Évaluation échographique des Flow-Mediated Dilatation du brachial et les artères fémorales superficielles chez les rats

Résumé

l'évaluation non invasive de la fonction endothéliale chez l'homme peut être déterminée par la technique de dilatation médiée par le flux. Bien que des milliers d'études ont utilisé cette technique, aucune étude n'a effectué cette technique non invasive chez les rats. L'article décrit la mesure non invasive de la dilatation médiée par le flux dans l'artère brachiale et les artères fémorales superficielles des rats.

Résumé

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of endothelial function can be achieved by employing the flow-mediated dilation technique, typically performed in the brachial or superficial femoral artery. Briefly, a blood pressure cuff placed distal to an ultrasound probe is inflated to a suprasystolic pressure, which results in limb ischemia. After 5 min of occlusion the cuff is deflated, resulting in reactive hyperemia and increases in wall shear rate that signal vasodilatory molecules to be released from the endothelium eliciting vasodilation. Despite the thousands of studies performing flow-mediated dilation in humans, surprisingly, no studies have performed this technique non-invasively in living rats. Considering the recent shift in focus to translational research, the establishment of guidelines for non-invasive measurement of flow-mediated dilation in rats and other rodents would be extremely valuable. In the following article, a protocol is presented for the non-invasive measurement of flow-mediated dilation in brachial and superficial femoral arteries of rats, as those sites are most commonly measured in humans.

Introduction

L'endothélium vasculaire est une monocouche cellulaire qui tapisse la lumière des artères et est un régulateur important de la fonction vasculaire. Il existe de nombreuses molécules libérées par l'endothélium qui se traduisent par une modulation du diamètre du vaisseau sanguin. Parmi ces molécules, l' oxyde nitrique (NO), semble être la molécule vasodilatatrice primaire libéré par l'endothélium vasculaire en réponse à une stimulation (par exemple, l' insuline, l' acétylcholine, ou des variations de la contrainte de cisaillement) ^1. Dans l'endothélium vasculaire, le NO est produit par l'enzyme NO synthase endothéliale (eNOS) et est ensuite libéré par les cellules endothéliales ^2. NO diffuse vers le muscle lisse vasculaire où elle provoque la relaxation et l' augmentation de vaisseau de diamètre ^3.

La dysfonction endothéliale peut être évaluée de manière non invasive chez l' homme à l' aide de la dilatation médiée par le flux (FMD) technique ^4,5. La fièvre aphteuse a été proposé pour représenter un essai biologique fonctionnel pour endothélium-dérivéNO biodisponibilité chez l' homme, et est généralement évaluée au brachial ou de l' artère fémorale superficielle en réponse à hyperémie réactive suite à une ~ 5 min branche occlusion ^6. Hyperémie réactive augmente les forces laminaire de cisaillement qui sont transduits à la cellule endothéliale ^7, signalant une libération de NO ^8. Bien que ces dernières années, la proportion de vasodilatation initiée par la libération de NO a été débattue ^9,10, la fièvre aphteuse est une indication de la dilatation endothélium-dépendante et a été montré constamment de prédire les événements cardiovasculaires ^11-13.

A ce jour, des milliers d'études ont utilisé la technique de la fièvre aphteuse pour la mesure non invasive de la fonction endothéliale chez l'homme. Compte tenu de l'évolution récente de mise au point sur la recherche translationnelle, des lignes directrices pour la mesure non invasive de la fièvre aphteuse chez les rongeurs seraient extrêmement précieux. Garder une approche translationnelle, ce protocole a été établi pour la mesure de la fièvre aphteuse en brachial et supeartères fémorales rficial des rats, que ces sites sont le plus souvent mesurés chez les humains. Ce protocole se traduit par une réponse robuste et reproductible de la fièvre aphteuse chez les rats, cependant, la mesure de la fièvre aphteuse chez les rats est techniquement exigeant et peut être difficile pour d'autres chercheurs de reproduire sans vidéo de démonstration. Par conséquent, l'article suivant démontrera une méthode pour la mesure non-invasive de la fièvre aphteuse dans le brachial et les artères fémorales superficielles des rats.

Protocole

Toutes les procédures d'animaux conformes au Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire ¹⁴ et ont été approuvés par l'Université de l' Utah et de Salt Lake City Anciens Combattants Medical Center Animal Care et utilisation.

1. Préparation d'un animal

1. Placez l'animal dans la chambre d'induction d'anesthésie contenant 3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène. Laisser l'animal dans la chambre d'aspiration jusqu'à ce qu'il soit insensible à des stimuli externes.
2. Retirer l'animal de la chambre d'induction et le placer sur une table d'examen chauffée équipée d'électrocardiogramme (ECG) électrodes. Maintenir l'anesthésie à 3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène. artère fémorale superficielle brachial et la fièvre aphteuse ne peut pas être réalisée simultanément. Par conséquent, les instructions de préparation pour chaque mesure sont listés ci-dessous.

2. brachial Artère Préparation

1. Positionner la supination animale et retenir le membre supérieur gauche et chaque membre inférieur de l'unimal à la table d'examen avec du ruban adhésif chirurgical.
2. Restreindre le membre supérieur droit de l'animal, de sorte que la partie inférieure de la branche supérieure est légèrement plus élevée (~ 0,2-0,5 cm) au-dessus de la plate-forme.
3. Appliquer agent dépilatoire (par exemple, Nair) au membre supérieur droit de l'animal pour enlever les poils.
4. Placez un brassard d'occlusion (10 mm diamètre de la lumière vasculaire occlusion standard) sur la jambe droite distale supérieure au coude. Ne pas reposer l'opercule sur la plate-forme, alors que l'inflation / déflation se déplacera le membre et de perturber l'imagerie par ultrasons.
5. Régler la machine à ultrasons pour B-mode à l'aide du clavier de l'échographie.
6. Appliquer une petite quantité de gel à ultrasons à la branche supérieure de l'animal, à proximité de la manchette d'occlusion.
7. aligner manuellement un transducteur en réseau linéaire de fréquence ultra-haute attaché à un support stéréotaxique avec le membre supérieur. L'artère brachiale doit être visible 2-3 mm de profondeur.
8. Pour confirmer que l'artère brachiale, pas la veine brachiale, est en coursimagé, passer à PW-mode à l'aide du clavier de l'échographie. L'artère aura le flux sanguin pulsatile par rapport à la veine adjacente qui aura un débit sanguin continu.

3. artère fémorale superficielle Préparation

1. Positionner la supination animale et retenir les membres supérieurs et du membre inférieur gauche à la table d'examen avec du ruban adhésif chirurgical.
2. Retiens branche en bas à droite de l'animal à une position élevée (~ 0,5-1 cm) au-dessus de la plate-forme à l'aide d'un tampon (par exemple, des serviettes en papier plié).
3. Appliquer agent dépilatoire (par exemple, Nair) à la droite de l'animal membre inférieur pour enlever les poils. Après l'épilation la veine fémorale doit être clairement visible à l'intérieur de la cuisse supérieure.
4. Placez un brassard d'occlusion (10 mm diamètre de la lumière vasculaire occlusion standard) proximale à la cheville droite. Ne pas reposer l'opercule sur la plate-forme, alors que l'inflation / déflation se déplacera le membre inférieur et de perturber l'imagerie par ultrasons.
5. Régler la machine à ultrasons pourB-mode.
6. Appliquer une petite quantité de gel à ultrasons à la branche inférieure de l'animal, à proximité de la manchette d'occlusion.
7. aligner manuellement un transducteur en réseau linéaire de fréquence ultra-haute attaché à un support stéréotaxique avec la veine fémorale, qui est visible à travers la peau. L'artère fémorale superficielle doit être visible <1 mm de profondeur.
8. Pour confirmer que l'artère fémorale superficielle, pas la veine fémorale, est imagée, passer à PW-mode. L'artère aura le flux sanguin pulsatile par rapport à la veine adjacente qui aura un débit sanguin continu.

4. Phase de référence

1. Optimiser l'image en mode B, semblable à la façon dont il sera fait chez l' homme ^15. Assurez-vous qu'une image horizontale, longitudinale du navire avec intima-média visualisés dans les deux parois est observée. Optimiser l'image en ajustant légèrement le positionnement de la sonde à ultrasons afin d'assurer que la majeure partie de l'artère que possible est visible dans la fenêtre de capture.
   1. Vous pouvez également régler les paramètres d'ultrasons pour obtenir une meilleure image en changeant la luminosité / contraste, zones focales, la fréquence, la plage dynamique, et la densité de ligne. Il existe d'autres façons d'optimiser l'image échographique, mais la description détaillée de ceux sont au-delà du champ d'application de ce protocole.
2. Après l'optimisation de l'imagerie de l'artère, tourner sur l'ECG-gating pour afficher uniquement les images capturées au cours de l'onde R pour assurer que seulement un cadre de diamètre est recueilli sont au cours de chaque partie diastolique d'un cycle cardiaque.
   REMARQUE: ECG-gating est disponible sur la machine à ultrasons utilisé dans ce protocole en sélectionnant ECG-gating sous l'option des paramètres physiologiques, cependant, cette fonction peut ne pas être disponible sur tous les appareils à ultrasons. ECG-gating doit être activé après que l'image est optimisée, car il est difficile d'obtenir une image à des cadences inférieures (ie, une fois par R-ondes). Sans ECG-gating, la combinaison d'une fréquence cardiaque élevée chez le rat et l'exigence d'un cadre de hauttaux pour capturer la partie diastolique du cycle cardiaque permet seulement ~ 10-20 deuxième clips. La taille encombrante et quantité de données dans chaque clip augmente la charge d'analyse sensiblement.
3. Enregistrement 60 secondes de données de référence à l'aide de B-mode.
   REMARQUE: La machine à ultrasons enregistre toujours, cependant, toutes les images sont stockées sur la machine à ultrasons, car il y a une limite sur le nombre d'images pouvant être enregistrées dans un clip à ultrasons. La longueur du clip (ie, nombre de trames) peut être réglée dans les paramètres. Il est suggéré de fixer pour le nombre maximal d'images par clip. Lorsque l'enregistrement est à la fin d'un clip (nombre maximal de trames atteint), l'enregistrement se poursuit, mais le clip roule vers l'avant capturer les images les plus récentes. Dans ce cas, les trames précédentes qui ont été capturées en dehors de la limite maximale de la trame sont ensuite supprimés. Bien que ces subtilités dans l'enregistrement diffèrent entre les machines, le réglage de la longueur de l'enregistrement peut être nécessaire.
4. Switch à PW-mode. Placez le curseur au milieu de la lumière. Exemples de portes seront placés automatiquement en référence au curseur, mais peuvent être ajustées pour la largeur à l'aide du clavier de l'échographie. Maintenir un angle de insonation de ≤60 °.
   1. Ajustez l'angle de insonation en modifiant l'angle du faisceau Doppler. Faire des réglages fins à l'angle en utilisant le clavier de l'échographie. Si aucune de ces fournir un angle approprié à la mesure, ajuster manuellement la sonde à ultrasons par l'inclinaison de l'artère à un angle plus optimal. Si un ajustement de l'angle de l'échographie est effectuée, recapturer les images en mode B.
5. Fiche 10 secondes de données de vitesse.

5. Occlusion Phase

1. Gonfler l'obturateur vasculaire en utilisant une seringue de 10 ml rempli d'air. Pour maintenir constante la pression d'air dans le dispositif d'occlusion vasculaire, plier le tube sur lui-même et placez un clip de liant sur le tube plié.
2. Basculer vers PW-mode pour confirmer l'occlusion brassard, comme en témoigneune réduction importante de la vitesse du sang.
3. Mettre les données en mode B et enregistrer en 60 secondes clips, jusqu'à 04h45 min d'occlusion.
4. Basculer vers PW-mode. Gardez une trace de la fréquence cardiaque et la durée de chaque clip à ultrasons pour l'analyse.

6. hyperémie Phase

1. Relâchez le brassard lors de l'enregistrement dans PW mode en retirant le clip de liant du tube plié. Fiche 5 secondes avant et 5 secondes après l'enlèvement du brassard.
2. Mettre les données en mode B et enregistrer en 60 secondes clips jusqu'à 3 minutes après l'occlusion. Gardez une trace de la fréquence cardiaque et la durée de chaque clip à ultrasons pour l'analyse.
3. Après l'achèvement de la fièvre aphteuse enlever l'animal de la table d'examen et de suivre jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.

7. Analyse

1. Pour l'analyse, l'exportation des ultrasons sous forme de fichiers DICOM à un ordinateur hors ligne équipé d'un logiciel de détection de bord, ce qui permet non biaisé dissuademination de diamètre de l'artère à chaque trame. L'analyse est possible sur la machine à ultrasons, cependant, il ne recommande pas, car il est extrêmement fastidieux et sujet à un biais de l'enquêteur.
2. Analyser les données de diamètre de l'artère dans 60 seconds segments au cours de base et de l'occlusion de phase, et dans 10 seconds segments pendant la phase d'hyperémie.
3. Analyser les données de vitesse de sang en utilisant les capacités d'analyse de flux du logiciel bord de détection automatique. Déterminer la vitesse du sang moyenne en mesurant 5 ou plusieurs formes d'onde consécutives d'apparence uniforme au cours de référence et d'occlusion phases. Déterminer la vitesse du sang moyenne pendant hyperémie réactive pour des vitesses de sang immédiatement après la libération brassard. La forme d'onde avec la plus grande vitesse du sang est considéré comme la vitesse du sang pic.

Résultats

la dilatation médiée par le flux a été réalisée sur l'artère brachiale et de l'artère fémorale superficielle de 8 rats Wistar. Le positionnement d'un rat est représenté sur la figure 1.

Images ultrasonores représentatives de l'artère fémorale superficielle sont représentés sur la figure 2.

Discussion

Dans la présente étude, une mesure non-invasive de la fièvre aphteuse a été démontrée dans le brachial et les artères fémorales superficielles des rats. Semblables aux humains ^6, après une période d'occlusion de 5 min, on a observé une augmentation rapide de la vitesse du sang (c. -à- hyperémie réactive) , augmentant ainsi la vitesse de cisaillement sur la paroi artérielle , ce qui a entraîné la vasodilatation subséquente de l'artère. La fièvre aphteuse a été observée dans les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Vevo Imaging Station	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Thermasonic gel warmer	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	82-03	Optional
Signacreme electrode cream	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	17-05
Transpore surgical tape	3M, Maplewood, MN, USA	1527-1
Depilatory cream (e.g., Nair)	General supply
Cotton swabs	General supply
Ultrasound gel	General supply
Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	62-0115
10 ml syringe with Luer-Lok tip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Paperclip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Hypodermic needle – 18 gauge	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Medium binder clip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus