Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente<em&gt; In Vitro</em&gt; Transativação Bioensaios

Resumo

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Resumo

Em bioensaios de transactivação in vitro mostraram promissores como ferramentas de monitoramento de qualidade da água, no entanto a sua adopção e aplicação generalizada tem sido dificultada em parte devido à falta de métodos padronizados e disponibilidade de tecnologia robusta, fácil de usar. Neste estudo, as linhas celulares, prendeu-divisão comercialmente disponíveis foram utilizados para rastrear quantitativamente para a actividade endócrina de produtos químicos presentes em amostras de água de interesse para os profissionais de qualidade ambiental. Um protocolo único, padronizado, que incluiu garantia de qualidade / controlo de qualidade (QC / QA) controlos foi desenvolvido para actividade de estrogénio e Receptor de Glucocorticóides (ER e GR, respectivamente), utilizando um ensaio baseado em células de Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (TERF). Amostras de efluente tratado municipal de águas residuais e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia (EUA), foram extraídos utilizando extração em fase sólida e analisados ​​para a atividade endócrina usando o proto padronizadocol. Antecedentes e dose-resposta para as substâncias químicas de referência específicos do endpoint conheceu diretrizes QA / QC consideradas necessárias para a medição confiável. A resposta de rastreio de bioensaio para as amostras de água de superfície não foi detectável em grande parte. Em contraste, amostras de efluentes de estações de tratamento secundário teve a maior actividade mensurável, com concentrações equivalentes bioensaios estimado (BEQ) até 392 ng dexametasona / L para o GR e 17 ng 17β-estradiol / L para ER. O bioensaio de resposta para uma amostra de efluente terciário foi menor do que o medido para os efluentes secundários, indicando uma residual menor de produtos químicos activos endócrinos após o tratamento avançado. Este protocolo mostrou que em bioensaios de transactivação in vitro que utilizam comercialmente disponíveis, células preso por divisão "kits", pode ser adaptado para o rastreio de actividade endócrina em água.

Introdução

monitoramento da qualidade da água corrente baseia-se na capacidade de medir com precisão e precisamente a ocorrência de contaminantes químicos como um proxy para a exposição a animais selvagens e seres humanos. No entanto, esta monitorização química-by-químicas e paradigma de avaliação não pode manter o ritmo com o universo química em constante mudança que enfrentamos. À medida que aprendemos mais sobre o destino e os efeitos dos produtos químicos sintéticos e naturais, continuamos a procurar instrumentos de medição que tratem esperados impactos biológicos, e que ao mesmo tempo são imunes às mudanças na produção de químicos, uso e entrada ambiental. Tais ferramentas são especialmente relevantes para a compreensão se os produtos químicos desconhecidos ou novos, e produtos de transformação, merecem a nossa atenção. Além disso, misturas complexas de produtos químicos presentes na água são pouco abordado pela monitorização química individual. Assim, enfrentamos o desafio de modernizar a caixa de ferramentas de monitoramento existente para melhor enfrentar estas questões nas águas de superfície that receber a descarga de efluentes de esgoto tratado e do escoamento / águas pluviais urbanas.

Nos últimos anos, as técnicas bioanalíticos mostraram-se promissores como ferramentas de triagem para avaliação da qualidade da água. Em particular, os bioensaios, in'vitro que respondem a produtos químicos que actuam via conhecida, modos de acção específicos ^1,2 são de grande interesse para a comunidade de monitoramento ambiental ^3. Numerosas investigações têm empregado em bioensaios in vitro para quantificar a atividade endócrina de beber, de superfície e águas residuais ^{4 -6.} Além disso, uma série de bioensaios alvo eventos iniciadores moleculares (por exemplo, a activação do receptor), que pode, potencialmente, ser associados a efeitos deletérios através de via adverso resultado analisa ^7,8.

A evolução da bioscreening para a avaliação da qualidade da água foi relativamente rápida, com centenas de diferente em endpoints bioensaios in vitro tendo sido avaliados quanto à sua^9,10 utilidade. Atualmente, apenas um punhado de bioensaios foram mostrados para alcançar uma boa precisão da medição (em laboratórios), demonstrando a capacidade de diferenciar entre qualidades de água ^5,6. Para efluentes de esgoto tratado em particular, a ocorrência de estrogénios e esteróides glicocorticóides tem sido com sucesso contabilizado usando em ensaios de transactivação in vitro ^11,12. bioensaios No entanto, a maioria dos estudos até à data têm empregados cujas linhas celulares são proprietários (e, portanto, não estão amplamente disponíveis), requerem cuidados continuados e manipulação, ou ambos. Como resultado, a capacidade de padronizar protocolos, realizar exercícios de calibração inter-laboratoriais, e, finalmente, para transferir essa tecnologia de triagem para os recursos hídricos da Comunidade permanece prejudicada.

Pelo menos um fornecedor de bioensaios in vitro controlados através do programa US ToxCast está disponível comercialmente ¹³ em fácil de usar "de congelação e descongelação4; formatos. Estes "kits" de células-preso divisão foram mostrados para ser robusto para medir a actividade de produtos químicos extraído da água que representam diferentes níveis de tratamento ^14. Embora os protocolos do fornecedor estão disponíveis para pesquisar a bioactividade de produtos químicos individuais ou misturas, alguns deles necessitam de modificação antes de poderem ser aplicados a amostras de água. Efluente tratado de águas residuais ^15, escoamento de águas pluviais ^16, águas receptoras ^17,18 e, mais recentemente reciclado ^19,20 água são exemplos de meios aquosos que são de interesse para a comunidade de qualidade da água.

Este estudo apresenta um protocolo único, padronizado para medir a atividade endócrina em amostras de água usando comercialmente disponíveis, por divisão de presos em bioensaios de transactivação in vitro. Nós demonstramos robustez do protocolo através de uma avaliação abrangente de fundo, a dose de responsividade e repetibilidade da resposta para twO endpoints de particular estrogênio juros e glicocorticóides Receptor transativação (ER e GR, respectivamente). O protocolo foi aplicado em amostras de tela de efluentes de esgoto tratado e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia.

Protocolo

1. Recolha e da Amostra de Água de Processo (Modificado de Escher et al. ⁹⁾

1. Encha uma garrafa de vidro âmbar 1 L limpo contendo 1 g de azida de sódio e 50 mg de ácido ascórbico ao topo com amostra de água de interesse. amostra Armazenar a 4 ° C e processo dentro de 72 h.
   NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico e devem ser manuseados com cuidado. Use equipamento de proteção (para os olhos / rosto, luvas, roupas) e pesar em um fume-hood que funcione correctamente. Não use uma espátula de metal para pesagem.
2. Fazer passar a amostra através de um filtro de fibra de vidro de 1,6 uM e, em seguida, através de um cartucho de pré-condicionados Fase de extracção sólido (SPE) com um caudal de 5-10 ml / min. Ajustar a pressão da bomba de vácuo, para controlar a taxa de fluxo.
3. Vácuo secar o cartucho durante 15 min.
4. Elui-se o cartucho com 10 ml de metanol, seguido por 10 mL de acetona: hexano (1: 1, v / v).
5. Concentre-se eluído até ~ 1 ml sob uma corrente suave de azoto de elevada pureza. Solventetroca por adição de 500 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) e evaporar o extracto até à 500 ul.
6. Transfira o extrato para um frasco de amostrador automático de vidro âmbar. Armazenar a -20 ° C.

2. Preparar diluições do ensaio específico Chemical Referência e Extrato de Água

1. Preparar diluições 9 para a curva de calibração.
   1. Faça uma solução estoque do produto químico referência específica ensaio em DMSO a 100%. A concentração final deve ser de 2 uM 17β-estradiol ER para o ensaio, e 100 ^ M de dexametasona para o ensaio de GR. Armazenar as soluções de reserva a -20 ° C.
   2. Adicionar 15 ul de estoque a química de referência apropriado para 285 ul de meio de ensaio em um tubo estéril (tubo # 1). Misturar a amostra pipetando para cima e para baixo.
   3. Adicionar 200 ul de uma solução de 5% de DMSO em meio de ensaio em 8 tubos adicionais (tubos # 2-9).
   4. Transferir uma alíquota de 100 ul de tubo para tubo # 1 # 2 através de banheiraE # 9 para realizar uma série de diluições de 3 vezes. Cada amostra diluída deve ser misturado com uma pipeta antes de tomar uma alíquota e adicioná-lo para o próximo tubo.
2. Prepara-se uma amostra de controlo de solvente por mistura de 10 ul de DMSO em 190 ul de meio de ensaio.
3. Prepare quatro diluições para cada extracto de água.
   1. No primeiro tubo, adicionam-se 5 ul de extracto de água em 95 mL de meio de ensaio e misturar completamente. Adicionar 50 ul de 5% de DMSO em meio de ensaio em três outros tubos.
   2. Efectuar uma diluição de 2 vezes, transferindo 50 ul de solução a partir de um tubo para o outro.

3. Prepare a suspensão de células para conduzir a FRET Bioensaio

1. Prepara-se o meio específico de ensaio de acordo com as instruções do fabricante. O meio de ensaio devem ser armazenados a 4 ° C e aquecida até 37 ° C num banho de água antes da utilização.
2. Tome um frasco de células prendeu-divisão ER ou GR fora do livre criogênicozador e descongelar as células rapidamente, colocando o frasco num banho de água a 37 ° C durante 2 min com agitação suave. Descontaminar o frasco com 70% de etanol e colocá-lo em uma cabine de segurança biológica Classe II.
3. Abrir o frasco utilizando técnicas assépticas e transferência das células para 10 ml de meio de ensaio.
4. Centrifuga-se a 200 x g durante 5 min.
5. Aspirar o sobrenadante utilizando uma pipeta de vidro estéril e ressuspender o sedimento de células em 6 ml de meio de ensaio.
6. Misturar 5 ul de suspensão de células com 5 ul de uma solução de corante vital e adiciona-se uma alíquota para uma câmara de contagem.
7. Contar o número de células vivas utilizando um microscópio de luz ou contador de células automatizado e estimar a densidade de células vivas na suspensão de células. Dilui-se necessário para se obter uma densidade final de 550.000 células vivas por ml de meio de ensaio.

4. Células placa numa placa com 96 poços Black Wall Clear-fundo e adicione o extrato de água diluído

1. Criar uma placalayout que inclui uma curva de 9 pontos ensaio de calibração específica, as amostras de QA / QC e múltiplas diluições para cada extracto de água. Um exemplo de uma disposição da placa de 96 poços é mostrado na Figura 1.
2. Adicionar 90 ul de meio de ensaio para os poços de controlo isentos de células em duplicado.
3. Verter a suspensão de células em um reservatório de pipetagem estéril e adicionar 90 ul de suspensão de células para os outros poços utilizando uma pipeta multicanal.
4. Adicionam-se 10 ul das amostras diluídas preparada durante o passo 2 aos poços apropriados. A concentração final de DMSO por poço deverá ser de 0,5%, no máximo.
5. Cobrir a placa com uma tampa e coloca-se numa incubadora de _CO2 a 5% a 37 ° C durante 16 horas.

Figura 1:. Exemplo de uma disposição da placa de 96 poços A placa de multi-poços é concebido para incluir uma curva de calibração específica ensaio, 3 tiposde controles de QA / QC (mídia só, células em meio limpo e células em DMSO cravado média) e 4 diluições por extrato de água. Cada controle e diluição do extrato de água é analisada em poços em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Prepare o Loading Solution e adicione a cada poço

1. Após a incubação, permitem que a placa equilibrar à temperatura ambiente. Para este ensaio biológico FRET, os passos 5.2 através de 5.6 deve ser realizada na ausência de luz direta.
2. Prepara-se uma solução de 6x carregamento de acordo com as instruções do fabricante.
3. Adicionar 20 ul da solução de carregamento 6x a cada poço.
4. Adicionar 10 ul de reagente de viabilidade celular para cada poço, para avaliar a citotoxicidade do extracto aquoso diluído.
5. Selar a placa com película adesiva de alumínio.
6. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 2 h.

6. A citotoxicidade Medir e Endocrine Atividade Response

1. Configurar o leitor de microplacas com capacidade de leitura de baixo para seguir as instruções do fabricante.
2. Para a transativação bioensaio FRET, medir a fluorescência no azul (409/460 nm, excitação (Ex) / emissão (Em) comprimento de onda) e verde (409 Ex / 530 nm) o Em canais.
3. Para o ensaio de citotoxicidade, medir a fluorescência a 560 Ex / 590 Em nm.

7. Avaliar QA / QC verificações para determinar a qualidade dos dados

1. Compare a fluorescência em bruto médio da livre de células (media only) controles e as células-only (células em meio de ensaio limpo). O fundo de fluorescência só de meios de comunicação deve ser de pelo menos 25% menor do que a resposta de células de controlo apenas.
2. Processar os dados FRET-primas. Para ambos os "azuis" e conjuntos de dados "verdes", subtrair a fluorescência média dos poços de controlo sem células de toda célula que contém também. Calcula-se arácio azul / verde para cada poço experimental.
3. Compare rácio azul / verde de células-only e células com controles DMSO. valores de fluorescência destes controlos deve estar dentro de 15% desvio padrão relativo (RSD).
4. Traçar a curva de calibração específica ensaio como azul rácio / verde contra a concentração da amostra expresso como uma massa molecular (log M). Calcular a inclinação, R ² e EC ₅₀ (50% Concentração de efeito) log. Os parâmetros de calibração deve estar dentro do intervalo esperado listados na Tabela 1.
5. Calcular o RSD para todos os poços em triplicado. A variabilidade entre as repetições deve ser inferior a 20%.
6. Para os dados de citotoxicidade (560 Ex / Em 590 nm), subtrair a média de controlo isenta de células (isto é, meios de fundo) a partir de todas as cavidades contendo células.
7. Calcula-se a fluorescência média subtraído-fundo para cada amostra. Plotar os dados de fluorescência resultantes como uma percentagem do controlo DMSO. diluições de amostras não deveexibem mortalidade celular mais do que 20% em comparação com os controlos de células únicas e DMSO.

8. Análise de Dados

1. Calcular o limite de detecção do ensaio (LOD) como o mínimo de resposta de calibração mais dois desvios padrão da média do que a resposta.
2. Para amostras que apresentam uma resposta à dose, derivar o _EC50   o extracto de água utilizando a inclinação de uma regressão linear da curva de calibração entre 10 e 50% concentrações efeito dos químicos de referência.
3. Calcular a concentração bioanalíticos Equivalent (BEQ) utilizando a fórmula: BEQ = EC ₅₀ de química de referência / CE _{de 50} de amostra de água.

Resultados

No presente estudo, foram selecionadas amostras de 4x 24 hr compostas de efluentes de águas residuais municipais tratadas, 6 amostras de caçamba de águas de superfície de sistemas de água doce no sul da Califórnia e um campo em branco que consiste em água ultrapura para ilustrar este protocolo. 3 das amostras 4 de efluentes eram de plantas convencionais de tratamento de lamas activadas de águas residuais ( "efluente secundário"), e o quarto a partir de uma estação de...

Discussão

A potência bem documentado de estrogênios ambientais, tais como 17β-estradiol (E2), triagem mandados para esses produtos químicos em / L concentrações ng ^23,24. Neste estudo, a resposta ER para os efluentes de águas residuais (gama BEQ: 2,3-17 ng E2 / G) era um pouco mais elevada do que a relatada para o efluente secundário de ETAR Australiana ^20, ao passo que os BEQ para as águas superficiais (<0,5 a 4 ng E2 / G ) estavam dentro da faixa relatada para a superfície e águas pluviais em...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneBLAzer ER alpha DA assay kit	ThermoFisher	K1393	Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
GeneBLAzer GR DA assay kit	ThermoFisher	K1391	Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
PrestoBlue cell viability reagent	ThermoFisher	A-13261
Trypan blue, 0.4% in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Also available at ThermoFisher
Corning 96-well black wall, clear-bottom plate	Corning	3603	Individually wrapped, sterile with lid
Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM	Sigma-Aldrich	WHA1820025
Microplate aluminum sealing film	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent	Waters	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Ascorbic acid	Fisher Scientific	A61-100	Also available at Sigma-Aldrich
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Molecular grade
Solvents (acetone, hexane, methanol)	Fisher Scientific		HPLC grade
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore.
Automated cell counter or hemocytometer	Various*		Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.
Class II biological safety cabinet	Various*
CO2 incubator	Various*
Cryogenic freezer	Various*		Liquid nitrogen storage dewar is recommended.
Fluorescence microplate-reader	Various*		The reader must have bottom read capabilities.
* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.