Das Kaninchen-Modell der beschleunigten Atherosklerose: methodischer Sicht der Beckenkamm Arterie Ballon Verletzung

Zusammenfassung

Tiermodelle der Atherosklerose sind notwendig, um den Mechanismus zu verstehen und zu untersuchen, neuere Ansätze zur Vermeidung Plaque Entwicklung oder Bruch, eine führende Ursache des Todes in der industrialisierten Welt. Dieses Protokoll verwendet eine Kombination von Ballon Verletzungen und Cholesterin-reiche Diät, um arteriosklerotische Plaques in Kaninchen Beckenkamm Arterie zu induzieren.

Zusammenfassung

Akutes Koronarsyndrom aus koronaren Okklusion nach Entwicklung von atherosklerotischen Plaques und Bruch ist die häufigste Todesursache in der industrialisierten Welt. New Zealand White (NZW) Kaninchen werden häufig als Tiermodell für das Studium der Arteriosklerose verwendet. Sie entwickeln spontanere Läsionen bei mit atherogenen Diät gefüttert; Dies erfordert jedoch langen Zeit von 4 bis 8 Monate. Um weiter zu verbessern und Atherogenese zu beschleunigen, wird häufig eine Kombination von atherogenen Diät und mechanische Endothelzellen Verletzungen eingesetzt. Das vorgestellte Verfahren zur Induktion arteriosklerotische Plaques bei Kaninchen verwendet ein Ballonkatheter, um das Endothel in der linken Beckenkamm Arterie NZW Kaninchen gefüttert mit atherogenen Diät zu stören. Solche mechanischen Schäden, die durch den Ballonkatheter induziert eine Kette von entzündlichen Reaktionen initiieren Neointimal Lipid-Akkumulation in einer Zeit abhängigen Art und Weise. Atherosklerotischen Plaques nach Ballon Verletzungen zeigen Neointimal Verdickung mit umfangreichen Lipid Infiltration, hohe Glattmuskel Zellinhalt und Vorhandensein von Makrophagen abgeleitete Schaumzellen. Diese Technik ist einfach, reproduzierbar und Plaque kontrollierten Länge innerhalb der Beckenkamm Arterie produziert. Das gesamte Verfahren ist innerhalb von 20-30 min abgeschlossen. Das Verfahren ist sicher mit einer niedrigen Mortalität und bietet auch hohen Erfolgsquote bei der Beschaffung von erheblichen Intima Läsionen. Das Verfahren der Ballonkatheter induzierten arteriellen Verletzung führt zu Arteriosklerose innerhalb von zwei Wochen. Dieses Modell eignet sich für die Untersuchung der Krankheit-Pathologie, diagnostische Bildgebung und neue therapeutische Strategien zu bewerten.

Einleitung

Bruch der gefährdeten arteriosklerotische Plaques gehört zu den häufigsten Todesursachen in den Industrienationen¹. Obwohl Forschung in den letzten Jahrzehnten mehrere molekulare und zelluläre Mechanismen beteiligt Plaque Fortschreiten entfaltet hat, weiterhin Anstrengungen sind noch erforderlich, nicht nur die komplexen Mechanismen der Progression der Erkrankung zu entwirren, sondern auch neue testen therapeutische Ansätze. Verschiedenen Tiermodellen sind vorgeschlagen worden, um der Arteriosklerose zu studieren. Genmanipulation, Cholesterin Fütterung oder mechanische Endothel Verletzungen sind die standard Strategien von am meisten Tiermodelle der Atherosklerose einschließlich Mäuse, Kaninchen oder Minischweine geteilt. Unter diesen sind NZW Kaninchen empfindlich auf Cholesterin-Diät, während normale Ratten und Mäuse nicht signifikant Cholesterin^2,3,4aufnehmen. Kaninchen entwickeln spontan Aorta Verletzungen reichen in Makrophagen mit einigen faserigen Komponente bei Fütterung mit Cholesterin-reiche Ernährung-^5,-⁶. Die lange Vorlaufzeit von 4-8 Monaten induzieren atherosklerotischen Plaquesby Fütterung Cholesterin Diät allein^6,7 ist jedoch einen großen Nachteil für die meisten experimentellen Einstellungen. In der Verfolgung zur Induktion Läsionen in relativ kurzer Zeit wurde eine Kombination aus hohen Cholesterin Diät und Ballon Verletzungen durch Baumgarter und Studer⁸entwickelt. Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist, arteriosklerotische Plaques bestehend aus Schaumzellen (ähnlich wie fetthaltige Streifen beim Menschen) bei normalem Kaninchen innerhalb von 2 Wochen zu induzieren. Die gegenwärtige Technik beschreibt das Verfahren der Arterienwand Verletzung basierend auf Baumgarter Methode mit einem Ballonkatheter rückte in den Beckenkamm Arterie von normalem Kaninchen NZW.

Zusammen mit einem Cholesterin-reiche Diät werden Verletzungen durch induzierte Ballon de Endothelialization zu Arteriosklerose führen. Ballon-Verletzungen beschleunigt die Bildung von atherosklerotischen Läsionen und produziert Plaque von einheitlicher Größe und Verteilung. Intima-Verdickung steigt über einen Zeitraum von Zeit und Intima Zelle eindringen beginnt innerhalb weniger Tage nach Verletzung. Fetthaltige Streifen mit erheblichen Makrophagen beginnen, nach 7-10 Tagen Ballon Verletzungsgefahr zu erscheinen und sind als Typ-II-Läsion nach der Klassifikation von American Heart Association vertreten. Ballon-Verletzung in Kaninchen erfolgt häufig in der Aorta Plaque Komposition zu studieren. Das Endothel Neointimal drückt hohe interzelluläre Adhäsionsmolekül. Die Plaketten sind mediale Dissektion und adventitial Änderungen zugeordnet. Atherosklerotische Läsionen bestehen aus Lipiden, wuchernden glatten Muskelzellen (SMCs), Kollagenfasern und Entzündungszellen, die unter das regenerierte Endothel ansammeln und sind meist Typ II in der Natur. Die topologische Verteilung von Kaninchen Plaques war ähnlich wie in menschlichen Hauptschlagadern ^9,10 im Prinzip berichtet, die Aorta ist größer im Vergleich zum Beckenkamm Arterien und Plaque in der größeren Länge produzieren würden. Der große Vorteil der Verwendung der Beckenkamm Arterie als Ort der Arteriosklerose bei Kaninchen ist jedoch ihre Zugänglichkeit, seine Ähnlichkeit im muskulären Inhalt menschliche Koronararterie¹¹, einheitliche Läsion Entwicklung¹², hohe Gewebe Faktor Aktivität¹³ und konsequente Schiff Dimension menschlichen Koronararterien ermöglicht die Bewertung der kommerziell hergestellten Geräte, morphometrische und angiographischen Endpunkte vergleichbar. Invasive und nicht-invasive Methoden wurden untersucht, um die Plaques in Kaninchen Beckenkamm Arterien im lebenden Tier zu analysieren. Frühere Berichte beschreiben die Verwendung von Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) mit Hilfe eines 2,35-Tesla Herr System ¹⁴ zusätzlich, intravaskulären Ultraschall (IVUS) oder optische Kohärenz Tomographie (OCT) Katheter können entsprechend auf Bild arteriosklerotische Plaques in Kaninchen Beckenkamm Arterien. Die Beckenkamm Arterie ist zugänglich für Ultraschall-Bildgebung bei Verwendung einer hochauflösenden Sonografie und die Aorta kann auch mit dieser Technik erkundet werden.

In den letzten zehn Jahren hat diese Kaninchen-Modell der Ballon Verletzungen um weiter zu verstehen, die Mechanismen der Plaque Fortschreiten¹⁵und Plaque Regression¹⁶. Darüber hinaus wurde das Modell verwendet, um die Untersuchung des Einflusses von neuartiger Therapeutika wie Statine, standard gerinnungshemmende Mittel, antioxidative Wirkstoffe^17,18 und Medikamente freisetzende Stents wie Everolimus oder Zotarolimus-eluting Stent^19,20 auf Neointimal Verdickung. Dieses Modell hat auch zur intravaskulären Bildgebung der Nah-Infrarot-Fluoreszenz imaging Katheter²¹zu untersuchen.

Protokoll

dieses experimentelle Protokoll genehmigt wurde, durch das kantonale Veterinäramt, Freiburg und der Swiss Federal Veterinary Office, Schweiz (FR 2015/58).

Hinweis: männliche NZW Kaninchen mit einem Gewicht von 2,8 bis 3,2 kg dienten. Die Tiere lebten unter herkömmlichen Bedingungen (12 h hell und dunkel-Zyklus, ad libitum Wasser und Essen zur Verfügung gestellt). Vor dem Ballon Denudation wurden Tiere für 1 Woche gewöhnt, in denen sie mit normalen Chow Diät gefüttert wurden. Nach 1 Woche der Akklimatisation Kaninchen auf atherogenen Diät bestehend aus fettreichen (8,6 %) umgestellt wurden, und gesättigte Fettsäuren mit 205 mg/kg (1 %) Cholesterin Diät für die gesamte Studiendauer. Ballon-Verletzung in der linken Beckenkamm Arterie war 1 Woche nach Beginn der Diät durchgeführt und nach 2 Wochen oder 4 Wochen Verletzungsgefahr Ballon Tiere geopfert wurden.

1. präoperative Verfahren

1. alle chirurgischen Instrumente vor Gebrauch mit einem Glas Bead Sterilisator oder andere geeignete Instrumente sterilisieren.
2. Vorbereiten und überprüfen Sie die Ballon-Katheter-Montage.
   1. Anfügen einer 1 mL-Luer-Lock-Spritze gefüllt mit normalen Kochsalzlösung auf den Luer-Lock-Teil des Ballonkatheters. Abwesenheit der eingeschlossenen Luft überwachen Sie sorgfältig. Überprüfen Sie die Dichtheit und richtigen Ballon Inflation durch drücken den Kolben der Spritze zu gewährleisten.
3. Wiegen die Kaninchen und schalten Sie die Thermopad auf 37 ° c
4. Verwenden eine Buprenorphin-Lösung mit einer Konzentration von 0,3 mg / ml injizieren eine Dosis von 0,01 mg/kg subkutan.
5. Anesthetize das Kaninchen mit 5 % Isofluran und 5 L/min O ₂ in eine Induktion Kammer für 10-15 min.
6. Legen die anästhesierten Kaninchen auf das Heizkissen auf die chirurgische Plattform gehalten. Legen Sie den Patch und Clips zur Überwachung der Temperatur, Atmung und Elektrokardiogramm.
7. Legen die Schnauze des Kaninchens auf eine Gesichtsmaske an eine geeignete Anästhesie-Maschine angeschlossen. Aufrechterhaltung der Narkose mit Isofluran (4,0 % mit 2,5 L/min O ₂). Richtige Anesthetization (gekennzeichnet durch Mangel an Muskeltonus und Verlust von Knebel und Ohrmuschel Reflexe) zu bestätigen.
8. Gelten ophthalmologischen Salbe für beide Augen auf der Hornhaut vor dem Austrocknen zu verhindern. Drapieren Sie die Kaninchen mit einem sterilen chirurgischen Blatt mit nur der unteren Extremität ausgesetzt.

2. Chirurgische Protokoll

1. Entfernen Sie die Haare aus dem ventralen Bereich direkt unterhalb der Kniegelenke mit tierischen Haarschneidemaschinen.
2. Wischen Sie die Fläche mit einem geeigneten Desinfektionsmittel zu reinigen die Haut und entfernen lose Haare.
3. Der saphenous Ader zu finden und machen einen kleinen Hautschnitt von ca. 1,5 cm Länge mit einem Skalpell.
4. Setzen Sie einen kleinen Teil des saphenous Ader mit kleinen gebogenen Pinzette ohne Beschädigung der femoral Ader und femoral Nerv.
5. Legen Sie zwei Lose Ligatur Schleifen (5-0 Seide) unterhalb der saphenous Ader und binden Sie eine Schleife der Ligatur am distalen Ende der Arterie. Legen Sie eine mikrovaskuläre Klammer über die Ligatur zu stoppen den Blutfluss aus dem Beckenkamm Arterie.
6. Topisch angewendet einen Tropfen des Papaverine, die Arterie zu dehnen und zu verhindern Vasospasmus.
7. Heben Sie die saphena Arterie mit Hilfe von gebundenen Ligatur und machen einen kleinen Arteriotomie Schnitt mit einem 24 gauge Nadel.
8. Erhöhen die Schnitt-Klappen mit feinen Zangen und langsam Vene Abholung oder eine leitende Nadel in das Lumen der Arterie einfügen.
9. Legen Sie 2 Französisch Fogarty arteriellen Embolectomy Katheter in der saphenous Ader. Entfernen Sie die Vene Pick- and -mikrovaskuläre Klemmen.
10. Fördern den Katheter bis die sechste Mark (20-25 cm), eine Position entspricht etwa 2 bis 5 cm über dem Beckenkamm Bifurkation.
11. Den Ballon aufblasen, mit 0,1 mL normale Kochsalzlösung mit einer 1 mL Spritze oder mit einem nominalen Druck von 6 atm mit einer geregelten manuelle Inflator, wie beschrieben in ^{16 , 22}.
12. Halten den Ballonkatheter mit Pinzette und ziehen Sie wieder um 6 cm über dem Beckenkamm Arterytoward Einfügepunkt beim Drehen des Katheters.
13. Entleeren des Ballons durch den Kolben der Spritze zurückziehen.
14. Wiederholen Sie die Schritte 2.10 bis 2.13 dreimal komplett endotheliale Denudation sicherzustellen.
15. Den Katheter entfernen und sofort binden die Ligatur Schleife oberhalb der Arteriotomie Website um Blutungen zu stoppen.
16. Gelten geeignet antiseptische alles rund um die Peripherie der Wunde und Tupfer entfernt das Blut gerinnt. Schließen Sie den Hautschnitt mit einem 5: 0-Naht, und desinfizieren der Chirurgie-Website mit Povidon-Jod-Lösung.
17. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 zu 2.16 auf der kontralateralen Beckenkamm mit einem neuen Katheter.
18. Tupfer die ophthalmologische Salbe aus Augen.

3. Postoperative Versorgung

1. verwalten Sulfadoxine 40 mg/kg und Trimethoprim 8 mg/kg oder jedes andere geeignete Antibiotikum unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff.
2. Während der Anästhesie Erholungsphase, halten Sie die Kaninchen über ein Wärmekissen in einem sauberen autoklaviert Käfig platziert.
3. Entfernen Sie die Überwachung Patch und Clips.
4. Nach seiner Genesung die Kaninchen zu ihrer Heimat Käfige zurückkehren. Injektion subkutan Buprenorphin 0,05 - 0,1 mg/kg post - operativ alle 6-12 h für 48 h weiter atherogenen Diät für weitere zwei Wochen oder vier Wochen.

4. Gewebe-Ernte und Analyse von Plaque Zusammensetzung

1. nach zwei Wochen (für frühe dünne Plaque) oder drei Wochen Verletzungsgefahr Ballon, die Kaninchen mit Isofluran in ähnlicher Weise wie oben beschrieben zu betäuben.
2. Der Brusthöhle zu öffnen und die Kaninchen durch Intracardial Entbluten einschläfern.
3. Isolieren die Beckenkamm Arterien, wie in ²³ beschrieben.
   1. Kurz, öffnen Sie den Bauch und das Retroperitoneum setzen. Spur der Aorta gegenüber der Beckenkamm Bifurkation und binden Sie es oberhalb der Bifurkation. Entfernen Sie vorsichtig das umliegende Gewebe zu entlarven und isolieren beide Beckenkamm Arterien.
4. Dissect aus beiden Beckenkamm Arterien und tauche sie in eiskalten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung. Die Klumpen mit Hilfe der Zange zu entfernen. Teilen Sie jede Beckenkamm Arterie in 4-6 Segmente, die Dicke der Beläge in der Arterie zu charakterisieren.
5. Sofort Einbetten der arteriellen Segmente in einer Form mit optimale Arbeitstemperatur zusammengesetzte, Snap-Freeze mit flüssigem Stickstoff und halten Sie es bei-70 ° C. bereiten 5 µm dicke Abschnitte mit einem Kryostaten, wie beschrieben in ²⁴.
6. Perform Histologie, Immunfluoreszenz oder immunhistochemischen Färbung für Morphometrie, Plaque Lipid und zelluläre Inhalt wie unter ^{10 , 25}.
   Hinweis: Kurz, spülen Sie die arteriellen Abschnitte mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und permeabilize mit 0,2 % Triton. Spülen Sie die Abschnitte mit PBS und blockieren Sie nicht bestimmte Websites mit 2 % Rinderserumalbumin für 30 min Inkubation in den Abschnitten für 1 h bei 37 ° C mit anti-α-SM Aktin (1: 200) oder RAM11 Antikörper (1: 200). Spülen Sie die Abschnitte mit PBS und inkubieren sie mit entsprechenden Sekundärantikörper für 30 min bei 37 ° c wieder mit PBS waschen und Hinzufügen von Hoechst (5 µg/mL) für 10 min, Kerne zu erkennen.

Ergebnisse

Ballon-Verletzung der Beckenkamm Arterie wurde ohne Komplikationen (Abbildung 1) erfolgreich durchgeführt. Die operative Gesamtzeit reichte von 20 bis 30 min für Verletzungen durchgeführt auf nur ein Beckenkamm Arterie und 35 bis 45 min für Verletzungen an beiden Arterien. Die Kaninchen erholte sich innerhalb 1 h nach Ballon-Verletzungen. Alle Tiere erschien ohne signifikanten Gewichtsverlust gesund. Keine Infektion, Ödeme oder arterielle Thrombose aufge...

Diskussion

Das Kaninchen Beckenkamm Arterie Arteriosklerose Modell ist in der Arteriosklerose Forschung verbreitet. Mit diesem Protokoll entwickelt die Kaninchen schnell schwere und erweiterte Plaques im Vergleich zu spontanen Läsionen mit Cholesterin-Diät entwickelt. Vor allem erholen Tiere schnell von der Operation.

Die wichtigsten Impulse für die Atherogenese ist die mechanische Schäden durch den Ballonkatheter, der verletzt des Endothels und glättet das Schiff Wand²⁶. Die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White rabbits	Charles River laboratories,France	Cre:KBL(NZW)
Cholesterol rich diet	Ssniff spezialdiäten	Ssniff EF K High Fat and Cholesterol
Glass bead sterilizer-Germinator 500	VWR, Leicestershire, UK	101326-488
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French	Edwards Lifesciences, Switzerland	120602F	For single use only
Luer Lock Syringe	Becton, Dickinson and Company, USA	309628
Thermopad Type 226	Solis, Switzerland AG	397387
Buprenorphine- Temgesic	Reckitt Benckiser AG, Switzerland	7.68042E+12
Isoflurane	Piramal Critical Care, Inc, Bethlehem, PA 18017	2667-46-7
Anaesthesia machine-combi-vet Base Anesthesia System	Rothacher Medical GmbH, Switzerland	CV 30-301-A
Cardell touch veterinary vital signs monitor	Midmark, Ohio, USA	8013-001
Ophthalmic ointment-Humigel	Virbac, France
Animal hair clippers	Aesculap AG, Germany	GT420
Disinfectant-Betadine solution	MundipharmaMedicalCompany, Switzerland	14671-1203
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
Medium and small microscissors	Medline International Switzerland Sàrl	UC4337
Microvascular clamps	FST, Germany	18051-28
Papaverine	ESCA chemicals, Switzerland	RE 356 803
Vein Pick	Harvard Apparatus, Cambridge, UK	72-4169	For single use only
Saline	Laboratorium Dr. G. Bichsel AG, , Switzerland	1330055
Polysorb 5-0 suture	Covidien AG, Switzerland	UL 202	Monofilament
Sulfadoxine and Trimethoprim-Trimethazol	Werner Stricker AG, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'361
Antiseptic- Octenisept	Schülke & Mayr AG, Switzerland	GTIN: 4032651214068
Phosphate Buffered Saline	Roth	1058.1
Isobutanol-2-Methylbutane	Sigma-Aldrich, Switzerland	M32631-1L
Optimum Cutting Temperature compound-Tissue-Tek	VWR Chemicals, Belgium	25608-930
Cryostat	Leica, Glattbrugg, Switzerland	Leica CM1860 UV
Glass slide- Superfrost Plus	Thermo Scientific	4951PLUS4
Mayer's Haematoxylin	Sigma-Aldrich, Switzerland	MHS32-1L
Eosin 0.5% aq.	Sigma-Aldrich, Switzerland	HT110232-1L
Oil Red O	Sigma-Aldrich, Switzerland	O0625-25G
α-smooth muscle actin antibody	Abcam, UK.	ab7817
Macrophage Clone RAM11 antibody	DAKO, Switzerland	M063301
Hoechst	Abcam, UK.	ab145596
Goat polyclonal Secondary Antibody (Chromeo 546)	Abcam, UK.	ab60316
Alexa Fluor 488/547	Abcam, UK.
Glycergel Mounting Medium, Aqueous	DAKO, Switzerland	C056330
Hematoxylin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	H3136-25G
Ferric chloride for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	157740-100G
Iodine for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	207772-100G
Potassium iodide for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	60400-100G-F
Alcian blue for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	A5268-10G
Strong Ammonia for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	320145-500ML
Brilliant crocein MOO for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	210757-50G
Acid Fuchsin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	F8129-50G
Sodium Thiosulfate for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	72049-250G,
Phosphotungstic acid for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	79690-100G
Crocin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	17304-5G
EUKITT for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	03989-100ML