Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan<em&gt; İn Vitro</em&gt; Transaktivasyon biyolojik tayinler

Özet

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Özet

In vitro trans biyoanalizlere Bununla birlikte onların benimsenmesi ve yaygın uygulama nedeniyle standart yöntem ve sağlam, kullanıcı dostu teknoloji kullanılabilirlik eksikliği kısmen engellemiştir edilmiştir, su kalitesi izleme araçları olarak söz göstermiştir. Bu çalışmada, piyasada mevcut, bölünme-tutuklandı hücre hatları kantitatif çevresel kalite uzmanları ilgilendiren su örneklerinde bulunan kimyasalların endokrin faaliyeti taranması için kullanılmıştır. Kapsamlı kalite güvence / kalite kontrol dahil tek, standart bir protokol (QA / QC) denetler hücre tabanlı Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) testi kullanılarak (sırasıyla, ER ve GR) Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör aktivitesi için geliştirilmiştir. Kaliforniya (ABD) tatlı su sistemlerinden tedavi belediye atık suyun ve yüzey suyunun numuneleri, katı faz ekstraksiyon kullanılarak çıkarılan ve standardize proto kullanarak endokrin aktivitesi için analiz edildiCol. Arka plan ve bitiş noktası özgü referans kimyasallar için doz-yanıt güvenilir ölçümü için gerekli gördüğü QA / QC kurallarına araya geldi. Yüzey su örnekleri için biyoassay tarama yanıtı büyük ölçüde saptanabilir değildi. Bunun aksine, ikincil arıtma tesisleri atık örnekleri ER 392 ng deksametazon GR / L ve 17 ng 17β-estradiyol / L'ye kadar, tahmini biyo-analizi eşdeğer konsantrasyonlarda (BEQs) ile en yüksek ölçülebilir aktiviteye sahiptir. bir tersiyer atık su örneği için biyolojik yanıtın, tedaviden sonra endokrin aktif kimyasalların daha düşük bir bakiye gösteren ikincil atık için ölçülen daha düşüktü. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilir kullanan nitro trans biyo-deneylerde, bölme durdurulmuş hücreli "setleri", su içinde endokrin aktivitesi için taranması için adapte edilebileceğini göstermiştir.

Giriş

Mevcut su kalitesi izleme doğru ve kesin yaban hayatı ve insanlar maruz kalma bir vekil olarak kimyasal kirleticilerin oluşumunu ölçmek için yeteneği esas alınmaktadır. Ancak, bu kimyasal-by-kimyasal izleme ve değerlendirme paradigma Karşı karşıya olduğumuz sürekli değişen kimyasal evren ayak uydurmak mümkün değil. Biz kader ve sentetik ve doğal kimyasalların etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek, biz biyolojik etkileri beklenen hitap eden ölçüm araçları aramaya devam, ve aynı zamanda bu kimyasal üretim, kullanım ve çevre girdi değişikliklere karşı bağışık bulunmaktadır. Bu tür araçlar bilinmeyen ya da yeni kimyasallar ve dönüşüm ürünleri, dikkatimizi hak edip anlamak için özellikle önemlidir. Ayrıca, suda mevcut kimyasallar kompleks karışımlar zayıf tek tek kimyasal izleme ile ele alınmaktadır. Böylece, daha iyi adrese yüzey suları tha bu sorunları mevcut izleme araç kutusunu modernizasyonu sorunuyla karşı karşıyat tedavi atiksuyun ve kentsel / yağmursuyu ikinci tur atılmasını alırsınız.

Son yıllarda, biyoanalitik teknikler su kalitesi değerlendirmesi için tarama araçları olarak söz göstermiştir. Bilinen yoluyla hareket eden kimyasallara tepki özellikle, in'vitro biyoanalizlere olarak, eylemin ^1,2 spesifik modları çevresel izleme topluma ³ büyük ilgi görmektedir. Sayısız araştırmalar içme, yüzey ve Atıksuların ^{4 -6} endokrin aktivitesini ölçmek için in vitro biyoanalizlere istihdam var. Ayrıca, biyo-deneylerde bir dizi molekül başlatma olaylar (örneğin, reseptör aktivasyonu), potansiyel olarak istenmeyen sonuç yolu ile zararlı etkileri ile bağlantılı olabilir ^7,8 analiz hedef alır.

Su kalitesi değerlendirmesi için bioscreening evrimi açısından değerlendirilmiştir edilerek in vitro biyoassay uç noktaları farklı yüzlerce nispeten hızlı olmuştur onlarınyarar ^9,10. Şu anda, Biyoanalizlerin sadece bir avuç su kaliteleri ^5,6 arasında ayrım yeteneği gösterirken (laboratuarlar içinde) iyi ölçüm hassasiyeti elde gösterilmiştir. Özellikle muamele edilmiş atık suyun, östrojenler ve glukokortikoid steroid oluşumu başarılı olmuştur nitro trans aktivasyon ^11,12 kullanarak oluşturmaktadır. kimin hücre hatları tescilli (ve dolayısıyla yaygın olarak kullanılabilir değil) Ancak bugüne kadar birçok çalışma istihdam var biyoassayler, sürekli bakım ve manipülasyon, ya da her ikisi gerektirir. Sonuç olarak, yetenek topluluk engellenmiş kalır su kaynaklarına bu tarama teknolojisini transfer etmek sonuçta, protokolleri standardize laboratuvarlar arası kalibrasyon egzersizleri, ve.

ABD ToxCast programı ile incelenen in vitro biyo-deneyler arasında en az bir teslimatçı "dondurma ve çözme, kullanımı kolay ¹³ ticari olarak temin edilebilir4; biçimleri. Bu takım durdurulmuş hücreli "setleri" tedavi ¹⁴ farklı seviyelerde ifade eden sudan ekstre kimyasal aktivitesinin ölçülmesi sağlam olması gösterilmiştir. satıcı protokolleri bireysel kimyasalların veya karışımların biyo ekrana mevcut olmasına rağmen onlar su numunelerinin uygulanabilir önce, bazıları değişiklik gerektirir. Arıtılmış atıksu çıkış ^15, yağmursuyu akış ^16, alıcı sular ^17,18 ve daha yakın dönüştürülmüş su ^19,20 su kalitesi, topluluğun ilgileneceği olan sulu ortam asal örnekleridir.

Bu çalışma, ticari olarak mevcut kullanarak su örneklerinde endokrin aktivitesini ölçmek için tek bir standart protokol sunar, bölünme-tutuklandı in vitro trans biyo-deneylerde. Biz tw için tepki arka doz cevap verebilen ve tekrarlanabilirlik kapsamlı bir değerlendirme ile protokol sağlamlığını gösterdiÖzellikle faiz Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör transaktivasyonunun (ER ve GR, sırasıyla) o bitiş noktaları. protokol Kaliforniya'da tatlı su sistemlerinden tedavi atiksuyun ve yüzey suyunun ekran örneklerine uygulanmıştır.

Protokol

1. Toplama ve Proses Suyu Numune (Escher ve ark Modifiye. ⁹⁾

1. Çevrede su numunesi ile en 1 g sodyum azid ve 50 mg askorbik asit ihtiva eden bir temizleme 1 L amber cam şişe doldurun. 72 saat sonra 4 ° C saklayınız numune ve proses.
   NOT: Sodyum azit çok zehirlidir ve dikkatle ele alınması gerekir. koruyucu giysiler (göz / yüz, eldiven, giysi) kullanın ve düzgün işleyen bir duman başlığı içinde tartın. tartmak için metal bir spatula kullanmayın.
2. 1.6 uM cam elyaf filtre ile ve daha sonra 5-10 ml / dakika bir akış hızında, bir ön şartlandırılmış Katı Faz Ekstraksiyon (SPE) kartuşundan örnek geçirin. akış hızını kontrol etmek için vakum pompasının basıncı ayarlayın.
3. Vakum, 15 dakika boyunca kartuş kurutun.
4. 10 ml aseton içindeki ardından 10 ml metanol, kartuşu Zehir: heksan (1: 1, hac / hac).
5. Yüksek saflıkta, hafif bir azot akımı altında yaklaşık 1 ml'ye elüat konsantre edilir. çözücüdimetilsülfoksid (DMSO) 500 ul ekleyerek ve aşağı 500 ul özü buharlaştırılması ile değişimi.
6. Bir amber cam bir numune alıcı viale aktarın özü. -20 ° C'de saklayın.

2. Deney Özgü Referans Kimya ve Su Özü dilüsyonları hazırlayın

1. Kalibrasyon eğrisi için 9 dilüsyonları hazırlayın.
   1. % 100 DMSO içinde deney özel bir referans kimyasal bir stok çözeltisi yapın. nihai konsantrasyon ER analizi için 2 uM 17β-estradiol ve GR analizi için 100 uM deksametazon olmalıdır. -20 ° C'de stok solüsyonları saklayın.
   2. steril bir tüp içinde deney ortamı 285 ul uygun referans kimyasal stokunun 15 ul ekleyin (tüp # 1). Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından örnek karıştırın.
   3. 8 ek borular (borular # 2-9) 'de deney ortamı içinde,% 5 DMSO içeren bir çözeltiye 200 ul ekle.
   4. küvet ile tüp # 2 tüp # 1 100 ul tablet aktarınE # 9, 3 katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirmek için. Her bir seyreltilmiş örnek bir tümbölen alınarak ve aşağıdaki borunun eklemeden önce bir pipet ile iyice karıştırılması gerekir.
2. deney ortamı 190 ul DMSO içerisinde 10 ul karıştırılmasıyla bir çözücü kontrol örneği hazırlayın.
3. Her su ekstraktı için dört dilüsyonları hazırlayın.
   1. birinci tüp içinde, deney ortamı 95 uL su özütü 5 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Diğer üç tüplerde deney ortamı içinde,% 5 DMSO, 50 ul ekle.
   2. sonraki bir tüpten çözeltisi 50 ul transfer ile 2 kat seyreltme gerçekleştirin.

3. FRET Biyoassay Davranış Hücre Süspansiyon Hazırlamak

1. üreticinin talimatlarına göre analiz, belirli bir ortam hazırlar. Deney ortamı, 4 ° C'de saklanır ve kullanılmadan önce bir su banyosunda 37 ° C'ye kadar ısıtılmalıdır.
2. kriyojenik serbest üzerinden ER veya GR bölünme-tutuklanan hücrelerin bir şişe alınzer yumuşak çalkalama ile 2 dakika süreyle 37 ° C su banyosu içinde flakon yerleştirerek hücrelerin hızlı bir şekilde eritin. % 70 etanol ile şişeyi arındırmak ve Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yerleştirin.
3. aseptik teknikler kullanılarak şişe açılır ve deney ortamında 10 ml hücre transfer edin.
4. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
5. steril bir cam pipet kullanılarak süpernatan aspire ve deney ortamında 6 ml hücre pelletini.
6. Bir canlı bir boya çözeltisi 5 ul hücre süspansiyonu 5 ul karıştırın ve bir sayma bölmesine bir kısım ilave edin.
7. ışık mikroskobu ya da otomatik hücre sayacı kullanılarak canlı hücre sayısını ve hücre süspansiyonu, canlı hücrelerin yoğunluğunu tahmin ediyoruz. Deney ortamı, ml başına 550.000 canlı hücreler bir son yoğunluk elde etmek gerektiğinde seyreltilir.

4. Plaka 96-kuyu Siyah Duvar Clear-alt Plate Hücreler ve seyreltilmiş Su Extract ekle

1. bir tabak oluşturunHer su ekstraktı için 9-nokta denemesi özel kalibrasyon eğrisi, QA / QC örnekleri ve çoklu dilüsyonları içeren düzen. 96 oyuklu bir plaka taslağına bir örnek, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
2. tekrarlanan hücresiz kontrol oyuklarına deney ortamı 90 ul ekle.
3. steril pipet haznesindeki hücre süspansiyonu dökün ve çok kanallı pipet kullanılarak kuyu hücre süspansiyonu 90 ul ekle.
4. Uygun oyuklara kademe 2 sırasında hazırlanan seyreltilmiş numunelerin 10 ul ekle. oyuk başına nihai DMSO konsantrasyonu% 0.5 düzeyinde olmalıdır.
5. Bir kapak plakası kapatılır ve 16 saat 37 ° C'de bir% 5 _CO2 inkübatöründe yerleştirin.

Şekil 1: a. 96 oyuklu plaka taslağına Örnek çok-yuvalı plaka bir deney, belirli bir kalibrasyon eğrisi, 3 tip içerecek şekilde tasarlanmıştırQA / QC kontrolleri ve su ekstraktı başına 4 dilüsyonları (medya sadece DMSO içinde temiz bir ortamda hücreler ve hücreler orta çivili). Her kontrol ve su ekstresinin seyreltme üçlü kuyular analiz edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5. Yükleme Çözüm hazırlayın ve her Şey ekle

1. İnkübasyondan sonra, plaka, oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Bu FRET Biyolojik deney için, 5.6 ile 5.2, doğrudan ışık olmadan yapılmalıdır yineleyin.
2. üreticinin talimatlarına göre bir 6x yükleme çözeltisi hazırlayın.
3. her bir kuyunun 6x yükleme solüsyonu 20 ul ekleyin.
4. seyreltilmiş, su Sitotoksisitenin değerlendirmek için her bir oyuğa Hücre canlılığı reaktifi 10 ul ekle.
5. alüminyum yapışkan film ile plaka mühür.
6. 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin.

6. ölçün Sitotoksisite ve Endokrin Etkinlik Tepki

1. Üreticinin talimatları izleyerek alt-okuma yetenekleri ile mikroplaka okuyucu ayarlayın.
2. FRET transaktivasyon Biyoassay, mavi floresan (409/460 nm, uyarma (Ex) / emisyon (Em) dalga boyu) ve yeşil (409 Ex / 530 Em nm) kanalları ölçün.
3. sitotoksisite deneyi için 560 Ex / 590 Em nm'de floresan ölçmek.

7. Veri Kalitesinin belirleme QA / QC Çekler değerlendirin

1. ve hücreler sadece (temiz analiz ortamında hücreleri) kontrol hücre içermeyen (sadece medya) ortalama ham floresan karşılaştırın. Ortam sadece arka plan flüoresan hücrelerin sadece kontrol cevabına kıyasla en az% 25 daha düşük olması gerekir.
2. Ham FRET veri işlemek. hem 'blue' ve 'yeşil' veri setleri için de içeren tüm hücreden hücre içermeyen kontrol çukurlarında ortalama floresan çıkarmak. hesaplamakHer deneysel kuyu için mavi / yeşil oranı.
3. DMSO kontrolleri ile sadece hücreler-ve hücrelerin mavi / yeşil oranını karşılaştırın. bu denetimlerin floresan değerleri% 15 Bağıl Standart Sapma (RSD) içinde olmalıdır.
4. bir günlük moleküler kütleye (M log) olarak ifade numune konsantrasyonuna karşı mavi / yeşil oranı olarak tahlil özel kalibrasyon eğrisi çizilir. Eğim, R ² hesaplayın ve EC ₅₀ (% 50 etki konsantrasyonu) oturum açın. Kalibrasyon parametreleri Tablo 1 'de listelenen beklenen aralıkta olmalıdır.
5. tüm üçlü kuyular için RSD hesaplayın. çoğaltır arasında değişkenlik% 20 daha az olmalıdır.
6. sitotoksisite verileri (560 EX / 590 Em nm), tüm hücre içeren kaynaklardan gelen hücre içermeyen kontrol ortalaması (örneğin, ortam geri plan) çıkarılır.
7. Her numune için ortalama arka plan çıkarılır floresan hesaplayın. DMSO kontrolü bir yüzdesi olarak ortaya çıkan floresan verilerini çizilir. Numune seyreltileri olmamalıhücreleri yalnızca DMSO kontrollere göre% 20'den fazla, hücre ölüm sergiler.

8. Veri Analizleri

1. Asgari kalibrasyon tepki artı yanıt ortalamanın iki standart sapma olarak Algılama (LOD) tahlil Sınırı hesaplayın.
2. Bir doz tepkisini gösteren örnekler için AK ₅₀ türetmek   Referans kimyasal 10 ve% 50 etki konsantrasyonları arasındaki kalibrasyon eğrisinin lineer regresyonunun eğim ile su ekstresi.
3. / EC sayılı su numunesi ₅₀ referans kimyasal BEQ = EC _50: formülü kullanarak Biyoanalitik Eşdeğer Konsantrasyon (BEQ) hesaplayın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, tedavi belediye atiksuyun 4x 24 saat kompozit numuneler, Güney Kaliforniya'da tatlı su sistemlerinden yüzey sularının 6 kapmak örnekleri ve ultra saf su içeren bir alan boş bu protokolü göstermek için seçildi. 4 atık örneklerinin 3 konvansiyonel aktif çamur atıksu arıtma tesislerinde ( "ikincil atık"), ve kum / karbon filtrasyon eklendi sonrası biyolojik arıtma ( "üçüncül atık") ile gelişmiş atık su arıtma tesisi dörd...

Tartışmalar

Bu 17β-estradiol (E2), ng / L konsantrasyonlarda ^23,24 de, bu maddeler için garanti tarama çevresel estrojenler iyi belgelenmiş gücü. Bu çalışmada, atık su Pis su ER tepkisi (BEQ aralığı: 2,3-17 ng E2 / L) E2 / L ng 4 0.5 20 ikincil atık bildirilen biraz daha yüksek oldu ) E2 ng 11 / L) ¹⁶ yerde yüzey ve yağmur suyu (<1 için rapor aralığında idi. yüzey suyu numunelerinde ölçülen ER a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneBLAzer ER alpha DA assay kit	ThermoFisher	K1393	Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
GeneBLAzer GR DA assay kit	ThermoFisher	K1391	Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
PrestoBlue cell viability reagent	ThermoFisher	A-13261
Trypan blue, 0.4% in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Also available at ThermoFisher
Corning 96-well black wall, clear-bottom plate	Corning	3603	Individually wrapped, sterile with lid
Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM	Sigma-Aldrich	WHA1820025
Microplate aluminum sealing film	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent	Waters	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Ascorbic acid	Fisher Scientific	A61-100	Also available at Sigma-Aldrich
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Molecular grade
Solvents (acetone, hexane, methanol)	Fisher Scientific		HPLC grade
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore.
Automated cell counter or hemocytometer	Various*		Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.
Class II biological safety cabinet	Various*
CO2 incubator	Various*
Cryogenic freezer	Various*		Liquid nitrogen storage dewar is recommended.
Fluorescence microplate-reader	Various*		The reader must have bottom read capabilities.
* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.