JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטת צעד אחרת צעד ביצוע עיסה ישירה מכסה על שיני עכברים להערכת ריפוי פצע pulpal והיווצרות הדנטין מתקן in vivo.

Abstract

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

Introduction

Dental caries are one of the most prevalent oral diseases and the leading cause of surgical interventions to dentitions in almost all individuals1,2. The prognosis of surgical interventions and restorations of a tooth largely depends upon proper pulpal response and successful wound healing. Indeed, dental caries that penetrate deeply through the enamel and dentin frequently lead to the exposure of the underlying pulp tissue that is often "capped" with dental materials, such as calcium hydroxide (Ca(OH)2) or hydraulic calcium-silicate cements (HCSCs), including mineral trioxide aggregates (MTA). The ultimate goal of such a pulp-capping procedure is to expedite pulpal wound healing by regenerating reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" to protect the underlying pulp tissue and to increase the life expectancy of the tooth and the overall oral health. However, the underlying mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is not fully understood.

To better understand the mechanisms of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo, several animals were previously used, including monkeys, dogs, and pigs3-5. Among them, rats are frequently used because they are relatively smaller in sizes compared to the other animals, but their teeth are large enough to perform direct pulp capping without any technical difficulties6-10. These animal models are ideal alternatives to human studies for examining pulpal responses and reparative dentin formation. However, their utilization is limited to observational studies at the cellular level, and they scarcely provide mechanistic insights during reparative dentin formation at the molecular level.

Recent technical advances in genetic engineering provided invaluable and indispensable research tools-mice that harbor a gene that is either overexpressed or deleted-that are instrumental to studying molecular mechanisms of human diseases in vivo. The numbers of different strains of transgenic or knockout mice that are strategically inducible in a cell-specific manner are continually growing in the scientific community. Therefore, examining pulpal wound healing and reparative dentin regeneration in these mice would greatly help to expedite our understanding of these processes at the molecular level. However, the use of mice is significantly dampened, as performing a pulp-capping procedure on a mouse tooth is technically challenging due to its miniature size. Here, we present our reproducible method of performing direct pulp capping in mice for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Protocol

עכברים נרכשו מ ג'קסון מעבדה ולעטוף ביבר חינם לפתוגן בחטיבת UCLA לרפואת בעלי חי מעבדה (DLAM). הניסויים בוצעו על פי ההנחיות מוסדיות המאושרות מן ועדת המחקר החי של הקנצלר (ARC # 2016-037).

1. עכבר הרדמה

  1. השתמש בן שמונה שבועות הנקבה C57 / BL6 עכברים (n = 3).
  2. להרדים את העכברים באמצעות קטמין (80-120 מ"ג / ק"ג של משקל העכבר) / xylazine (5 מ"ג / ק"ג של משקל העכבר) פתרונות ולנהל intraperitoneally (IP) במינון של 10 מ"ל / ק"ג.
  3. הכן קטמין (80 - 120 מ"ג / ק"ג) / xylazine (5 מ"ג / ק"ג) פתרונות ולנהלם intraperitoneally (IP) במינון של 10 מ"ל / ק"ג.
  4. ודא עכברים בהרדמה מלאה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן.

נוהל 2. מכסה-זולה

  1. מניחים את בעל הפה בפה של העכבר.
  2. אבטח את בעל פה על השולחן כך שהואהמודעה פונה כלפי מעלה.
  3. מניח את המיקרוסקופ (10X) על גבי הפה כך טוחן לסתי הראשונה הוא גלוי לחלוטין.
  4. באמצעות ¼ הסיבוב ספחת בתוך ידית במהירות גבוהה ב 200,000 סל"ד, הוצא את חלק האמייל של השן באמצע עד עיסת גלוי דרך הדנטין השקוף. אין לחשוף את העיסה עם הספחת.
  5. כשאתה משתמש בקובץ-K endodontic 15 # (בקוטר של 150 מיקרומטר), לנקב דרך הדנטין ולחשוף את העיסה.
    הערה: טיפול מיוחד צריכה להילקח כך פסול הדנטין לא לקבל דחף לתוך העיסה. זה יכול להימנע על ידי החלפה של קובץ K רבעונים ואז מושך את K-להגיש החוצה.
  6. מערבבים עם MTA סטרילי H 2 O על פי הוראות היצרן. לספק ומקום MTA על העיסה החשופה עם קצה Explorer. השתמש הצד האחורי של נקודת נייר (קנס) לארוז את MTA לתוך העיסה נחשפה על ידי הקשה עדינה. מן הצד הקהה של נקודת נייר שטוח ולכן מאפשרעבור העיבוי התקין של MTA לתוך העיסה החשופה.
  7. Etch השן במשך 15 שניות על ידי הנחת etchant חומצה זרחתית 35% שבו זה פשוט מכסה את השן. קח טיפול מיוחד כדי להגביל את המיקום של etchant, מכיוון שהוא עלול לגרום לגירוי רקמות חניכיים.
    הערה: etchant מגיע מזרק משמש לחספס את משטחי השן כך דבקים שיניים יכול לזרום לתווך מליטה micromechanical על השן. כי הם צמיגים, זה יכול להיות עצמאי על ידי החלת כמויות קטנות ישירות על גבי השן.
  8. השתמש יניקה שלילית בלחץ להסיר את etchant. השתמש גלול כותנה, כי הוא שרוי קל באות O H 2 להסיר את שאריות etchant. חזור על שלב זה עד etchant נמחק לחלוטין מן השן.
  9. באמצעות מטלית אוויר דחוס, לייבש את השן בעדינות.
  10. החל דבקי השיניים באמצעות הישבן של נקודת נייר.
  11. הפוך את שכבת דבק דקה באמצעות אוויר דחוס עבור 3 s.
  12. Cיור דבקי השיניים במשך 20 שניות באמצעות יחידת אור-ריפוי.
  13. מניחים את מרוכבים flowable בכמויות קטנות על השן והוא היה אטום עם MTA. השתמש בקצה של החוקר לזרום המשולב לתוך חריצי השן.
  14. לרפא את מרוכבים עבור 30 s באמצעות יחידת-ריפוי אור לפלמר אותו. ודא מרוכבים הוא נרפא לחלוטין וקשה באמצעות הסייר.

3. Post-op Care

  1. נהל carprofen (5 מ"ג / קילו) תת עורי (SC) מייד לאחר הליך מכסה-העיסה.
  2. מניח את העכברים על כרית חימום בהספק נמוך כדי לשמור על החיות חמות לפני שהם מתעוררים.
  3. החזר את עכברי הביבר לדיור.

רכש רקמות 4.

  1. לאחר 5 - 6 שבועות, להרדים את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם תחת תנאי הרדמה מלאה עם isoflurane.
  2. מוציאים בזהירות את maxilla והוצא אותו מבסיס הגולגולת והכניס אותו לתוך צינור 50 מ"ל. תקן את entirmaxilla דואר המכיל את שני שן העיסה-כתרי שן הסגורה והפתוחה הנגדית paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS, pH 7.4, ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן לאחסן אותו בתמיסת אתנול 70%.
    הערה: Paraformaldehyde הוא רעיל ומסרטן. Paraformaldehyde השימוש הנכון צריך להיות במעקב כפי שמתואר נהלי עבודה סטנדרטיים (SOP).
  3. סרוק את maxillae העכבר באמצעות סריקת μCT. להבטחת maxillae במהלך הסריקה, לעטוף את דגימות עם גזה ספוגה 70% אתנול ו למקם אותם בצינור תרבית תאים של 15 מ"ל.

5. סריקה μCT

  1. הכן את הדגימות לסריקת μCT. בקצרה, לעטוף את דגימות עם גזה ספוגה 70% אתנול ו לאבטח אותם בתוך שפופרת חרוטי תרבית תאים הגנרית של 15 מ"ל. הר הצינור לבמת סריקת μCT, כפי שמתואר בהוראות היצרן.
  2. הגדר את מקור רנטגן כדי זרם של 145 מיקרו-אמפר, מתח של 55 KVP ופעם חשיפת 200 ms.
  3. בצע רכישת התמונה עם סורק μCT ברזולוציה 20 מיקרומטר עם מסנן 0.5 מ"מ אל.
  4. לשחזר את התמונה ולדמיין אותו 11.
  5. לאחר הסריקה μCT ההתקנה, הפעל decalcification עם 5% EDTA ו -4 סוכרוז% ב PBS (pH 7.4) במשך 2 שבועות.

עיבוד רקמות 6. מכתים

  1. להטביע רקמות decalcified פרפין. לפני ההטבעה, חתוך את maxilla על ידי ביצוע חתך sagittal מייד קדמית הטוחן הראשונה. בעוד הטבעה, מקם המשטח הזה כלפי מטה, כך החתך לאורך של הטוחנת הראשונה הוא משטח החיתוך.
  2. באמצעות microtome, להכין 5 שקופיות מיקרומטר בעובי. האזורים המגבילים עיסת בדרך כלל בקנה אחד עם distopalatal (DP) השורש, אשר ניתן להשתמש בהם כנקודת ציון. לקבוע את האזור המדויק של עניין על ידי בחינת היסטולוגיה במיקרוסקופ אור השוואת תמונות μCT.
  3. עבור H & E מכתימה, deparaffinize ו רעננותם שקופיות עם קסילן (2x) ואתנול בדילול סדרתי (100% EtOH 2x, 95% EtOH 2x, ו -70% EtOH 1x).
  4. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים מהברז.
  5. הכתם עם פתרון Hematoxylin עבור 2.5 דקות ולשטוף עם מי ברז.
  6. טובלים את השקופיות אתנול 95% דקות 1.
  7. כתם עם פתרון Eosin דקות 1 ולשטוף במים ברז.
  8. מייבשים עם אתנול בדילול סדרתי (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, ו -100% EtOH 3x) קסילן (3x).
  9. הר שקופיות עם פתרון הרכבה.

תוצאות

הנה, הראינו את שלב-אחר-צעד נהלים לבצע עיסת מכסת על השיניים עכברים. אחד ההיבטים המרכזיים של עיסת מכסה בעכברים הוא לקבל את המנגנון המתאים. בהקשר זה, שיש מיקרוסקופ עם הגדלה כוח 10X חיוני (איור 1 א). כדי ליצור הכנת Class-I-כמו השן, השתמשנו בר ¼-סיבוב במא?...

Discussion

נכון לעכשיו, ישנם מספר דגמים ניסיוניים שונים זמינים כדי לאמת את השפעות in vivo של חומרים דנטליים, פיגומים, או גורמי גדילה על בידול odontogenic של תאי גזע עיסת שיניים (DPSCs) 13. מודלים אלה כוללים בהשתלה עצמית אקטופי של DPSCs לתוך איבר, כגון הקפסולה כליות, או השתלה תת עורית ש...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי R01DE023348 (RHK) מ NIDCR / NIH ואת מענק מחקר הפקולטה (RHK) מהמועצה למחקר של הסנאט האקדמי של חטיבת לוס אנג'לס של אוניברסיטת קליפורניה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BM-LED stereo microscopeMEIJI TechnoMicroscope 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Electic motor engine
isofluraneHenry schein animal healthNDC 11695-0500-2
1/4 round burBrasseler001092T0
Endodontic K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Paper pointHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent product Inc.Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlusKerr29669Adhesives
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Curing light unit
Characterization tintBiscoT-14012Flowable composite
SkyscanBreuker1275uCT scanner
MicromThermoHM355SMicrotome
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Mounting solution

References

  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197 (2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40 (2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  12. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347 (2015).
  13. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  14. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  15. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  16. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  17. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  18. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  19. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  20. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  21. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  22. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  23. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503 (2016).
  24. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  25. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  26. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  27. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  28. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  29. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  30. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  31. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119trioxide

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved