Ultraschall Beurteilung der Fluss Mediated Dilation des Brachial und Oberflächliche Femoralarterie in Ratten

Zusammenfassung

Nicht-invasive Beurteilung der Endothelfunktion bei Menschen kann durch die Strömung-vermittelte Dilatation Technik bestimmt werden. Obwohl Tausende von Studien, die diese Technik verwendet haben, hat keine Studie, die diese Technik nicht-invasiv in Ratten durchgeführt. Der folgende Artikel beschreibt nicht-invasive Messung von Durchfluss-vermittelten Dilatation in brachialis und oberflächlichen Oberschenkelarterien von Ratten.

Zusammenfassung

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of endothelial function can be achieved by employing the flow-mediated dilation technique, typically performed in the brachial or superficial femoral artery. Briefly, a blood pressure cuff placed distal to an ultrasound probe is inflated to a suprasystolic pressure, which results in limb ischemia. After 5 min of occlusion the cuff is deflated, resulting in reactive hyperemia and increases in wall shear rate that signal vasodilatory molecules to be released from the endothelium eliciting vasodilation. Despite the thousands of studies performing flow-mediated dilation in humans, surprisingly, no studies have performed this technique non-invasively in living rats. Considering the recent shift in focus to translational research, the establishment of guidelines for non-invasive measurement of flow-mediated dilation in rats and other rodents would be extremely valuable. In the following article, a protocol is presented for the non-invasive measurement of flow-mediated dilation in brachial and superficial femoral arteries of rats, as those sites are most commonly measured in humans.

Einleitung

Das vaskuläre Endothel ist eine zelluläre Monoschicht, die Linien, die das Lumen der Arterien und ist ein wichtiger Regulator der Gefäßfunktion. Es gibt zahlreiche Moleküle aus dem Endothel freigesetzt, die in der Modulation von Blutgefäßdurchmesser zur Folge haben. Unter diesen Molekülen wird Stickstoffmonoxid (NO), das primäre vasodilatatorische Molekül aus dem vaskulären Endothel in Antwort auf die Stimulation (zB Insulin, Acetylcholin oder Änderungen der Scherspannung) freigegeben zu ¹ liegen . Im vaskulären Endothel, wird NO durch das Enzym endothelialen NO - Synthase (eNOS) hergestellt und wird anschließend von Endothelzellen ² freigesetzt. NO diffundiert zum glatten Gefäßmuskulatur , wo es Entspannung und erhöhte Gefäßdurchmesser ³ bewirkt.

Endotheliale Dysfunktion kann mit dem flussvermittelte Dilatation (FMD) Technik ^4,5 beim Menschen untersucht nicht-invasiv werden. MKS ist eine funktionelle Bioassay für darzustellen vorgeschlagen Endothel-derivedNO Bioverfügbarkeit bei Menschen und wird typischerweise bei brachialis oder A. femoralis superficialis in Reaktion auf reaktive Hyperämie nach einer ~ 5 min Extremität Okklusion ⁶ beurteilt. Reaktive Hyperämie erhöht Kräfte laminaren Scher , die ⁷ an die Endothelzellen transduziert, die Signalgebung zu einer Freisetzung von NO ^8. Obwohl in den letzten Jahren ist ^9,10 der Anteil der Vasodilatation durch NO - Freisetzung eingeleitet diskutiert wurde, ist indikativ für FMD endothelabhängige Dilatation und konsequent wurde ^11-13 kardiovaskulärer Ereignisse vorherzusagen gezeigt.

Bis heute haben Tausende von Studien, die die MKS-Technik zur nicht-invasiven Messung der Endothelfunktion beim Menschen eingesetzt. In Anbetracht der jüngsten Verschiebung des Fokus auf translationale Forschung, Richtlinien für die nicht-invasive Messung von Maul- und Klauenseuche bei Nagern wäre äußerst wertvoll sein. Schritt halten mit einem translationalen Ansatz wurde dieses Protokoll für die Messung der Maul- und Klauenseuche in brachial und Supe etabliertrficial Oberschenkelarterien von Ratten, wie diese Websites werden am häufigsten bei Menschen gemessen. Dieses Protokoll führt zu einer robusten und reproduzierbaren MKS Reaktion bei Ratten, aber die Messung der Maul- und Klauenseuche in Ratten ist technisch anspruchsvoll und schwierig sein kann für andere Forscher ohne Video-Demonstration zu replizieren. Daher wird der folgende Artikel ist ein Verfahren zur nicht-invasiven Messung von FMD in brachialis und oberflächliche Oberschenkelarterien von Ratten zeigen.

Protokoll

Alle Tierverfahren entsprach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren ¹⁴ und wurden von der University of Utah und Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Animal Care und Verwenden genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Platzieren Tier in Narkose Induktionskammer, die 3% Isofluran in 100% Sauerstoff. Lassen Sie das Tier in der Induktionskammer, bis er nicht mehr reagiert auf äußere Reize ist.
2. Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer und legen Sie es auf einem beheizten Untersuchungstisch ausgestattet mit Elektrokardiogramm (EKG) Elektroden. Aufrechterhaltung der Anästhesie bei 3% Isofluran in 100% Sauerstoff. Brachialis und oberflächliche FMD Femoralarterie können nicht gleichzeitig durchgeführt werden. Daher Herstellungsvorschrift für jede Messung sind unten aufgeführt.

2. Arteria brachialis Vorbereitung

1. Positionieren Sie das Tier in Rückenlage und zurückhalten der linken oberen Extremität und jede untere Schenkel des einimal auf dem Untersuchungstisch mit chirurgischen Band.
2. Begrenze die rechte obere Extremität des Tieres, so daß der untere Abschnitt der oberen Extremität leicht erhöht wird (~ 0,2-0,5 cm) über der Plattform.
3. Bewerben Enthaarungsmittel (zB Nair) an den rechten oberen Extremität des Tieres Haare zu entfernen.
4. Positionieren Sie eine Okklusion Manschette (10 mm Lumendurchmesser Standard Gefäß Okkluder) auf der rechten oberen Extremität distal des Ellenbogens. Sie nicht den Okkluder auf der Plattform ruhen, da die Inflation / Deflation wird das Bein bewegen und Ultraschallbilder stören.
5. Stellen Sie die Ultraschallgerät auf B-Modus, um die Ultraschall-Tastatur.
6. Eine kleine Menge von Ultraschallgel auf der oberen Extremität des Tieres, proximal zur Okklusion Manschette.
7. eine Ultrahochfrequenz-linearen Array-Wandler zu einem stereotaktischen Halter mit der oberen Extremität befestigt manuell auszurichten. Die Arteria brachialis sollte 2-3 mm tief sichtbar sein.
8. Um zu bestätigen, dass die Arteria brachialis, nicht die Armvene, wirdabgebildet wird, wechseln Sie in PW-Modus, um die Ultraschall-Tastatur. Die Arterie wird pulsierender Blutfluss haben, wie zum benachbarten Vene gegen die kontinuierliche Blutfluss haben.

3. A. femoralis superficialis Vorbereitung

1. Positionieren Sie das Tier in Rückenlage und zurückhalten, die oberen Extremitäten und der linken unteren Extremität auf dem Untersuchungstisch mit chirurgischen Band.
2. Begrenze die rechte untere Extremität des Tieres in eine erhöhte Position (~ 0,5-1 cm) über der Plattform ein Pad (zB gefaltete Papiertücher).
3. Bewerben Enthaarungsmittel (zB Nair) nach rechts des Tieres unteren Extremitäten Haare zu entfernen. Nach der Haarentfernung sollte die Oberschenkelvene an der oberen Innenseite des Oberschenkels deutlich sichtbar sein.
4. Positionieren Sie eine Okklusion Manschette (10 mm Lumendurchmesser Standard Gefäß Okkluder) proximal der rechten Knöchel. Sie nicht den Okkluder auf der Plattform ruhen, da die Inflation / Deflation die unteren Extremitäten und stören Ultraschallbilder zu bewegen.
5. Stellen Sie die Ultraschall-Maschine zuB-Modus.
6. Eine kleine Menge von Ultraschall-Gel auf die unteren Extremitäten des Tieres, proximal zur Okklusion Manschette.
7. Manuell auszurichten, eine Ultrahochfrequenz-linearen Array-Wandler zu einem stereotaktischen Halter mit der Femoralvene befestigt, die durch die Haut sichtbar. Die Arteria femoralis superficialis sollte sichtbar <1 mm tief sein.
8. Um zu bestätigen, dass die Arteria femoralis superficialis, nicht die Oberschenkelvene, abgebildet wird, wechseln Sie in PW-Modus. Die Arterie wird pulsierender Blutfluss haben, wie zum benachbarten Vene gegen die kontinuierliche Blutfluss haben.

4. Basis Phase

1. Optimieren Sie die B-Modus - Bild, ähnlich wie wäre es beim Menschen ¹⁵ durchgeführt werden. Sicherzustellen, dass eine horizontale, longitudinale Bild des Gefäßes mit intima-media in beiden Wänden visualisiert wird beobachtet. das Bild optimieren, indem sie leicht die Ultraschallsonde Platzierung Einstellung, dass so viel von der Arterie wie möglich zu gewährleisten, ist im Aufnahmefenster angezeigt werden.
   1. Alternativ Ultraschall-Einstellungen anpassen, indem die Helligkeit / Kontrast, Fokuszonen, Frequenz, Dynamikbereich und Liniendichte ein besseres Bild zu erhalten. Es gibt andere Möglichkeiten, um das Ultraschallbild, aber detaillierte Beschreibung davon sind über den Rahmen dieses Protokolls zu optimieren.
2. Nach der Optimierung der Arterie Bilder, schalten Sie EKG-Gating nur Bilder während der R-Welle erfasst anzuzeigen, um sicherzustellen, dass nur ein Durchmesser Rahmen gesammelt wird bei jedem diastolischen Abschnitt eines Herzzyklus sind.
   HINWEIS: EKG-Gating auf dem Ultraschallgerät in diesem Protokoll durch die Auswahl EKG-Gating unter physiologischen Einstellungen Option, jedoch verwendet verfügbar ist, kann nicht diese Funktion auf alle Ultraschallgeräte zur Verfügung stehen. EKG-Gating sollte eingeschaltet werden, nachdem das Bild optimiert ist, da es schwierig ist, ein Bild mit niedriger Bildrate (dh einmal pro R-Welle) zu erhalten. Ohne EKG-Gating, die Kombination einer hohen Herzfrequenz an Ratten und Erfordernis einer hohen BildRate der diastolische Teil des Herzzyklus zu erfassen nur für ~ 10-20 Sekunden-Clips ermöglicht. Die umständliche Größe und Menge der Daten in jedem Clip erhöht wesentlich die Analyse Last.
3. Nehmen Sie 60 Sekunden Basisdaten B-Modus.
   HINWEIS: Die Ultraschallgerät immer aufnimmt, jedoch nicht alle Bilder auf dem Ultraschallgerät gespeichert werden, da es eine Grenze für die Anzahl von Rahmen ist, die in einem Ultraschall-Clip aufgezeichnet werden kann. Die Cliplänge (dh die Anzahl der Frames) kann in den Einstellungen angepasst werden. Es wird vorgeschlagen, für die maximale Anzahl der Bilder pro Clip zu setzen. Wenn die Aufnahme am Ende eines Clips (dh erreichte maximale Anzahl der Bilder), die Aufnahme wird fortgesetzt, aber der Clip vorwärts rollt die neuesten Bilder zu erfassen. In diesem Fall früheren Frames, die außerhalb des maximalen Rahmengrenze eingefangen wurden, werden anschließend gelöscht. Während diese Feinheiten bei der Aufzeichnung zwischen den Maschinen unterscheiden, die Anpassung der Aufnahmelänge erforderlich sein.
4. Switch zu PW-Modus. Setzen Sie den Cursor in der Mitte des Lumens. Beispiel Gattern werden automatisch in Bezug auf den Cursor gesetzt, kann aber für die Breite eingestellt werden unter Verwendung der Ultraschall-Tastatur. Pflegen Sie eine Insonation Winkel von ≤60 °.
   1. Stellen Sie den Insonation Winkel durch den Doppler-Strahlwinkel zu verändern. Machen Sie Feineinstellungen der Winkel, der durch die Ultraschall-Tastatur. Wenn keines von beiden einen Winkel für die Messung geeignet bieten eine manuelle Einstellung der Ultraschallsonde durch die Arterie zu einem optimalen Winkel kippen. Erfolgt eine Anpassung des Ultraschallwinkel durchgeführt wird, B-Modus-Bilder einzufangen.
5. Nehmen Sie 10 Sekunden der Geschwindigkeitsdaten.

5. Okklusionsphase

1. Pumpen Sie den Gefäß Okkluder einen luftgefüllten 10 ml Spritze. Um den Luftdruck konstant im Gefäß Okkluder halten, klappen Sie den Schlauch auf sich selbst und setzen Sie einen Binder Clip auf der gefalteten Röhre.
2. Wechseln Sie in den PW-Modus Manschette Okklusion, um zu bestätigen, wie durcheine große Verringerung der Blutgeschwindigkeit.
3. Wechseln Sie in den B-Modus und Aufzeichnungsdaten in 60-Sekunden-Clips, bis 04.45 min Okklusion.
4. Wechseln Sie in den PW-Modus. Halten Sie eine Aufzeichnung der Herzfrequenz und die Zeit jeder Ultraschall-Clip für die Analyse.

6. hyperamisch Phase

1. Lassen Sie die Manschette während der Aufnahme im PW-Modus mit der Binder-Clip aus dem gefalteten Rohr zu entfernen. Satz 5 Sekunden vor und 5 Sekunden nach der Manschette Release.
2. Wechseln Sie in den B-Modus und Aufzeichnungsdaten in 60-Sekunden-Clips bis 3 Minuten nach Okklusion. Halten Sie eine Aufzeichnung der Herzfrequenz und die Zeit jeder Ultraschall-Clip für die Analyse.
3. Nach Abschluss der Maul- und Klauenseuche, das Tier aus dem Untersuchungstisch zu entfernen und zu überwachen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat.

7. Analyse

1. Zur Analyse Export Ultraschall als DICOM-Dateien in einen Offline-Computer mit Kantenerkennungssoftware ausgestattet, die für die unvoreingenommene ermöglicht abzuschreckenDigen Arterie Durchmesser bei jedem Rahmen. Die Analyse ist möglich, auf dem Ultraschallgerät, es jedoch nicht zu empfehlen, da es sehr zeitintensiv und unterliegen Ermittler Bias ist.
2. Analysieren Arterie Durchmesser Daten in 60 zweiten Segmente während der Baseline und Okklusionsphase und in 10 zweiten Segmente während der hyperamisch Phase.
3. Analysieren Blutgeschwindigkeitsdaten, die Strömungsanalysefunktionen des automatisierten Kantenerkennungssoftware. Bestimmen durchschnittliche Blutgeschwindigkeit durch Messung 5 oder mehr aufeinanderfolgende Wellenformen einheitliches Erscheinungsbild während der Baseline und Okklusion Phasen. Bestimmen durchschnittliche Blutgeschwindigkeit während des reaktiven Hyperämie für Blutgeschwindigkeiten unmittelbar nach Manschette Release. Die Wellenform mit dem höchsten Blutgeschwindigkeit wird Spitzenblutgeschwindigkeit berücksichtigt.

Ergebnisse

Flussvermittelte Dilatation wurde auf der brachial durchgeführt und A. femoralis superficialis von 8 Wistar-Ratten. Positionierung einer Ratte wird in Abbildung 1 dargestellt.

Representative Ultraschallbilder der Arteria femoralis superficialis sind in Abbildung 2 dargestellt.

Diskussion

In der vorliegenden Studie wurde eine nicht-invasive Messung von Maul- und Klauenseuche in der brachialen und oberflächlichen Oberschenkelarterien von Ratten nachgewiesen. Ähnlich wie beim Menschen ⁶ nach einer 5 min Okklusion Periode gab es eine rasche Zunahme der Blutgeschwindigkeit (dh reaktive Hyperämie) , wodurch Scherrate an der Arterienwand erhöht wird, was in der nachfolgenden Vasodilatation der Arterie geführt. FMD wurde sowohl in der brachialen und oberflächlichen Oberschenkelarterien beobacht...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Vevo Imaging Station	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Thermasonic gel warmer	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	82-03	Optional
Signacreme electrode cream	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	17-05
Transpore surgical tape	3M, Maplewood, MN, USA	1527-1
Depilatory cream (e.g., Nair)	General supply
Cotton swabs	General supply
Ultrasound gel	General supply
Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	62-0115
10 ml syringe with Luer-Lok tip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Paperclip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Hypodermic needle – 18 gauge	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Medium binder clip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus