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  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Descreve-se um método passo-a-passo de realização de polpa directo capping em ratos dentes para a avaliação da cicatrização de feridas e formação de dentina pulpar reparadora in vivo.

Resumo

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

Introdução

Dental caries are one of the most prevalent oral diseases and the leading cause of surgical interventions to dentitions in almost all individuals1,2. The prognosis of surgical interventions and restorations of a tooth largely depends upon proper pulpal response and successful wound healing. Indeed, dental caries that penetrate deeply through the enamel and dentin frequently lead to the exposure of the underlying pulp tissue that is often "capped" with dental materials, such as calcium hydroxide (Ca(OH)2) or hydraulic calcium-silicate cements (HCSCs), including mineral trioxide aggregates (MTA). The ultimate goal of such a pulp-capping procedure is to expedite pulpal wound healing by regenerating reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" to protect the underlying pulp tissue and to increase the life expectancy of the tooth and the overall oral health. However, the underlying mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is not fully understood.

To better understand the mechanisms of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo, several animals were previously used, including monkeys, dogs, and pigs3-5. Among them, rats are frequently used because they are relatively smaller in sizes compared to the other animals, but their teeth are large enough to perform direct pulp capping without any technical difficulties6-10. These animal models are ideal alternatives to human studies for examining pulpal responses and reparative dentin formation. However, their utilization is limited to observational studies at the cellular level, and they scarcely provide mechanistic insights during reparative dentin formation at the molecular level.

Recent technical advances in genetic engineering provided invaluable and indispensable research tools-mice that harbor a gene that is either overexpressed or deleted-that are instrumental to studying molecular mechanisms of human diseases in vivo. The numbers of different strains of transgenic or knockout mice that are strategically inducible in a cell-specific manner are continually growing in the scientific community. Therefore, examining pulpal wound healing and reparative dentin regeneration in these mice would greatly help to expedite our understanding of these processes at the molecular level. However, the use of mice is significantly dampened, as performing a pulp-capping procedure on a mouse tooth is technically challenging due to its miniature size. Here, we present our reproducible method of performing direct pulp capping in mice for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Protocolo

Os ratos foram adquiridos de Jackson Laboratory e mantidos em um viveiro livre de patógenos na Divisão UCLA de Medicina Laboratorial Animal (DLAM). Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais aprovados pela Comissão de Pesquisa com Animais da chanceler (ARC # 2016-037).

1. Rato anesthetization

  1. Use feminino camundongos C57 / BL6 de oito semanas de idade (n = 3).
  2. Anestesiar os ratos usando cetamina (80-120 mg / kg de peso de rato) / xilazina soluções (5 mg / kg de peso de rato) e administrar por via intraperitoneal (ip) a uma dose de 10 ml / kg.
  3. Preparar cetamina (80-120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluções e administrá-los por via intraperitoneal (ip) a uma dose de 10 ml / kg.
  4. Confirmar que os ratos são anestesiados completamente através da realização de um aperto do dedo do pé.

2. Procedimento-capeamento pulpar

  1. Coloque o suporte da boca na boca do mouse.
  2. Fixar o suporte da boca sobre a mesa de tal modo que a eleanúncio é voltado para cima.
  3. Coloque o microscópio (10X) em cima da boca de modo que o primeiro molar superior é totalmente visível.
  4. Usando a ¼-round broca em uma caneta de alta rotação em 200.000 rpm, remover a parte do esmalte do dente no meio até que a polpa é visível através da dentina transparente. Não expor a polpa com a broca.
  5. Usando um K-lima endodôntica # 15 (diâmetro de 150 mm), perfuram a dentina e expor a polpa.
    NOTA: Cuidados especiais devem ser tomados para que os detritos dentina não se empurrado para dentro da polpa. Isto pode ser evitado através da rotação do ficheiro-K trimestral e, em seguida, puxando o K-arquivo para fora.
  6. Misture MTA com H 2 O esterilizada de acordo com as instruções do fabricante. Entregar e colocar o MTA sobre a polpa exposta com a ponta do explorador. Use o lado de trás do papel ponto (fino) para embalar o MTA na polpa exposta, agitando ligeiramente. O lado mais grosso do ponto de trabalho é plana e, portanto, permitepara a condensação apropriada do MTA na polpa exposta.
  7. Etch o dente por 15 s, colocando o etchant ácido fosfórico 35% em que apenas cobre o dente. Tome especial cuidado para limitar a colocação do produto corrosivo, uma vez que pode irritar os tecidos gengivais.
    NOTA: O produto corrosivo vem em uma seringa e é usado para irritar as superfícies dos dentes de modo que os adesivos dentários podem fluir em para mediar a ligação de micromecânica para o dente. Porque eles são viscoso, que pode ser auto-suficiente pela aplicação de pequenas quantidades directamente no dente.
  8. Use sucção negativa pressionados para remover o produto corrosivo. Utilize uma bolinha de algodão que é levemente embebido com H 2 O para remover os resíduos do decapante. Repetir esta etapa até que o agente condicionador é completamente removido do dente.
  9. Usando um espanador de ar comprimido, secar suavemente o dente.
  10. Aplicar os adesivos dentárias utilizando a parte de trás do ponto de papel.
  11. Faça a camada adesiva fina com ar comprimido por 3 s.
  12. Cure os adesivos dentais durante 20 s utilizando a unidade de cura luz.
  13. Colocar o composta fluida em pequenas quantidades para o dente que foi tampado com MTA. Use a ponta do explorador a fluir o compósito nas ranhuras de dentes.
  14. Curar o composto por 30 s utilizando um aparelho fotopolimerizador para polimerizar-lo. Confirmar que o composto está totalmente curado e dura usando o explorador.

3. Post-op Cuidados

  1. Administrar carprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea (SC), imediatamente após o processo de nivelamento de celulose.
  2. Coloque os ratos sobre uma almofada de aquecimento em baixa potência para manter os animais quente antes de acordar.
  3. Devolver os ratos para o biotério para a habitação.

Procurement 4. Tissue

  1. Depois de 5 - 6 semanas, sacrificar os ratinhos por deslocamento cervical, sob uma condição de anestesia completa com isoflurano.
  2. Remova cuidadosamente a maxila para fora da base do crânio e colocá-lo em um tubo de 50 ml. Fixar o entire maxila que contém tanto o dente cobertas de celulose e o dente destapado contralateral em 4% de paraformaldeído em PBS, pH 7,4, a 4 ° C durante a noite, e em seguida armazená-lo em uma solução de etanol a 70%.
    NOTA: O paraformaldeído é tóxico e cancerígeno. O uso paraformaldeído adequada devem ser monitorados, conforme descrito nos procedimentos operacionais padrão (SOP).
  3. Digitalizar o maxillae mouse usando a digitalização μCT. Para garantir a maxila durante a digitalização, enrole as amostras com gaze embebida com 70% de etanol e colocá-los no tubo de cultura de células de 15 mL.

5. μCT Scanning

  1. Preparar as amostras para digitalização μCT. Resumidamente, enrole as amostras com gaze embebida com 70% de etanol e fixá-los em um tubo cônico de cultura de células genérico de 15 mL. Montar o tubo sobre a plataforma de varrimento μCT, conforme descrito nas instruções do fabricante.
  2. Definir a fonte de raios-X para uma corrente de 145 mA, uma tensão de 55 kVp, e um tempo de exposição de 200 ms.
  3. Realizar a aquisição de imagens com o scanner μCT com uma resolução de 20 um e com um filtro de Al de 0,5 mm.
  4. Reconstruir a imagem e visualizá-lo 11.
  5. Uma vez que o varrimento está completo μCT, iniciar a descalcificação com EDTA a 5% e 4% de sacarose em PBS (pH 7,4) durante 2 semanas.

6. Processamento de tecido e da coloração

  1. Incorporar os tecidos descalcificados em parafina. Antes de embutir, a guarnição da maxila, fazendo um corte sagital imediatamente anterior ao primeiro molar. Enquanto a incorporação, a posição desta superfície para baixo, de tal modo que a secção longitudinal do primeiro molar é a superfície de corte.
  2. Usando o micrótomo, preparar 5 slides mm de espessura. As áreas de capeamento polpa geralmente coincidem com a raiz distopalatal (DP), o qual pode ser utilizado como um ponto de referência. Determinar a área exacta de interesse examinando a histologia sob o microscópio de luz e comparar as imagens μCT.
  3. Para H & E coloração, Deparaffinize e hidratar as lâminas com xileno (2 x) e etanol diluídos em série (100% de EtOH 2x, EtOH a 95% 2x e 70% de EtOH 1x).
  4. Lavar as lâminas com água corrente da torneira.
  5. Mancha com uma solução de hematoxilina de 2,5 minutos e enxaguar com água da torneira.
  6. Mergulhar as lâminas em etanol a 95% durante 1 min.
  7. Mancha com uma solução Eosina durante 1 minuto e enxágüe com água da torneira.
  8. Desidratar com etanol diluído em série (EtOH a 70% 1x, 95% 2x de EtOH, e 100% de EtOH 3x) e xileno (3x).
  9. Montar as lâminas com solução de montagem.

Resultados

Aqui, nós mostramos os procedimentos passo-a-passo para realizar pulpar direta em ratos dentes. Um dos aspectos-chave de proteção pulpar direta em ratos é ter o aparelho apropriado. A este respeito, tendo o microscópio com uma ampliação de 10X de energia é essencial (Figura 1A). Para criar uma preparação Class-I-like no dente, usamos uma rebarba de ¼ de volta em uma alta rotação elétrica em 200.000 rpm (Figura 1B). Em alternativa, quaisquer...

Discussão

Atualmente, existem vários modelos experimentais disponíveis para validar os efeitos in vivo de materiais dentários, andaimes, ou fatores de crescimento sobre a diferenciação odontogênico de células-tronco da polpa dentária (DPSC) 13. Estes modelos incluem o transplante autólogo de ectópica DPSC em um órgão, tal como a cápsula renal, ou a transplantação subcutânea de DPSC em ratinhos imunocomprometidos com andaimes 14,15. No entanto, estes métodos estão limitados no que o...

Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por R01DE023348 (RHK) a partir NIDCR / NIH ea Research Grant Faculdade (RHK) do Conselho de Investigação do Senado Académico da Divisão de Los Angeles, da Universidade da Califórnia.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BM-LED stereo microscopeMEIJI TechnoMicroscope 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Electic motor engine
isofluraneHenry schein animal healthNDC 11695-0500-2
1/4 round burBrasseler001092T0
Endodontic K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Paper pointHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent product Inc.Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlusKerr29669Adhesives
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Curing light unit
Characterization tintBiscoT-14012Flowable composite
SkyscanBreuker1275uCT scanner
MicromThermoHM355SMicrotome
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Mounting solution

Referências

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