Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

Riepilogo

Descriviamo un metodo passo-passo di eseguire incappucciamento diretto su topi denti per la valutazione della polpa guarigione della ferita e la formazione dentina riparativa in vivo.

Abstract

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

Introduzione

Dental caries are one of the most prevalent oral diseases and the leading cause of surgical interventions to dentitions in almost all individuals^1,2. The prognosis of surgical interventions and restorations of a tooth largely depends upon proper pulpal response and successful wound healing. Indeed, dental caries that penetrate deeply through the enamel and dentin frequently lead to the exposure of the underlying pulp tissue that is often "capped" with dental materials, such as calcium hydroxide (Ca(OH)₂) or hydraulic calcium-silicate cements (HCSCs), including mineral trioxide aggregates (MTA). The ultimate goal of such a pulp-capping procedure is to expedite pulpal wound healing by regenerating reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" to protect the underlying pulp tissue and to increase the life expectancy of the tooth and the overall oral health. However, the underlying mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is not fully understood.

To better understand the mechanisms of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo, several animals were previously used, including monkeys, dogs, and pigs^3-5. Among them, rats are frequently used because they are relatively smaller in sizes compared to the other animals, but their teeth are large enough to perform direct pulp capping without any technical difficulties^6-10. These animal models are ideal alternatives to human studies for examining pulpal responses and reparative dentin formation. However, their utilization is limited to observational studies at the cellular level, and they scarcely provide mechanistic insights during reparative dentin formation at the molecular level.

Recent technical advances in genetic engineering provided invaluable and indispensable research tools-mice that harbor a gene that is either overexpressed or deleted-that are instrumental to studying molecular mechanisms of human diseases in vivo. The numbers of different strains of transgenic or knockout mice that are strategically inducible in a cell-specific manner are continually growing in the scientific community. Therefore, examining pulpal wound healing and reparative dentin regeneration in these mice would greatly help to expedite our understanding of these processes at the molecular level. However, the use of mice is significantly dampened, as performing a pulp-capping procedure on a mouse tooth is technically challenging due to its miniature size. Here, we present our reproducible method of performing direct pulp capping in mice for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Protocollo

I topi sono stati acquistati da Jackson Laboratory e conservati in un Vivarium priva di agenti patogeni e la Divisione di Medicina di Laboratorio UCLA animali (àlam). Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali approvate dal comitato per la ricerca degli animali del Cancelliere (ARC # 2016-037).

1. mouse anestesia

1. Utilizzare otto settimane di età femminile topi C57 / BL6 (n = 3).
2. Anestetizzare i topi utilizzando soluzioni (5 mg / kg di peso del mouse) ketamina (80-120 mg / kg di peso del mouse) / xilazina e somministrare per via intraperitoneale (ip) alla dose di 10 ml / kg.
3. Preparare ketamina (80 - 120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluzioni e somministrarli via intraperitoneale (ip) alla dose di 10 ml / kg.
4. Verificare che i topi sono completamente anestetizzati eseguendo un pinch punta.

2. Procedura Pulp-tappatura

1. Posizionare il supporto bocca nella bocca del mouse.
2. Fissare il supporto bocca sul tavolo in modo che l'haL'annuncio è rivolto verso l'alto.
3. Posizionare il microscopio (10X) sulla parte superiore della bocca in modo che il primo molare superiore è completamente visibile.
4. Uso del ¼-tutto fresa in un manipolo ad alta velocità a 200.000 rpm, rimuovere la parte smalto del dente nel mezzo finché la polpa è visibile attraverso la dentina trasparente. Non esporre la polpa con la fresa.
5. Utilizzo di un K-file di endodonzia # 15 (diametro di 150 micron), forare attraverso la dentina ed esporre la polpa.
   NOTA: Particolare attenzione dovrebbe essere presa in modo che i detriti dentina non viene spinto nella polpa. Ciò può essere evitato ruotando il file K trimestrale e quindi tirando il K-FILE out.
6. Mescolare MTA con H ₂ O sterile secondo le istruzioni del produttore. Consegnare e posizionare il MTA sulla polpa esposta con la punta di un esploratore. Utilizzare il lato posteriore del cono di carta (fine) per imballare la MTA nella polpa esposta con lievi colpetti. Il lato più spesso del punto di carta sia piatta e quindi consenteper il corretto condensazione del MTA nella polpa esposta.
7. Etch il dente per 15 s posizionando il mordenzante acido fosforico al 35% dove solo copre il dente. Fare particolare attenzione a limitare il posizionamento del mordenzante, in quanto può irritare i tessuti gengivali.
   NOTA: Il mordenzante viene in una siringa e viene utilizzato per irruvidire superfici dentali in modo che gli adesivi dentali possono fluire in mediare bonding micromeccanica sul dente. Poiché sono viscoso, può essere indipendente applicando piccole quantità direttamente sul dente.
8. Utilizzare aspirazione negativo-pressione per rimuovere il mordenzante. Utilizzare un batuffolo di cotone che viene leggermente imbevuto con H ₂ O per rimuovere i residui del mordenzante. Ripetere questa operazione fino a quando il mordenzante viene completamente rimosso dal dente.
9. Utilizzando un panno di aria compressa, asciugare delicatamente il dente.
10. Applicare gli adesivi dentali utilizzando retro della punta di carta.
11. Rendere lo strato adesivo sottile con aria compressa per 3 s.
12. Cure gli adesivi dentali per 20 s utilizzando l'unità di polimerizzazione-luce.
13. Posizionare il composito fluido in piccole quantità sul dente che è stato ricoperto con MTA. Utilizzare la punta di un esploratore di fluire il composito nelle scanalature dei denti.
14. Curare il composito per 30 s usando una unità fotopolimerizzabile per polimerizzare esso. Verificare che il composito è completamente guarito e duro con l'esploratore.

3. Post-op cura

1. Somministrare Carprofen (5 mg / kg) per via sottocutanea (SC) immediatamente dopo la procedura pulp-capping.
2. Mettere i topi su una piastra elettrica a bassa potenza per tenere gli animali al caldo prima che si svegliano.
3. Riportare i topi per vivaio per l'edilizia abitativa.

4. Tissue Procurement

1. Dopo 5 - 6 settimane eutanasia i topi mediante dislocazione cervicale in una condizione di anestesia completa con isoflurano.
2. Rimuovere con attenzione il mascellare superiore fuori dalla base del cranio e metterlo in un tubo da 50 ml. Fissare il entire mascellare che contiene sia il dente pasta-livellata e dente uncapped controlaterale in 4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4, a 4 ° C per una notte, e quindi memorizzare in una soluzione di etanolo al 70%.
   NOTA: Paraformaldeide è tossico e cancerogeno. L'uso corretto paraformaldeide deve essere monitorata come descritto nelle procedure operative standard (SOP).
3. Eseguire la scansione del mascelle mouse utilizzando la scansione μCT. Per fissare il mascelle durante la scansione, avvolgere i campioni con una garza imbevuta con il 70% di etanolo e metterli nel tubo di coltura cellulare da 15 ml.

5. μCT Scansione

1. Preparare i campioni per la scansione μCT. In breve, avvolgere i campioni con una garza imbevuta con il 70% di etanolo e fissarli in un generico coltura cellulare tubo conico da 15 ml. Montare il tubo sul palco scansione μCT, come indicato nelle istruzioni del produttore.
2. Impostare la sorgente di raggi X per una corrente di 145 μA, una tensione di 55 kVp, e un tempo di esposizione di 200 ms.
3. Eseguire acquisizione di immagini con lo scanner μCT con una risoluzione di 20 micron e con un filtro Al 0,5 mm.
4. Ricostruire l'immagine e visualizzarla ^11.
5. Una volta che la scansione μCT, avviare la decalcificazione con 5% EDTA e 4% di saccarosio in PBS (pH 7,4) per 2 settimane.

6. Trattamento dei tessuti e la colorazione

1. Incorporare i tessuti decalcificati in paraffina. Prima di embedding, tagliare mascellare effettuando un taglio sagittale immediatamente anteriore al primo molare. Mentre incorporamento, posizionare questa superficie verso il basso, in modo tale che la sezione longitudinale del primo molare è la superficie di taglio.
2. Utilizzando il microtomo, preparare 5 scivoli micron di spessore. Le aree polpa-tappatura solito coincidono con la radice distopalatal (DP), che può essere utilizzato come punto di riferimento. Determinare l'area precisa di interesse esaminando l'istologia sotto il microscopio ottico e confrontando le immagini μCT.
3. Per colorazione H & E, deparaffinize e reidratare i vetrini con xilene (2x) ed etanolo in serie diluito (100% EtOH 2x, il 95% EtOH 2x, e il 70% EtOH 1x).
4. Sciacquare i vetrini con acqua corrente.
5. Macchia con la soluzione ematossilina per 2,5 minuti e risciacquare con acqua di rubinetto.
6. Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 1 min.
7. Macchia con la soluzione Eosina per 1 minuto e sciacquare con acqua di rubinetto.
8. Disidratare con etanolo serialmente diluito (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, e il 100% EtOH 3x) e xilene (3x).
9. Montare i vetrini con soluzione di montaggio.

Risultati

Qui, abbiamo dimostrato le procedure passo-passo per eseguire polpa di tappatura su topi denti. Uno degli aspetti chiave della polpa di tappatura nei topi è di avere l'apparato adeguato. A questo proposito, avendo il microscopio con un ingrandimento di potenza 10X è essenziale (Figura 1A). Per creare una preparazione di Classe-I-come nel dente, abbiamo utilizzato una fresa da ¼ di giro in un manipolo elettrico ad alta velocità a 200.000 giri al minuto (Fi...

Discussione

Attualmente, ci sono diversi modelli sperimentali differenti disponibili per convalidare gli effetti in vivo di materiali dentali, ponteggi, o fattori di crescita sulla differenziazione delle cellule staminali odontogena polpa dentale (DPSCs) ^13. Questi modelli includono ectopica trapianto autologo di DPSCs in un organo, come la capsula renale, o il trapianto sottocutaneo di DPSCs in topi immunocompromessi con ponteggi ^14,15. Tuttavia, questi metodi sono limitate dal fatto che il loro effe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BM-LED stereo microscope	MEIJI Techno		Microscope
Optima MCX-LED	Bien Air Dental	1700588-001	Electic motor engine
isoflurane	Henry schein animal health	NDC 11695-0500-2
1/4 round bur	Brasseler	001092T0
Endodontic K-file	Roydent	98947
ProRoot MTA	Dentsply	PROROOT5W	MTA
Paper point	Henry schein	100-3941
Ultra-Etch	Ultradent product Inc.		Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlus	Kerr	29669	Adhesives
Coltolux LED	Coltene/whaledent Inc.	C7970100115	Curing light unit
Characterization tint	Bisco	T-14012	Flowable composite
Skyscan	Breuker	1275	uCT scanner
Microm	Thermo	HM355S	Microtome
Hematoxyline-1	Thermo Scientific	7221
Eosin-Y	Thermo Scientific	7111
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-16	Mounting solution