Entwicklung eines Direkt Pulp-Kappungsmodell für die Beurteilung von Pulpal Wundheilung und Reparative Dentinbildung bei Mäusen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Schritt- für -Schritt - Methode der direkten Pulpe an Mäusen Zähne für die Bewertung der Pulpa Wundheilung und reparative Dentin Bildung in vivo Capping durchgeführt wird .

Zusammenfassung

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

Einleitung

Dental caries are one of the most prevalent oral diseases and the leading cause of surgical interventions to dentitions in almost all individuals^1,2. The prognosis of surgical interventions and restorations of a tooth largely depends upon proper pulpal response and successful wound healing. Indeed, dental caries that penetrate deeply through the enamel and dentin frequently lead to the exposure of the underlying pulp tissue that is often "capped" with dental materials, such as calcium hydroxide (Ca(OH)₂) or hydraulic calcium-silicate cements (HCSCs), including mineral trioxide aggregates (MTA). The ultimate goal of such a pulp-capping procedure is to expedite pulpal wound healing by regenerating reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" to protect the underlying pulp tissue and to increase the life expectancy of the tooth and the overall oral health. However, the underlying mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is not fully understood.

To better understand the mechanisms of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo, several animals were previously used, including monkeys, dogs, and pigs^3-5. Among them, rats are frequently used because they are relatively smaller in sizes compared to the other animals, but their teeth are large enough to perform direct pulp capping without any technical difficulties^6-10. These animal models are ideal alternatives to human studies for examining pulpal responses and reparative dentin formation. However, their utilization is limited to observational studies at the cellular level, and they scarcely provide mechanistic insights during reparative dentin formation at the molecular level.

Recent technical advances in genetic engineering provided invaluable and indispensable research tools-mice that harbor a gene that is either overexpressed or deleted-that are instrumental to studying molecular mechanisms of human diseases in vivo. The numbers of different strains of transgenic or knockout mice that are strategically inducible in a cell-specific manner are continually growing in the scientific community. Therefore, examining pulpal wound healing and reparative dentin regeneration in these mice would greatly help to expedite our understanding of these processes at the molecular level. However, the use of mice is significantly dampened, as performing a pulp-capping procedure on a mouse tooth is technically challenging due to its miniature size. Here, we present our reproducible method of performing direct pulp capping in mice for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Protokoll

Die Mäuse wurden von Jackson Laboratory erworben und in einem keimfreien Vivarium in der UCLA Abteilung für Labortiermedizin (DLAM). Die Experimente wurden aus dem Kanzler Animal Research Committee (ARC # 2016-037) nach den anerkannten Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Maus Betäubung

1. Verwenden Sie acht Wochen alten weiblichen C57 / BL6-Mäusen (n = 3).
2. Anästhesieren die Mäuse unter Verwendung von Ketamin (80-120 mg / kg Mausgewicht) / Xylazin (5 mg / kg Mausgewicht) Lösungen und administrieren intraperitoneal (ip) in einer Dosis von 10 ml / kg.
3. Bereiten Ketamin (80 - 120 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg) Lösungen und verwalten sie intraperitoneal (ip) in einer Dosis von 10 ml / kg.
4. Bestätigen Sie, dass die Mäuse durch Ausführen einer Zehe Prise vollständig betäubt werden.

2. Zellstoff-Capping Verfahren

1. Platzieren Sie den Mund Halter in der Maus in den Mund.
2. Sichern Sie den Mund Halter auf dem Tisch, so dass die erAnzeige nach oben zeigt.
3. Platzieren Sie das Mikroskop (10fach) oben auf den Mund, so dass der erste Oberkiefermolaren vollständig sichtbar ist.
4. Mit der ¼-Rundbohrer in einem Hochgeschwindigkeits-Handstück bei 200.000 Umdrehungen pro Minute, entfernen Sie den Zahnschmelz Teil des Zahnes in der Mitte, bis der Brei durch das transparente Dentin sichtbar ist. Sie nicht den Brei mit dem bur aussetzen.
5. Unter Verwendung eines # 15 Endodontie K-Datei (Durchmesser von 150 & mgr; m), perforieren durch das Dentin und setzen die Zellstoff.
   HINWEIS: Besondere Vorsicht ist geboten werden, so dass das Dentin Schmutz nicht in den Brei geschoben bekommt. Dies kann vierteljährlich durch Drehen der K-Datei vermieden werden, und dann zieht die K-Datei aus.
6. Mischungs MTA mit sterilem H ₂ O gemäß den Anweisungen des Herstellers. mit der Spitze des Explorers liefern und den MTA auf die Pulpa platzieren. Verwenden Sie die Rückseite der Papierspitze (fein) durch leichtes Klopfen der MTA in die Pulpa zu packen. Die dickere Seite des Papiers Punkt ist flach und daher erlaubtfür die ordnungsgemäße Kondensation des MTA in die Pulpa.
7. Etch den Zahn für 15 s durch die 35% ige Phosphorsäure-Ätzmittel platzieren, wo es nur um den Zahn abdeckt. Besondere Vorsicht die Platzierung des Ätzmittel zu begrenzen, da es Gingivagewebe reizen können.
   HINWEIS: Das Ätzmittel in einer Spritze kommt, und verwendet wird, um die Zahnflächen aufzurauhen, so dass Dentaladhäsive einströmen kann mikromechanischen Bindung auf den Zahn zu vermitteln. Da sie viskos sind, können sie durch die Anwendung kleiner Mengen direkt auf dem Zahn in sich geschlossen sein.
8. Verwenden Sie negative Druck stehenden Saug- das Ätzmittel zu entfernen. Verwenden Sie einen Wattepellet , das leicht mit H ₂ O getränkt wird , um die Reste des Ätzmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Ätzmittel vollständig aus dem Zahn entfernt wird.
9. Mit Hilfe eines Druckluftstaubtuch trocknen sanft den Zahn.
10. Übernehmen Sie die Dentaladhäsive die Rückseite des Papierspitze verwenden.
11. Stellen Sie die Klebeschicht dünn mit Druckluft für 3 s.
12. Cure die Dentaladhäsive für 20 s die Aushärtung Lichteinheit.
13. Legen Sie das fließfähige Composite in kleinen Mengen auf den Zahn, der mit MTA gekappt wurde. Verwenden Sie die Spitze des Forschers des Verbund in die Zahnrillen zu fließen.
14. Heilung der Verbund für 30 s eine lichthärtende Einheit unter Verwendung es zu polymerisieren. Bestätigen Sie, dass der Verbund vollständig ausgehärtet ist und hart den Explorer verwenden.

3. Post-op Pflege

1. Verabreichen Carprofen (5 mg / kg) subkutan (sc) unmittelbar nach der Pulpe-Capping Verfahren.
2. Legen Sie die Mäuse auf einem Heizkissen bei geringer Leistung, die Tiere warm zu halten, bevor sie aufwachen.
3. Bringen Sie die Mäuse auf das Vivarium für den Wohnungsbau.

4. Gewebebeschaffung

1. Nach 5 - 6 Wochen, die Mäuse durch Genickbruch unter einer vollständigen Betäubung mit Isofluran Zustand einschläfern.
2. Entfernen Sie vorsichtig den Oberkiefer aus der Basis des Schädels und steckte es in einen 50-ml-Röhrchen. Befestigen Sie den entire Oberkiefers, die über Nacht in PBS, pH 7,4, bei 4 ° C sowohl die Zellstoff- bedeckten Zahn und die kontralaterale uncapped Zahn in 4% Paraformaldehyd enthält, und es dann speichern Sie in einer 70% igen Ethanollösung.
   HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig und krebserregend. Die ordnungsgemäße Verwendung Paraformaldehyd sollte in den Standardarbeitsanweisungen (SOP) wie skizziert überwacht werden.
3. Scannen Sie die Maus Maxillen die μCT Scan verwenden. Zur Sicherung des Oberkiefers während des Scannens, wickeln Sie die Proben mit Gaze, getränkt mit 70% Ethanol und legen Sie sie in den 15-ml Zellkulturröhrchen.

5. μCT Scanning

1. Bereiten Sie die Proben für μCT Scannen. Kurz gesagt, wickeln Sie die Proben mit Gaze mit 70% Ethanol getränkt und sie in einem allgemeinen 15 ml Zellkultur konischen Röhrchen sichern. Montieren Sie das Rohr auf die μCT Scanstufe, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben.
2. Stellen Sie die Röntgenstrahlenquelle einem Strom von 145 uA, einer Spannung von 55 kVp und einer Belichtungszeit von 200 ms.
3. Führen der Bildaufnahme mit dem μCT Scanner mit einer 20-um-Auflösung und mit einer 0,5 mm Al-Filter.
4. Rekonstruieren Sie das Bild und visualisieren ^11.
5. Sobald der μCT Scanvorgang abgeschlossen ist, Entkalkung mit 5% EDTA und 4% Saccharose in PBS (pH 7,4) für 2 Wochen.

6. Gewebeverarbeitung und Färbung

1. Einbetten der entkalkt Gewebe in Paraffin. Vor dem Einbetten, schneiden Sie den Oberkiefer durch einen sagittalen Schnitt sofort auf den ersten Molaren anterioren machen. Während die Einbettung positionieren diese Fläche nach unten, so dass der Längsschnitt des ersten Molaren ist die Schnittfläche.
2. Mit dem Mikrotom, bereiten 5 um dicke Folien. Die Zellstoff-Capping Bereiche übereinstimmen in der Regel mit dem distopalatal (DP) Wurzel, die als Orientierungspunkt verwendet werden kann. Bestimmen Sie den genauen Bereich von Interesse durch die Histologie unter dem Lichtmikroskop zu untersuchen und die μCT Bilder zu vergleichen.
3. Für H & E-Färbung, Deparaffinize und die Folien mit Xylol (2x) rehydrieren und seriell verdünnt Ethanol (100% EtOH 2x, 95% EtOH 2x, und 70% EtOH 1x).
4. Spülen Sie die Folien mit fließendem Leitungswasser.
5. Fleck mit Hämatoxylin-Lösung für 2,5 min und Spülen mit Leitungswasser.
6. Tauchen der Objektträger in 95% Ethanol für 1 min.
7. Fleck mit Eosin-Lösung für 1 min und Spülen mit Leitungswasser.
8. Entwässern mit seriell verdünnten Ethanol (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x und 100% EtOH 3x) und Xylol (3x).
9. Montieren Sie die Folien mit Befestigungslösung.

Ergebnisse

Hier haben wir gezeigt, die Schritt-für-Schritt-Verfahren Zellstoff zur Durchführung an Mäusen Zähne Capping. Einer der wichtigsten Aspekte der Zellstoff bei Mäusen Capping ist die entsprechende Vorrichtung haben. In dieser Hinsicht mit einem 10fach-facher Vergrößerung des Mikroskops ist von wesentlicher Bedeutung (Abbildung 1A). Um eine Klasse-I-like Vorbereitung in den Zahn zu erstellen, verwendeten wir eine ¼-Runde Grat in einem elektrischen Hochgeschwindigkei...

Diskussion

Derzeit gibt es mehrere verschiedene experimentelle Modelle zur Verfügung , um die in vivo - Effekte von Dentalmaterialien, Gerüste oder Wachstumsfaktoren auf odontogene Differenzierung von Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs) ¹³ zu validieren. Diese Modelle sind mit ektopischen autologe Transplantation von DPSCs in ein Organ, wie die Nierenkapsel oder subkutane Transplantation von DPSCs in immunsupprimierten Mäusen mit Gerüsten ^14,15. Jedoch sind diese Verfahren begrenzt, daß ihre Wirkung a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BM-LED stereo microscope	MEIJI Techno		Microscope
Optima MCX-LED	Bien Air Dental	1700588-001	Electic motor engine
isoflurane	Henry schein animal health	NDC 11695-0500-2
1/4 round bur	Brasseler	001092T0
Endodontic K-file	Roydent	98947
ProRoot MTA	Dentsply	PROROOT5W	MTA
Paper point	Henry schein	100-3941
Ultra-Etch	Ultradent product Inc.		Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlus	Kerr	29669	Adhesives
Coltolux LED	Coltene/whaledent Inc.	C7970100115	Curing light unit
Characterization tint	Bisco	T-14012	Flowable composite
Skyscan	Breuker	1275	uCT scanner
Microm	Thermo	HM355S	Microtome
Hematoxyline-1	Thermo Scientific	7221
Eosin-Y	Thermo Scientific	7111
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-16	Mounting solution