JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы опишем метод шаг за шагом выполнения прямых пульпы на мышах зубов для оценки пульпарного заживления раны и формирования репаративного дентина в естественных условиях.

Аннотация

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

Введение

Dental caries are one of the most prevalent oral diseases and the leading cause of surgical interventions to dentitions in almost all individuals1,2. The prognosis of surgical interventions and restorations of a tooth largely depends upon proper pulpal response and successful wound healing. Indeed, dental caries that penetrate deeply through the enamel and dentin frequently lead to the exposure of the underlying pulp tissue that is often "capped" with dental materials, such as calcium hydroxide (Ca(OH)2) or hydraulic calcium-silicate cements (HCSCs), including mineral trioxide aggregates (MTA). The ultimate goal of such a pulp-capping procedure is to expedite pulpal wound healing by regenerating reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" to protect the underlying pulp tissue and to increase the life expectancy of the tooth and the overall oral health. However, the underlying mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is not fully understood.

To better understand the mechanisms of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo, several animals were previously used, including monkeys, dogs, and pigs3-5. Among them, rats are frequently used because they are relatively smaller in sizes compared to the other animals, but their teeth are large enough to perform direct pulp capping without any technical difficulties6-10. These animal models are ideal alternatives to human studies for examining pulpal responses and reparative dentin formation. However, their utilization is limited to observational studies at the cellular level, and they scarcely provide mechanistic insights during reparative dentin formation at the molecular level.

Recent technical advances in genetic engineering provided invaluable and indispensable research tools-mice that harbor a gene that is either overexpressed or deleted-that are instrumental to studying molecular mechanisms of human diseases in vivo. The numbers of different strains of transgenic or knockout mice that are strategically inducible in a cell-specific manner are continually growing in the scientific community. Therefore, examining pulpal wound healing and reparative dentin regeneration in these mice would greatly help to expedite our understanding of these processes at the molecular level. However, the use of mice is significantly dampened, as performing a pulp-capping procedure on a mouse tooth is technically challenging due to its miniature size. Here, we present our reproducible method of performing direct pulp capping in mice for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

протокол

Мыши были приобретены у Jackson Laboratory и хранятся в патогена вивария в UCLA Отдел лабораторных животных медицины (DLAM). Эксперименты проводились в соответствии с утвержденными институциональными руководствами Исследовательского комитета канцлера животных (ARC # 2016-037).

1. Мышь обезболиванием

  1. Используйте восемь-недельных самок мышей C57 / НД6 (п = 3).
  2. Обезболить мышей с использованием растворов (5 мг / кг веса мыши) кетамином (80-120 мг / кг веса мыши) / ксилазина и управлять внутрибрюшинно (IP) в дозе 10 мл / кг.
  3. Приготовьте кетамином (80 - 120 мг / кг) / ксилазином (5 мг / кг) растворы и вводить их внутрибрюшинно (IP) в дозе 10 мл / кг.
  4. Убедитесь, что мыши полностью под наркозом, выполняя носок щепотку.

2. Целлюлозно-укупорки Процедура

  1. Поместите держатель рот в рот мыши.
  2. Закрепите держатель рта на стол таким образом, чтобы онОбъявление обращена вверх.
  3. Поместите микроскоп (10x) в верхней части рта, так что первый верхнечелюстной молярной полностью виден.
  4. Используя ¼ круглый бур в высокоскоростном наконечнике при 200000 оборотов в минуту, удалите эмаль часть зуба в середине, пока мякоть не видна через прозрачный дентин. Не подвергать мякоть с бором.
  5. Использование # 15 эндодонтического K-файл (диаметр 150 мкм), перфорировать через дентина и подвергать мякоть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание следует соблюдать осторожность, чтобы дентин мусор не получает проталкивается в пульпе. Этого можно избежать путем поворота K-файл ежеквартально, а затем потянув K-файл из.
  6. Смешайте MTA стерильной H 2 O в соответствии с инструкциями изготовителя. Доставка и поместите АПС на открытую пульпу с наконечником исследователя. Используйте обратную сторону точки бумаги (штраф), чтобы упаковать АПС в обнаженную пульпу Осторожным нарезании резьбы. Чем толще сторона точки бумаги является плоской, и, следовательно, позволяетдля надлежащего конденсации МТА в обнаженную пульпу.
  7. Протравите зуб за 15 сек путем размещения 35% травильного фосфорной кислоты, где она просто покрывает зуб. Соблюдайте особую осторожность, чтобы ограничить размещение травителя, так как это может вызвать раздражение тканей десны.
    Примечание: травителя приходит в шприц и используется для придания шероховатости поверхности зубов таким образом, что зубные клеи могут протекать в посредничать микромеханическую склеивание на зуб. Поскольку они являются вязкими, он может быть самодостаточным путем применения небольших количеств непосредственно на зуб.
  8. Используйте отрицательное-давление всасывания для удаления травителя. Используйте ватный шарик , который слегка смоченную H 2 O , чтобы удалить остатки травителя. Повторите этот шаг до тех пор, пока травитель полностью удаляется из зуба.
  9. Использование воздуха тряпку сжатый, осторожно высушить зуб.
  10. Примените стоматологические клеи, используя тыльную точки бумаги.
  11. Сделать клеевой слой тонкий с помощью сжатого воздуха в течение 3 сек.
  12. СЮр стоматологические клеи для 20 с помощью отверждения света блок.
  13. Поместите текучий композит в небольших количествах на зуб, который был ограничен с МТА. Используйте кончик исследователя течь композита в пазы зуба.
  14. Отверждение композита в течение 30 с с использованием свето- полимеризационное полимеризоваться его. Убедитесь, что композит полностью вылечить и трудно с помощью проводника.

3. Послеоперационное уход

  1. Администрирование карпрофен (5 мг / кг) подкожно (подкожно) сразу после процедуры целлюлозно-укупорки.
  2. Поместите мышей на грелку при низкой мощности, чтобы держать животных теплой, прежде чем они просыпаются.
  3. Вернуть мышей в виварии для жилищного строительства.

4. Тканевая закупок

  1. Через 5 - 6 недель, усыпить мышей путем смещения шейных позвонков при полном анестетика состоянии с изофлуран.
  2. Осторожно снимите верхнюю челюсть из основания черепа и поместить его в пробирку 50 мл. Закрепить entirе максилла, что содержит как целлюлозный вершины зуба и контралатеральной кэппированную зуб в 4% параформальдегид в PBS, рН 7,4, при 4 ° С в течение ночи, а затем хранить его в 70% -ном растворе этанола.
    Примечание: параформальдегид является токсичным и канцерогенным. Правильное использование параформальдегид следует контролировать, как описано в стандартных операционных процедур (СОП).
  3. Сканирование Максиллы мыши с помощью сканирования μCT. Для обеспечения Максиллы во время сканирования, завернуть образцы с марлей, смоченной 70% -ным этанолом и помещают их в культуре клеток трубки 15 мл.

5. μCT Сканирование

  1. Подготовка образцов для сканирования μCT. Если коротко, то завернуть образцы с марлей, смоченной 70% -ным этанолом и закрепить их в родовом 15-мл клеточной культуры коническую трубку. Установите трубки на этапе сканирования μCT, как указано в инструкции изготовителя.
  2. Установите источник рентгеновского излучения с током 145 мкА, напряжение 55 кВп, и временем экспозиции 200 мс.
  3. Выполните получение изображений с помощью сканера μCT с разрешением 20 мкм и с Al фильтром 0,5 мм.
  4. Реконструировать изображения и визуализировать его 11.
  5. После того, как μCT сканирование завершено, начинают декальцификацию с 5% ЭДТА и 4% сахарозы в PBS (рН 7,4) в течение 2-х недель.

6. обработка ткани и Окрашивание

  1. Встраивать декальцинированной ткани в парафин. Перед тем как вложение, обрезать верхнюю челюсть, сделав сагиттальный разрез непосредственно впереди первого моляра. В то время как вложение, расположить эту поверхность вниз, таким образом, что продольное сечение первого моляра является режущая поверхность.
  2. Используя микротом, подготовить 5 мкм толщиной слайды. Пульпа-укупорочные районы, как правило, совпадает с distopalatal (DP), корень, который может быть использован в качестве ориентира. Определить точную сферу интересов путем изучения гистологии под световым микроскопом и сравнивая изображения μCT.
  3. Для H & E окрашивания, deparaffinize и регидратации слайды с ксилолом (2 раза) и серийно разведенной этанолом (100% этанола в 2 раза, 95% этанола 2x и 70% этанола 1x).
  4. Промыть слайды с проточной водопроводной водой.
  5. Пятно с раствором гематоксилин в течение 2,5 мин и сполоснуть водой.
  6. Dip слайдов в 95% этаноле в течение 1 мин.
  7. Пятно раствором эозина в течение 1 мин и сполоснуть водой.
  8. Высушить с серийно разведенной этанолом (70% этанола 1x, 95% этанола 2x, и 100% этанола 3x) и ксилол (3x).
  9. Установите слайды с монтажным решением.

Результаты

Здесь мы показали процедуры шаг за шагом выполнить покрытие пульпы на мышах зубов. Одним из ключевых аспектов пульпы у мышей должна иметь соответствующее устройство. В связи с этим, имея микроскопа с 10 - кратным увеличением мощности является существенным (Фиг.1А).

Обсуждение

В настоящее время существует несколько различных экспериментальных моделей , доступных для проверки эффектов в естественных условиях стоматологических материалов, строительных лесов, или факторов роста на одонтогенного дифференциации зубных стволовых клеток пульпы (DPSCs) 13.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Это исследование было поддержано R01DE023348 (RHK) из NIDCR / NIH и Научно-исследовательского гранта факультета (RHK) из Совета по научным исследованиям ученого Сената Лос-Анджелеса отделения Калифорнийского университета.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BM-LED stereo microscopeMEIJI TechnoMicroscope 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Electic motor engine
isofluraneHenry schein animal healthNDC 11695-0500-2
1/4 round burBrasseler001092T0
Endodontic K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Paper pointHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent product Inc.Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlusKerr29669Adhesives
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Curing light unit
Characterization tintBiscoT-14012Flowable composite
SkyscanBreuker1275uCT scanner
MicromThermoHM355SMicrotome
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Mounting solution

Ссылки

  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197 (2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40 (2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  12. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347 (2015).
  13. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  14. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  15. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  16. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  17. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  18. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  19. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  20. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  21. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  22. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  23. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503 (2016).
  24. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  25. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  26. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  27. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  28. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  29. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  30. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  31. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

119Micro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены