הערכת אולטראסאונד של זרימה על ידי מתווך התרחבות של הזרוע ועורקי ירך שטחיים אצל חולדות

Summary

הערכה לא פולשני של תפקוד האנדותל בבני אדם יכולה להיקבע על ידי טכניקת התרחבות בתיווך הזרימה. למרות אלפי מחקרים השתמשו בטכניקה זו, אף מחקר לא ביצע את הטכניקה הזאת הלא פולשני בחולדות. המאמר שלהלן מתאר מדידה לא פולשנית של התרחבות זרימה בתיווך של הזרוע ועורקי ירך שטחית של חולדות.

Abstract

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of endothelial function can be achieved by employing the flow-mediated dilation technique, typically performed in the brachial or superficial femoral artery. Briefly, a blood pressure cuff placed distal to an ultrasound probe is inflated to a suprasystolic pressure, which results in limb ischemia. After 5 min of occlusion the cuff is deflated, resulting in reactive hyperemia and increases in wall shear rate that signal vasodilatory molecules to be released from the endothelium eliciting vasodilation. Despite the thousands of studies performing flow-mediated dilation in humans, surprisingly, no studies have performed this technique non-invasively in living rats. Considering the recent shift in focus to translational research, the establishment of guidelines for non-invasive measurement of flow-mediated dilation in rats and other rodents would be extremely valuable. In the following article, a protocol is presented for the non-invasive measurement of flow-mediated dilation in brachial and superficial femoral arteries of rats, as those sites are most commonly measured in humans.

Introduction

האנדותל של כלי הדם הוא בשכבה הסלולר המרפדת את לומן של העורקים הוא וסת חשוב של תפקוד כלי הדם. יש מולקולות רבות שוחררו מבית האנדותל שתוצאתן אפנון של קוטר כלי דם. בין המולקולות האלה, תחמוצת חנקן (NO), נראה כי מולקולת vasodilatory העיקרית שוחררה מן האנדותל של כלי הדם בתגובה לגירוי (למשל, אינסולין, אצטילכולין, או שינויי מאמץ גזירה) ^1. בשנת האנדותל של כלי הדם, NO מיוצר על ידי האנזים אנדותל synthase NO (eNOS), והוא שוחרר לאחר מכן מתאי אנדותל ^2. NO מפזר על שריר חלק בכלי הדם שם הוא גורם כלי הרפיה וגדילה בקוטר ^3.

תפקוד האנדותל ניתן להעריך הלא פולשני בבני אדם באמצעות התרחבות בתיווך זרימת ^4,5 טכניקה (FMD). FMD הוצע לייצג מבדק פונקציונלי האנדותל הנגזרNO הזמינות הביולוגית אצל בני אדם, נבחנת בדרך כלל על הזרוע או עורק הירך שטחית בתגובה hyperemia תגובתי הבאה איבר ~ 5 דקות חסימה ^6. Hyperemia הריאקטיבי מגביר כוחות גזירה למינרית כי הם transduced אל תא האנדותל ^7, מאותת על שחרורו של NO ^8. אמנם בשנים האחרונות, חלקם של התרחבות ביוזמת אין לשחרר כבר התווכח ^9,10, FMD מעיד על התרחבות האנדותל תלוי הוכח באופן עקבי לחזות אירועים קרדיווסקולריים ^11-13.

נכון להיום, אלפי מחקרים מועסקים הטכניקה FMD למדידה לא פולשנית של תפקוד האנדותל אצל בני אדם. בהתחשב במשמרת האחרונה בפוקוס מחקר translational, הנחיות באשר לאופן מדיד לא פולשנית של FMD במכרסמים תהיינה יקרות מאוד. שמירה עם גישה translational, פרוטוקול זה הוקם למדידת FMD ב הזרוע ואת Supeעורקי ירך rficial של חולדות, כמו באתרים אלה ביותר נמדדים בדרך כלל אצל בני אדם. תוצאות פרוטוקול זה בתגובת FMD חזקה דיר בחולדות, לעומת זאת, מדידת FMD בחולדות הן תובענית מבחינה טכנית עלולה להיות קשה עבור חוקרים אחרים לשכפל בלי הפגנת וידאו. לכן, במאמר הבא ידגים שיטת למדידת לא פולשנית של FMD של הזרוע ועורקי ירך שטחית של חולדות.

Protocol

נהלי כל החיה תאמו את המדריך לטיפול והשימוש בחי המעבדה ¹⁴ ואושרו על ידי האוניברסיטה של יוטה בסולט לייק סיטי לענייני ותיקי מרכז רפואי בבעלי חיים לטיפול ושימוש.

1. הכנת בעלי חיים

1. מניחים חיה בתא הרדמה אינדוקציה המכיל 3% isoflurane ב 100% חמצן. להשאיר את החיה בחדר האינדוקציה עד שהוא מגיב לגירויים חיצוניים.
2. הסר את החיה מן חדר האינדוקציה ומניח אותו על שולחן בדיקה מחומם מצויד אלקטרודות רל (אק"ג). לשמור על הרדמה ב 3% isoflurane ב 100% חמצן. זרוע ושטחי ירך העורקת FMD לא ניתן לבצע בו זמנית. לפיכך, הוראות הכנות לכל מדידה מפורטות להלן.

2. הכנת עורק הזרוע

1. מקם את פרקדן החיה ולרסן הגפה השמאלית העליונה וכל גפיים תחתונים שלimal לשולחן בדיקה בעזרת פלסטר.
2. לרסן את האיבר הימני העליון של החיה, כך את החלק התחתון של הגפיים העליונים הוא מוגבה מעט (~ סנטימטר 0.2-0.5) מעל הרציף.
3. החל סוכן מקריח (למשל, Nair) על הגפה העליונה הימנית של בעלי החיים כדי להסיר שיער.
4. למקם השרוול חסימה (10 מ"מ לומן occluder וסקולרית תקן קוטר) על דיסטלי הגפה העליונה הזכות המרפק. אין להניח את occluder על הרציף, כמו אינפלציה / דפלציה תעביר את האיבר ומפריעה הדמית אולטרסאונד.
5. להגדיר את המכשיר אולטרסאונד במצב B באמצעות המקלדת אולטרסאונד.
6. למרוח כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד על הגפה העליונה של החיה, הפרוקסימלי שרוול החסימה.
7. ידני ליישר מתמר מערך ליניארי תדר אולטרה גבוה המצורפת לבעל stereotactic עם הגפה העליונה. עורק הזרוע צריך להיות גלוי 2-3 מ"מ עמוק.
8. כדי לאשר כי עורק הזרוע, לא וריד הזרוע, הוא להיותצילמו, לעבור למצב PW באמצעות המקלדת אולטרסאונד. העורק יהיה זרימת דם pulsatile בניגוד הווריד הסמוך אשר תהיה זרימת דם רציפה.

3. הכנת עורקים שטחי ירך

1. מקם את פרקדן החיה ולרסן את הגפיים העליונים ואת האיבר השמאלי תחתון אל שולחן הבדיקה בעזרת פלסטר.
2. לרסן את זכות גפיים תחתונים של החיה בעמדה מוגבהת (~ 0.5-1 סנטימטר) מעל הפלטפורמה באמצעות כרית (למשל, מגבות נייר מקופלות).
3. החל סוכן מקריח (למשל, Nair) על גפיים תחתונים של ימין החיה להסרת שיער. לאחר הסרת שיער וריד הירך צריך להיות בבירור על הירך הפנימית העליונה.
4. למקם השרוול חסימה (10 מ"מ לומן occluder וסקולרית סטנדרטי בקוטר) הפרוקסימלי הקרסול הימני. אין להניח את occluder על הרציף, כמו אינפלציה / דפלציה תעביר את הגפיים התחתונים ומפריעה הדמית אולטרסאונד.
5. להגדיר את מכשיר אולטרסאונדB-mode.
6. למרוח כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד על הגפיים התחתונים של החיה, הפרוקסימלי שרוול החסימה.
7. ידני ליישר מתמר מערך ליניארי תדר אולטרה גבוה המצורפת לבעל stereotactic עם וריד הירך, שהוא נראה לעין מבעד לציפוי. עורק הירך השטחי צריך להיות גלוי <1 מ"מ עמוק.
8. כדי לאשר כי עורק הירך השטחי, לא וריד הירך, מתבצע הדמיה, לעבור למצב PW. העורק יהיה זרימת דם pulsatile בניגוד הווריד הסמוך אשר תהיה זרימת דם רציפה.

4. שלב Baseline

1. למטב את התמונה B-mode, בדומה לאופן בו הדבר ייעשה בבני אדם ^15. ודא תמונה אופקית, אורך של הכלי עם תקשורת-אינטימה דמיינה בשני הכתלים הוא ציין. מטב את התמונה על ידי התאמת מיקום בדיקת אולטרסאונד מעט על מנת להבטיח כי כמו הרבה של העורק ככל האפשר ניתן לצפייה בחלון ללכוד.
   1. לחלופין, לשנות את גדרות אולטרסאונד כדי לקבל תמונה טובה יותר על ידי שינוי בהירות / ניגודיות, אזורי מוקדים, תדירות, טווח דינמי, וצפיפות קו. ישנן דרכים אחרות כדי למטב את תמונת אולטרסאונד, אך תיאור מפורט של אלה הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
2. אחרי אופטימיזציה של דימויים עורקים, להדליק-gating א.ק.ג. להציג תמונות בלבד שנתפסו במשך-גל R כדי להבטיח שרק מסגרת בקוטר אחד נאספת הם במהלך כל מנה הדיאסטולי של מחזור לב.
   הערה: א.ק.ג.-gating נגיש מכונת אולטרסאונד להשתמש בפרוטוקול זה על ידי בחירת א.ק.ג.-gating תחת אפשרות הגדרות הפיזיולוגיות, עם זאת, ייתכן שתכונה זו לא תהיה זמינה בכל מכונות אולטרסאונד. א.ק.ג.-gating צריך להיות מופעל לאחר התמונה ממוטבת, כמו שקשה להשיג תמונת מסגרת חליפין נמוכים (כלומר, פעם אחת לכל-גל R). ללא א.ק.ג.-gating, השילוב של קצב לב גבוה אצל חולדות דרישה של מסגרת גבוההשיעור ללכוד את החלק הדיאסטולי של מחזור הלב מאפשר רק עבור ~ 10-20 קליפים שניים. גודל מסורבל כמות הנתונים בכל קליפ מגביר את העומס ניתוח משמעותי.
3. שיא 60 שניות על בסיס נתוני שימוש במצב B.
   הערה: מכשיר אולטרסאונד תמיד מקליט, לעומת זאת, לא כל התמונות מאוחסנות על מכונת אולטרסאונד, כפי שיש מגבלה על מספר המסגרות שניתן נרשמת קליפ אולטרסאונד. אורך קליפ (כלומר, מספר המסגרות) ניתן לכוונן את ההגדרות. זה מוצע לקבוע עבור מספר מרבי של פריימים קליפ. כאשר ההקלטה תהיה בסוף קליפ (כלומר, מספר מרבי של מסגרות הגיע), ההקלטה נמשכת, אבל הקליפ גלגולים קדימה לכיד המסגרות האחרונה. במקרה זה, מוקדם יותר מסגרות כי נתפסו מחוץ לגבול מסגרת מקסימלית נמחקות לאחר מכן. בעוד המורכבויות הללו בהקלטה שונה בין מכונות, התאמת אורך הקלטה עשויה להיות נחוצה.
4. Swiטצ אל מצב PW. מניחים את הסמן באמצע לומן. שערים לדוגמא תוצבנה באופן אוטומטי בהתייחס הסמן, אך ניתן להתאימו עבור רוחב בעזרת מקלדת אולטרסאונד. לשמור בזווית insonation של ≤60 °.
   1. התאם את זווית insonation על ידי שינוי זווית קורה דופלר. לבצע התאמות בסדר לזווית באמצעות מקלדת אולטרסאונד. אם אפשרויות אלו אינן מספקות זווית מתאימה למדידה, באופן ידני להתאים הבדיקה אולטרסאונד על ידי הטיית העורק לזווית אופטימלית יותר. אם התאמה כלשהי של זווית אולטרסאונד מבוצע, לשחזר תמונות B-mode.
5. שיא של 10 שניות של נתונים מהירים.

5. ספיגת שלב

1. לנפח את occluder וסקולרית באמצעות מזרק אוויר מלא 10 מ"ל. כדי לשמור קבוע בלחץ האוויר occluder וסקולרית, לקפל את הצינור על עצמו ולמקם קליפ קלסר על צינור מקופל.
2. Switch to-mode PW לאשר חסימת שרוול, כפי שמעידירידה גדולה מהיר דם.
3. Switch to נתוני B-mode ולהקליט 60 קליפים שניים, עד 04:45 דק 'של חסימה.
4. Switch to-mode PW. לשמור תיעוד של קצב הלב ואת הזמן של כל קליפ אולטרסאונד לניתוח.

6. Hyperemic שלב

1. שחרר את השרוול בעת ההקלטה ב-מצב PW ידי הסרת קליפ קלסר מהצינור מקופל. שיא 5 שניות לפני ו -5 שניות לאחר שחרור השרוול.
2. Switch to נתוני B-mode ולהקליט 60 קליפים שניים עד 3 דקות לאחר חסימה. לשמור תיעוד של קצב הלב ואת הזמן של כל קליפ אולטרסאונד לניתוח.
3. לאחר השלמת FMD ולהסיר את החיה מהשולחן בדיקה וניטור עד שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.

ניתוח 7.

1. לניתוח, אולטרסאונד יצוא כקובצי DICOM אל המחשב מחובר המצוידים בתוכנת קצה-זיהוי, המאפשר משוחדת להרתיעmination בקוטר העורק בכל מסגרת. ניתוח אפשרי על מכונת אולטרסאונד, לעומת זאת, זה לא מומלץ, כפי שהוא מאוד זמן אינטנסיבי ובכפוף ההטיה חוקרת.
2. ניתוח נתונים בקוטר עורק ב -60 מקטעים שניים בשלב מחקר ולאחר חסימה, ובשנת 10 קטעים שניים בשלב hyperemic.
3. ניתוח נתונים מהירים דם באמצעות יכולות ניתוח תזרים של תוכנת קצה-זיהוי האוטומטי. לקבוע מהירויות דם ממוצעות ידי מדידת 5 או יותר גל רצוף של מראה אחיד במהלך שלבי מחקר ולאחר חסימה. לקבוע מהירויות דם ממוצעות במהלך hyperemia תגובתי עבור מהירויות דם מייד לאחר שחרור שרוול. צורת הגל עם מהירויות דם גבוהות נחשבת מהיר דם שיא.

תוצאות

תזרים בתיווך ההתרחבות בוצעה על הזרוע ועצם ירך שטחי של 8 חולדות Wistar. מיצוב של עכברוש מוצג באיור 1.

תמונות אולטרסאונד נציג של עורק הירך השטחי מוצגות באיור 2.

Discussion

במחקר הנוכחי, מדידה לא פולשנית של FMD הייתה הפגינו הזרוע ועורקי ירך שטחיים של חולדות. בדומה לבני אדם ^6, לאחר תקופת חסימה 5 דקות, חלה עלייה מהירה מהיר דם (כלומר, hyperemia תגובתי) ובכך להגדיל שיעור גזירה על דפנות העורקים אשר הביאו ההתרחבות הבאה של העורק. FMD נצפתה הוא הזרוע ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Vevo Imaging Station	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Thermasonic gel warmer	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	82-03	Optional
Signacreme electrode cream	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	17-05
Transpore surgical tape	3M, Maplewood, MN, USA	1527-1
Depilatory cream (e.g., Nair)	General supply
Cotton swabs	General supply
Ultrasound gel	General supply
Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	62-0115
10 ml syringe with Luer-Lok tip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Paperclip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Hypodermic needle – 18 gauge	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Medium binder clip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus