны для скрининга биоактивности отдельных химических веществ или смесей, некоторые из них требуют доработки, прежде чем они могут быть применены к проб воды. Очищенные сточные воды сточные ^15, ливневые стоки ^16, получая воды ^17,18 и совсем недавно оборотной воды ^19,20 являются главными примерами водных сред, представляющих интерес для сообщества качества воды.

Данное исследование представляет собой единый, стандартизированный протокол для измерения эндокринную активность в пробах воды с использованием коммерчески доступного, разделением арестован в пробирке трансактивации биопробы. Мы продемонстрировали надежность протокола посредством комплексной оценки фона, дозы и чувствительностью повторяемости ответа на ТВтO конечные точки, представляющие особый интерес к эстрогенам и глюкокортикоидных рецепторов трансактивацией (ER и ГР, соответственно). Протокол был применен к образцам экрана очищенных сточных вод стоков и поверхностных вод из пресноводных систем в Калифорнии.

протокол

1. Собрать и обработать пробы воды (Modified из Эшера и др. ⁹⁾

1. Заполните чистую 1 L янтарный стеклянный флакон, содержащий 1 г азида натрия и 50 мг аскорбиновой кислоты в верхней части с образцом воды, представляющей интерес. образец Хранить при температуре 4 ° С и процесс в течение 72 часов.
   Примечание: Азид натрия является высокотоксичным и должны быть обработаны с осторожностью. Используйте защитную одежду (для глаз / лица, перчатки, одежда) и весят должным образом функционирующего вытяжного шкафа. Не используйте металлический шпатель для взвешивания.
2. Пропускают через образец стекловолоконный фильтр 1,6 мкм, а затем через выдержано твердофазной экстракции (SPE) картриджа при скорости потока 5-10 мл / мин. Отрегулировать давление вакуумного насоса для управления скоростью потока.
3. Вакуумный сухой картридж в течение 15 мин.
4. Элюции картридж с 10 мл метанола, затем 10 мл ацетона и гексана (1: 1, об / об).
5. Концентрат элюата до ~ 1 мл в слабом потоке азота высокой чистоты. растворительобмен путем добавления 500 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и упаривание экстракта до 500 мкл.
6. Перенесите экстракт флакон автосамплера из янтарного стекла. Хранить при -20 ° C.

2. Подготовить разведениях Пробирной конкретной ссылки Химическая и водный экстракт

1. Подготовка 9 разведений для калибровочной кривой.
   1. Сделать исходного раствора для анализа конкретного исходного химического вещества в 100% ДМСО. Конечная концентрация должна быть 2 мкМ 17β-эстрадиола для анализа ER и 100 мкМ дексаметазона для анализа GR. Хранить растворы при -20 ° С.
   2. Добавьте 15 мкл соответствующего опорного запаса химических веществ до 285 мкл среды для анализа в стерильную пробирку (труба # 1). Смешайте образец с помощью пипетки вверх и вниз.
   3. Добавьте 200 мкл раствора 5% ДМСО в среде для анализа в 8 дополнительных трубок (трубок # 2-9).
   4. Передача 100 мкл аликвоты из пробирки № 1 к трубке № 2 через ваннуе # 9 для выполнения серии разведений 3 раза. Каждый разбавленный образец необходимо тщательно перемешать с помощью пипетки, прежде чем принимать аликвоты и добавить его к следующей трубе.
2. Приготовьте растворителя контрольного образца путем смешивания 10 мкл ДМСО в 190 мкл среды для анализа.
3. Подготовьте четыре разведений для каждого водного экстракта.
   1. В первую пробирку, добавляют 5 мкл водного экстракта в 95 мкл среды для анализа и тщательно перемешать. Добавляют 50 мкл 5% ДМСО в среде для анализа в трех других трубок.
   2. Выполнить разбавление 2-кратное путем переноса 50 мкл раствора из одной трубы в другую.

3. Подготовка суспензии клеток для проведения FRET биоанализа

1. Подготовьте для анализа конкретного носителя в соответствии с инструкциями изготовителя. Среды для анализа необходимо хранить при температуре 4 ° С и нагревали до 37 ° С в водяной бане перед использованием.
2. Возьмите флакон ER или GR-деления клеток арестовано из криогенной бесплатноЗер и оттаивать клетки быстро, поместив флакон в водяную баню при 37 ° С в течение 2 мин при осторожном перемешивании. Обеззараживайте флакон с 70% этанола и поместить его в кабинете биологической безопасности II класса.
3. Открыть флакон с использованием асептических методов и переноса клеток в 10 мл среды для анализа.
4. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
5. Аспирируйте супернатант, используя стерильную стеклянную пипетку и ресуспендируют осадок клеток в 6 мл среды для анализа.
6. Смешайте 5 мкл клеточной суспензии с 5 мкл раствора витального красителя и добавляют аликвоты в счетной камере.
7. Подсчитайте количество живых клеток с помощью светового микроскопа или автоматизированного счетчика клеток и оценить плотность живых клеток в клеточной суспензии. Развести в случае необходимости, чтобы получить конечную плотность 550,000 живых клеток на мл среды для анализа.

4. Пластина клеток в 96-луночного Black Wall Clear-нижней плиты и добавить Разводненная Водный экстракт

1. Создать пластинумакет, который включает в себя 9-балльной анализа конкретных калибровочной кривой, образцы QA / QC и несколько разведений для каждого водного экстракта. Пример компоновки пластины 96-луночного показана на рисунке 1.
2. Добавьте 90 мкл среды для анализа с повторными бесклеточных контрольных лунках.
3. Налейте клеточной суспензии в стерильной пипетки резервуар и добавить 90 мкл суспензии клеток в другие лунки с помощью многоканальной пипетки.
4. Добавляют 10 мкл разбавленных образцов, полученных на стадии 2 в соответствующие лунки. Конечная концентрация ДМСО на лунку должна составлять 0,5% максимум.
5. Закройте планшет крышкой и поместить его в 5% CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 16 часов.

Рисунок 1:. Пример 96-луночного Layout высевания многоскважинных пластина предназначена для включения системы анализа конкретную калибровочную кривую, 3 видаорганов управления QA / QC (СМИ только клетки в чистой среде и клетки в ДМСО подскочили среды) и 4 разведений за водной вытяжке. Каждый элемент управления и разбавление водного экстракта анализируется в трех экземплярах скважин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5. Подготовьте Загрузка раствора и добавить в каждую лунку

1. После инкубации позволяют планшет уравновешиваться до комнатной температуры. Для этого FRET биопроб, шаги с 5.2 по 5.6 следует проводить при отсутствии прямого света.
2. Подготовьте 6х загрузки раствор в соответствии с инструкциями изготовителя.
3. Добавьте 20 мкл 6х загрузки раствора в каждую лунку.
4. Добавьте 10 мкл реагента жизнеспособность клеток в каждую лунку, чтобы оценить цитотоксичность разбавленного водного экстракта.
5. Уплотнение пластины с алюминиевым клеевой пленки.
6. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре в течение 2 часов.

6. Мера цитотоксичность и эндокринная активность Response

1. Настройка микропланшет-ридера с возможностями снизу чтения следующие инструкции изготовителя.
2. Для трансактивации биопроб FRET, измерения флуоресценции в голубой (409/460 нм, возбуждение (Ex) / излучение (Em) длины волны) и зеленый (409 Ex / 530 нм ЕМ) каналов.
3. Для анализа цитотоксичности, измерения флуоресценции при 560 Ex / 590 Em нм.

7. Оценка качества / проверки КК для определения качества данных

1. Сравните среднюю сырую флуоресценцию бесклеточной (носителя) и клетки-только (клетки в чистой среде для анализа) управления. Средства массовой информации только фон флуоресценции должен быть по меньшей мере на 25% ниже, чем реакция контрольных клеток-только.
2. Процесс необработанных данных ладу. Для обоих «синих» и «зеленых» наборов данных, вычесть среднее флуоресценции клеток-контрольных лунках от всей клетки, содержащей хорошо. Вычислитьсиний / зеленый отношение для каждой экспериментальной скважины.
3. Сравнить синий / зеленый соотношение количества клеток-только и клеток с контролем ДМСО. Флуоресцентные значения этих элементов управления должно быть в пределах 15% относительного стандартного отклонения (RSD).
4. Постройте анализа специфической калибровочной кривой, как синий / зеленый отношение по отношению к концентрации образца, выраженное в лог молекулярной массы (журнал М). Вычислить наклон, R ² и войти EC ₅₀ (50% концентрации Эффект). Параметры калибровки должны быть в пределах ожидаемого диапазона , перечисленных в таблице 1.
5. Вычислить RSD для всех трех лунок. Вариабельность между повторами должен быть менее чем на 20%.
6. Для получения данных цитотоксичности (560 Ex / 590 Эм нм), вычесть бесклеточной среднее контрольное (т.е. фоновый носитель) из всех клеток, содержащих лунок.
7. Рассчитывают среднее фоновое-вычитали флуоресценции для каждого образца. Plot полученные данные флуоресценции в процентах от контроля ДМСО. Примеры разбавление не должныдемонстрируют смертность клеток более чем на 20% по сравнению с клетками-только и ДМСО контроля.

8. Анализ данных

1. Рассчитывают анализа Предел обнаружения (LOD) в качестве минимального ответа калибровки плюс два стандартных отклонения от среднего значения этого ответа.
2. Для образцов , показывающих реакции от дозы, вывести ЕС ₅₀   водной вытяжки, используя наклон линейной регрессии калибровочной кривой от 10 до 50% концентрации эффект от эталонного химического вещества.
3. Вычислить эквивалентную концентрацию Биоаналитический (BEQ) , используя формулу: BEQ = ЕС ₅₀ эталонного химического вещества / EC ₅₀ пробы воды.

Результаты

В настоящем исследовании, были выбраны 4x 24 ч образцы композита из очищенных коммунально-бытовых сточных вод сточных вод, 6 разовых проб поверхностных вод из пресноводных систем в южной Калифорнии и поле пустым, состоящий из сверхчистой воды, чтобы проиллюстрировать э?...

Обсуждение

Хорошо документированы активность экологических эстрогенов, таких как эстрадиол-17 & beta ; (E2) гарантирует скрининг для этих химических веществ в концентрациях нг / л ^23,24. В данном исследовании реакция ER для очистки сточных вод стоков (диапазон BEQ: от 2,3 до 17 нг E2 / л) была несколько вы?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneBLAzer ER alpha DA assay kit	ThermoFisher	K1393	Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
GeneBLAzer GR DA assay kit	ThermoFisher	K1391	Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
PrestoBlue cell viability reagent	ThermoFisher	A-13261
Trypan blue, 0.4% in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Also available at ThermoFisher
Corning 96-well black wall, clear-bottom plate	Corning	3603	Individually wrapped, sterile with lid
Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM	Sigma-Aldrich	WHA1820025
Microplate aluminum sealing film	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent	Waters	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Ascorbic acid	Fisher Scientific	A61-100	Also available at Sigma-Aldrich
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Molecular grade
Solvents (acetone, hexane, methanol)	Fisher Scientific		HPLC grade
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore.
Automated cell counter or hemocytometer	Various*		Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.
Class II biological safety cabinet	Various*
CO2 incubator	Various*
Cryogenic freezer	Various*		Liquid nitrogen storage dewar is recommended.
Fluorescence microplate-reader	Various*		The reader must have bottom read capabilities.
* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.