הדגם הארנב של טרשת עורקים מואצת: מבט מתודולוגי הפגיעה בעורק Iliac בלון

Summary

מודלים חייתיים של טרשת עורקים חיוניים כדי להבין את המנגנון וכדי לחקור גישות חדשות כדי למנוע התפתחות פלאק או קרע, סיבת המוות המובילה בעולם המתועש. פרוטוקול זה משתמשת בשילוב של בלון פציעות ותזונה עשירה כולסטרול לזירוז טרשת עורקים הפלאק בעורק iliac ארנב.

Abstract

תסמונת כלילית חדה הנובע סגר התקף לב בעקבות התפתחות טרשת עורקים פלאק, הקרע הוא הגורם המוביל למוות בעולם המתועש. ניו זילנד הלבן (NZW) ארנבים נמצאים בשימוש נרחב כמודל בעלי חיים לצורך המחקר של טרשת עורקים. הם לפתח נגעים ספונטנית כאשר נמאס תזונה atherogenic; עם זאת, הדבר דורש זמן רב של 4-8 חודשים. עוד לשפר ולהאיץ atherogenesis, שילוב של דיאטה atherogenic ופציעה אנדותל מכני הוא מועסק לעיתים קרובות. ההליך הציג להשראת הפלאק טרשת עורקים בארנבים משתמש צנתר בלון כדי לשבש את אנדותל בעורק iliac השמאלי של ארנבים NZW נמאס תזונה atherogenic. כזו פגיעה מכנית בבלון הקטטר גורמת שרשרת של תגובות דלקתיות ייזום neointimal הצטברות שומנים בדם באופן תלוי זמן. טרשת עורקים פלאק בעקבות פציעה בלון הצג עיבוי neointimal עם חדירת שומנים נרחב, תוכן תא שריר חלק גבוה ונוכחות של מקרופאג נגזר תאי קצף. טכניקה זו פשוטה, לשחזור ומייצרת רובד של אורך מבוקרת בתוך העורק iliac. כל התהליך הושלם בתוך 20-30 דקות. ההליך הוא בטוח עם התמותה נמוכה וגם מציע הצלחה גבוהים בהשגת נגעים intimal משמעותי. ההליך של בלון קטטר המושרה גורמת פגיעה עורקים טרשת עורקים בתוך שבועיים. מודל זה יכול לשמש עבור חוקרים המחלה פתולוגיה, אבחון והדמיה והערכת אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

Introduction

קרע של פגיעה הפלאק טרשת עורקים הוא אחד הגורמים המובילים. למוות המדינות המתועשות¹. למרות מחקר במהלך העשורים האחרונים סעדנו מספר הסלולר המולקולריים המנגנונים המעורבים בהתקדמות פלאק, המשיכו מאמצי עדיין נדרשים לא רק לפענח מנגנון מורכב של התקדמות המחלה, אלא גם כדי לבדוק חדש טיפולית גישות. הוצעו מספר מודלים בבעלי חיים כדי ללמוד על טרשת עורקים. מניפולציה גנטית, כולסטרול האכלה או מכני אנדותל פגיעה הן האסטרטגיות סטנדרטי המשותפים ביותר חייתיים של טרשת עורקים לרבות עכברים, ארנבים או minipigs. בין אלה, NZW ארנבונים רגישים כולסטרול בתזונה בזמן רגיל חולדות ועכברים לא משמעותית לספוג כולסטרול תזונתיים-^2,-^3,-⁴. ארנבים לפתח באופן ספונטני אבי העורקים נגעים עשיר מקרופאגים עם רכיבים מסוימים סיבי כאשר נמאס כולסטרול-דיאטה עשירה-^5,-⁶. אולם, הפעם זמן הכנה של 4-8 חודשים כדי לגרום plaquesby טרשת עורקים האכלה כולסטרול דיאטה לבד^6,7 הוא חיסרון גדול עבור רוב ההגדרות ניסיוני. במרדף להשראת נגעים בזמן קצר יחסית, שילוב של תזונה כולסטרול גבוה ופציעות בלון פותחה על ידי Baumgarter ו Studer⁸. המטרה הכוללת של טכניקה זו היא זירוז טרשת עורקים הפלאק מורכב תאי קצף (בדומה פס שומני אצל בני אדם) בארנבים hypercholesterolemic בתוך 2 שבועות. הטכניקה הנוכחי מתאר את ההליך של פגיעה בקיר עורקים מבוסס על השיטה של Baumgarter באמצעות צנתר בלון התקדמו לתוך העורק iliac ארנבים hypercholesterolemic NZW.

יחד עם דיאטה עשירה כולסטרול, פגיעה הנובעת דה-endothelialization בלון המושרה יוביל טרשת עורקים. בלון פציעה מאיצה היווצרות טרשת עורקים, ומייצרת רובד של גודל אחיד והפצה. עיבוי intimal מעלה על פני תקופה של זמן ומתחיל חדירה לתא intimal בתוך כמה ימים בעקבות פגיעה. פסי שומן עם מקרופאגים ניכר מתחילים להופיע לאחר 7-10 ימים של פגיעה בלון, מיוצגים בתור הנגע מסוג II על פי הסיווג על ידי איגוד הלב האמריקאי. בלון פציעה על הארנב מבוצע לעתים קרובות באבי העורקים ללמוד קומפוזיציה פלאק. אנדותל neointimal מבטא רמות גבוהות של מולקולה אדהזיה המערכת. הפלאק משויכות לנתיחה המדיאלי ושינויים adventitial. טרשת עורקים מורכבים שומנים, מתרבים חלק תאי שריר (SMCs), סיבי קולגן ותאים דלקתיים להצטבר מתחת אנדותל regenerated, הם בעיקר מסוג II בטבע. התפלגות טופולוגי של הפלאק הארנב היה דומה לזה דיווח aortas האנושי ^9,,¹⁰ , באופן עקרוני, אבי העורקים גדולה בהשוואה ל- iliac העורקים יפיק פלאק אורך גדול יותר. עם זאת, היתרון העיקרי של שימוש העורק iliac כמו האתר של טרשת עורקים בארנבים הוא הנגישות שלה, לכימיקל בתוכן שרירי האדם עורקים¹¹, התפתחות הנגע אחיד¹², רקמות גבוה גורם פעילות¹³ וממד כלי עקבי המקבילה האנושית העורק ומאפשר הערכת מיוצרים באופן מסחרי להתקני morphometric ונקודות קצה angiographic. השיטות פולשני ו פולשני נחקרו כדי לנתח את לוחות העורקים iliac ארנב החיה בשידור חי. בדו"חות קודמים לתאר את השימוש תהודה מגנטית הדמיה (MRI) בעזרת מערכת מר טסלה-2.35 ¹⁴ בנוסף, אולטרסאונד קרישה תוך-כלית (IVUS) או אופטית קוהרנטית טומוגרפיה (אוקטובר) קטטרים יכולים להיות כראוי שהוחלו על התמונה לוחות טרשת עורקים העורקים iliac ארנב. העורק iliac נגיש עבור אולטראסאונד הדמיה בעת שימוש של echography ברזולוציה גבוהה, אבי העורקים ניתן לסייר גם בטכניקה זו.

בעשור האחרון, מודל זה ארנב הפגיעה בלון סייעה עוד יותר להבין את המנגנונים של פלאק התקדמות¹⁵ו פלאק רגרסיה¹⁶. בנוסף, הדגם שימש כדי לחקור את ההשפעה של הרומן סוכני טיפולית כמו סטטינים, טסיות סטנדרטי, נוגד חמצון סוכנים^17,18 ו סטנטים משחררי כגון everolimus או zotarolimus eluting^19,סטנט²⁰ על עיבוי neointimal. מודל זה שימש גם לחקור קרישה תוך-כלית הדמיה של זריחה-סגול הדמיה קטטר²¹.

Protocol

פרוטוקול נסיוני זה אושרה על ידי המשרד הווטרינרי הקנטונים, פריבורג ומרכז השוויצרי הפדראלי וטרינרית Office, שוויץ (FR 2015/58).

הערה: ארנבונים זכר NZW במשקל בין 2.8 ל 3.2 ק ג שימשו. החיות שוכנו בתנאים רגילים (אור 12 h ומחזור כהה, סיפק מזון ומים ad libitum). לפני חסיפה בלון, בעלי חיים היו שאמבטיה במשך שבוע, במהלכו הם האביסו דיאטה רגילה צ'או. אחרי שבוע 1 של הסתגלות, ארנבים הוחלפו לתזונה atherogenic המורכב של שומן גבוהה (8.6%), רווי חומצות שומן תזונה כולסטרול (1%) 205 מ"ג/ק"ג למשך כל המחקר. בלון פגיעה בעורק השמאלי iliac בוצעה 1 שבוע לאחר דיאטה החניכה, חיות הוקרבו לאחר 2 שבועות או 4 שבועות של בלון פציעה.

1. הליכים לפני הניתוח

1. לעקר כל מכשירי ניתוח לפני השימוש מעקר חרוז זכוכית או מכשיר מתאים אחרים.
2. הכן לבדוק את מכלול קטטר בלון.
   1. צרף מנעול סכינים סטריליים 1 מ"ל מזרק מלא עם תמיסת מלח לחלק נעל-סכינים סטריליים של הקטטר בלון. בזהירות לפקח על ההיעדרות האוויר לכודה. בדוק את הדליפות ולהבטיח האינפלציה בלון נאותה על ידי לחיצה על הבוכנה של המזרק.
3. שוקל את הארנב ותדליק את thermopad ל- 37 מעלות צלזיוס.
4. להשתמש פתרון הבופרנורפין-ריכוז של 0.3 mg / ml. תזריק מנה של 0.01 מ"ג/ק"ג subcutaneously.
5. Anesthetize הארנב עם 5% איזופלוריין ו- 5 L/דקה O ₂ חדר אינדוקציה במשך 10-15 דקות
6. הצב את הארנב anesthetized על כרית חימום שמרה על פלטפורמת כירורגי. מקם את התיקון ואת קליפים כדי לפקח על טמפרטורה, נשימה ו רל.
7. לצרף את החוטם של הארנב מסיכת פנים מחובר למכונה אלחוש מתאימים. לשמור על ההרדמה עם איזופלוריין (4.0% עם 2.5 L/דקה O ₂). לאשר ההרדמה המתאים (שצוין על-ידי חוסר טונוס שרירים ואובדן רפלקסים איסור פרסום ו- pinnae).
8. להחיל משחה אופטלמולוגיות בשתי העיניים כדי למנוע ייבוש של הקרנית. לעטוף את הארנב עם סדין כירורגי סטרילי עם רק את האיבר התחתון חשוף.

2. פרוטוקול כירורגי

1. להסיר השיער מאזור הגחון מתחת המפרקים בברך בעזרת קוצץ שיער בעלי חיים.
2. לנגב את האזור עם חומר חיטוי מתאים כדי לנקות את העור ולהסיר ופזור.
3. אתר העורק saphenous גדולות, עושים חתך קטן בעור של כ 1.5 ס מ אורך באמצעות אזמל.
4. לחשוף רק חלק קטן של עורק saphenous גדולות עם מלקחיים קטנים מעוקלים מבלי להזיק את וריד הירך ואת העצב הירך.
5. מקום שתי לולאות קשירה רופף (5-0 משי) מתחת העורק saphenous גדולות, קושרים לולאה אחת קשירה לקראת הקצה הדיסטלי של העורק. מניחים מעל הקשירה לעצור את זרימת הדם של העורק iliac מלחציים microvascular.
6. Topically להחיל טיפה אחת של papaverine להתרחב העורק וכדי למנוע vasospasm.
7. להרים את העורק saphenous בעזרת קשירה קשור ולהערכת לעשות חתך קטן arteriotomy שימוש בגודל 24 המחט.
8. העלה את המדפים החתך עם מלקחיים בסדר ולהוסיף לאט איסוף וריד או מחט המנחה לתוך לומן של העורק.
9. להכניס צנתר עורקי הכריתה פוגרטי צרפתית 2 העורק saphenous גדולות. להסיר את הווריד פיק, סוגרים microvascular.
10. לקדם הקטטר עד הסימן השישי (20-25 ס מ) המתאים למיקום בערך 2-5 ס מ מעל ההסתעפות iliac.
11. לנפח את הבלון עם 0.1 מ"ל תמיסת באמצעות מזרק 1 מ"ל או בלחץ נומינלי של 6 atm באמצעות וסת פרסיזיון ידנית מוסדר כפי שמתואר ^{16 , 22}-
12. החזק את הצנתר בלון עם מלקחיים וגרור עד 6 ס מ דרך arterytoward iliac את נקודת החדירה, תוך כדי סיבוב את הצנתר.
13. השטחת קצה את הבלון על ידי למשוך בחזרה על הבוכנה של המזרק.
14. חזור על שלבים 2.10 כדי 2.13 שלוש פעמים כדי לוודא חסיפה אנדותל מלאה.
15. להסיר את הצנתר ועניבה מיד הלולאה קשירה מעל האתר arteriotomy כדי לעצור את הדימום.
16. החל מתאימים חיטוי מסביב הפריפריה של הפצע, דגימה משם קרישי הדם. סגירת החתך בעור בתפר 5-0, ולחטא אתר הניתוח עם povidone יוד פתרון.
17. חזור על שלבים 2.1 כדי 2.16-contralateral iliac באמצעות צנתר חדש.
18. דגימה המשחה אופטלמולוגיות מעיני.

3. טיפול לאחר הניתוח

1. לניהול sulfadoxine 40 מ"ג/ק"ג, ילדים מתחת לגיל 8 מ"ג/ק"ג או כל אנטיביוטיקה מתאימה אחרים מיד לאחר הליך כירורגי.
2. במהלך תקופת התאוששות הרדמה, לשמור את הארנב מעל כרית החימום מניחים בתוך כלוב נקי בלוק.
3. להסיר את תיקון ניטור ואת קטעי.
4. לאחר התאוששות, להחזיר את הארנבים לכלובים שלהם הביתה. מזריקים subcutaneously הבופרנורפין 0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג פרסם - שמעשית כל 6-12 h עבור 48 ה המשך דיאטה atherogenic עוד שבועיים או ארבעה שבועות.

4. קצירת רקמות והרכב ניתוח של פלאק

1. אחרי שבועיים (עבור לוח דק מוקדם) או שלושה שבועות של פגיעה בלון, עזים ומתנגד הארנב באמצעות איזופלוריין בצורה דומה, כפי שתואר לעיל.
2. פתח את חלל בית החזה, המתת חסד הארנבים לדימום intracardial.
3. לבודד את העורקים. iliac כמתואר ב- ²³.
   1. בקצרה, לפתוח את הבטן ולחשוף את מקבץ. לאתר העורקים לכיוון ההסתעפות iliac ולקשור אותו מעל ההסתעפות. הסר בזהירות את הרקמות הסובבות לחשוף ולבודד את העורקים iliac שני.
4. Dissect החוצה שני העורקים iliac, לטבול אותם קפואים פוספט buffered תמיסת מלח. הסר את הקרישים בעזרת מלקחיים. לחלק את העורק iliac כל 4-6 מקטעים כדי לאפיין את עובי הפלקיו לאורך העורק.
5. מיד להטביע את מקטעי עורקי בתוך תבנית המכילה טמפרטורה אופטימלית חיתוך במתחם, snap-הקפאה בעזרת חנקן נוזלי ולשמור אותו ב-70 ° C. להכין 5 מיקרומטר עבה למקטעים באמצעות cryostat כמתואר ב- ²⁴-
היסטולוגיה
6. בצע, immunofluorescence או immunohistochemical מכתים morphometry, פלאק השומנים של תכנים סלולריים כפי שמתואר ^{10 , 25}-
   הערה: בקצרה, לשטוף את הסעיפים עורקי בתמיסת פוספט buffered (PBS) ו permeabilize באמצעות 0.2% טריטון. לשטוף את הסעיפים עם PBS, לחסום אתרים שאינם ספציפיים עם אלבומין שור 2% במשך 30 דקות Incubate הסעיפים עבור h 1 ב 37 ° C עם אנטי-α-SM אקטין (1:200) או נוגדן RAM11 (1:200). לשטוף את הסעיפים עם PBS, דגירה אותם עם נוגדן המשני המתאים למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לשטוף שוב עם PBS ולהוסיף Hoechst (5 µg/mL) למשך 10 דקות לזהות גרעינים.

תוצאות

בלון פציעה של העורק iliac בוצעה בהצלחה ללא סיבוך (איור 1). הזמן פעיל הכולל נע בין 20 ל 30 דקות עבור פציעות הופיעה על ציר iliac אחד בלבד, 35 עד 45 דקות עבור פציעות על שני העורקים. הארנב החלים בתוך 1 h לאחר פציעה בלון. כל בעלי החיים הופיעה בריא ללא ירידה משמעותית במשקל. המע?...

Discussion

המודל של טרשת עורקים עורק iliac ארנב נעשה שימוש נרחב במחקר טרשת עורקים. עם פרוטוקול זה הארנבים התפתחה במהירות הפלאק קשות ומתקדמות יותר לעומת נגעים ספונטנית פיתח עם רק כולסטרול בתזונה. חשוב לציין, חיות להתאושש במהירות הניתוח.

הגירוי העיקריות של atherogenesis היא פגיעה מכנית הקטטר בל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White rabbits	Charles River laboratories,France	Cre:KBL(NZW)
Cholesterol rich diet	Ssniff spezialdiäten	Ssniff EF K High Fat and Cholesterol
Glass bead sterilizer-Germinator 500	VWR, Leicestershire, UK	101326-488
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French	Edwards Lifesciences, Switzerland	120602F	For single use only
Luer Lock Syringe	Becton, Dickinson and Company, USA	309628
Thermopad Type 226	Solis, Switzerland AG	397387
Buprenorphine- Temgesic	Reckitt Benckiser AG, Switzerland	7.68042E+12
Isoflurane	Piramal Critical Care, Inc, Bethlehem, PA 18017	2667-46-7
Anaesthesia machine-combi-vet Base Anesthesia System	Rothacher Medical GmbH, Switzerland	CV 30-301-A
Cardell touch veterinary vital signs monitor	Midmark, Ohio, USA	8013-001
Ophthalmic ointment-Humigel	Virbac, France
Animal hair clippers	Aesculap AG, Germany	GT420
Disinfectant-Betadine solution	MundipharmaMedicalCompany, Switzerland	14671-1203
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
Medium and small microscissors	Medline International Switzerland Sàrl	UC4337
Microvascular clamps	FST, Germany	18051-28
Papaverine	ESCA chemicals, Switzerland	RE 356 803
Vein Pick	Harvard Apparatus, Cambridge, UK	72-4169	For single use only
Saline	Laboratorium Dr. G. Bichsel AG, , Switzerland	1330055
Polysorb 5-0 suture	Covidien AG, Switzerland	UL 202	Monofilament
Sulfadoxine and Trimethoprim-Trimethazol	Werner Stricker AG, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'361
Antiseptic- Octenisept	Schülke & Mayr AG, Switzerland	GTIN: 4032651214068
Phosphate Buffered Saline	Roth	1058.1
Isobutanol-2-Methylbutane	Sigma-Aldrich, Switzerland	M32631-1L
Optimum Cutting Temperature compound-Tissue-Tek	VWR Chemicals, Belgium	25608-930
Cryostat	Leica, Glattbrugg, Switzerland	Leica CM1860 UV
Glass slide- Superfrost Plus	Thermo Scientific	4951PLUS4
Mayer's Haematoxylin	Sigma-Aldrich, Switzerland	MHS32-1L
Eosin 0.5% aq.	Sigma-Aldrich, Switzerland	HT110232-1L
Oil Red O	Sigma-Aldrich, Switzerland	O0625-25G
α-smooth muscle actin antibody	Abcam, UK.	ab7817
Macrophage Clone RAM11 antibody	DAKO, Switzerland	M063301
Hoechst	Abcam, UK.	ab145596
Goat polyclonal Secondary Antibody (Chromeo 546)	Abcam, UK.	ab60316
Alexa Fluor 488/547	Abcam, UK.
Glycergel Mounting Medium, Aqueous	DAKO, Switzerland	C056330
Hematoxylin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	H3136-25G
Ferric chloride for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	157740-100G
Iodine for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	207772-100G
Potassium iodide for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	60400-100G-F
Alcian blue for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	A5268-10G
Strong Ammonia for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	320145-500ML
Brilliant crocein MOO for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	210757-50G
Acid Fuchsin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	F8129-50G
Sodium Thiosulfate for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	72049-250G,
Phosphotungstic acid for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	79690-100G
Crocin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	17304-5G
EUKITT for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	03989-100ML