O modelo de coelho da aterosclerose acelerada: uma perspectiva metodológica da artéria ilíaca balão lesão

Resumo

Modelos animais de aterosclerose são essenciais para entender o mecanismo e a investigar novos enfoques para evitar o desenvolvimento de placa ou ruptura, das principais causas de morte no mundo industrializado. Este protocolo utiliza uma combinação de lesão de balão e colesterol dieta rica para induzir ateroma na artéria ilíaca coelho.

Resumo

Síndrome Coronariana Aguda resultante da oclusão coronária após ruptura e desenvolvimento da placa aterosclerótica é a principal causa de morte no mundo industrializado. Coelhos Nova Zelândia branco (NZW) são amplamente utilizados como modelo animal para o estudo da aterosclerose. Eles desenvolvem lesões espontâneas quando alimentados com dieta aterogênico; no entanto, isso requer tempo de 4 a 8 meses. Para mais, melhorar e acelerar o atherogenesis, uma combinação de dieta aterogênico e lesão endotelial mecânica é frequentemente empregada. O procedimento apresentado para indução de ateroma em coelhos usa um cateter balão para perturbar o endotélio na artéria ilíaca esquerda de coelhos NZW alimentados com dieta aterogênico. Tais danos mecânicos causados por cateter balão induz uma cadeia de reações inflamatórias, iniciando o acúmulo de lipídios neointimal em uma forma dependente do tempo. Placa aterosclerótica seguindo balão lesão mostrar neointimal aumento do volume com lipídios extensa infiltração, conteúdo de célula de alta de músculo liso e presença de macrófagos derivados de células de espuma. Esta técnica é simples, Reproduzível e produz placa de comprimento controlada dentro da artéria ilíaca. Todo o processo é concluído no prazo de 20-30 min. O procedimento é seguro, com baixa mortalidade e também oferece elevado sucesso na obtenção de lesões da íntima substanciais. O procedimento do cateter balão induzida resulta de lesão arterial em aterosclerose dentro de duas semanas. Este modelo pode ser usado para investigar a patologia da doença, diagnóstico por imagem e avaliar novas estratégias terapêuticas.

Introdução

Ruptura das placas ateroscleróticas vulneráveis é uma das principais causas de morte no nações industrializadas¹. Embora pesquisas nas últimas décadas se desenrolou vários mecanismos moleculares e celulares envolvidos na progressão da placa, continuou ainda são necessários esforços não só para desvendar o complexo mecanismo de progressão da doença, mas também para testar novas terapêuticas aproxima-se. Vários modelos animais têm sido propostos para estudar a aterosclerose. Manipulação genética, ferimentos de endotélio de alimentação ou mecânica de colesterol são as estratégias padrão compartilhadas por modelos mais animais da aterosclerose, incluindo ratos, coelhos ou miniporcos. Entre estes, coelhos NZW são sensíveis à dieta rica em colesterol, enquanto ratos e ratos normais não absorvem significativamente colesterol dietético^2,3,4. Coelhos, espontaneamente, desenvolver lesões da aorta ricas em macrófagos com algum componente fibroso quando alimentados com colesterol dieta rica^5,6. No entanto, o tempo tempo preparatório de 4-8 meses para induzir aterosclerótica plaquesby alimentação colesterol dieta sozinho^6,7 é uma grande desvantagem para a maioria das configurações de experimentais. Na busca para induzir lesões em tempo relativamente curto, uma combinação de colesterol alto dieta e balão prejuízo foi desenvolvida pela Baumgarter e Studer⁸. O objetivo geral desta técnica é induzir o ateroma composta de células de espuma (semelhantes a raia gorda em seres humanos) em coelhos hipercolesterolêmicos dentro de 2 semanas. A presente técnica descreve o procedimento de ferimento de parede arterial com base no método do Baumgarter utilizando um cateter balão avançado nas artérias ilíacas de coelhos hipercolesterolêmicos NZW.

Em conjunto com uma dieta rica de colesterol, danos que resultem de endotelização balão induzida vão levar a aterosclerose. Lesão de balão acelera a formação de lesões ateroscleróticas e produz placa de tamanho uniforme e distribuição. Espessamento da íntima aumenta ao longo de um período de tempo e célula da íntima infiltração começa dentro de alguns dias após lesão. Listras gordas com macrófagos substanciais começam a aparecer após 7-10 dias de lesão de balão e são representadas como lesão tipo II, de acordo com a classificação pela American Heart Association. Lesão de balão em coelho é frequentemente realizado na aorta para estudar a composição da placa bacteriana. O endotélio neointimal expressa altos níveis da molécula de adesão intercelular. As placas estão associadas com dissecção medial e alterações adventícia. Lesões ateroscleróticas são compostas de lipídios, proliferação células musculares lisas (SMCs), fibras colágenas e células inflamatórias que se acumulam sob o endotélio regenerado e são principalmente tipo II na natureza. A distribuição topológica de placas coelho foi semelhante à relatada na aorta humana ^9,10 , em princípio, a aorta é maior no tamanho em comparação com as artérias ilíacas e produziria placa de maior comprimento. No entanto, a grande vantagem de usar a artéria ilíaca como o site da aterosclerose em coelhos é sua acessibilidade, sua similaridade no conteúdo muscular de coronária humana¹¹, lesão uniforme desenvolvimento¹², fator tecidual elevada atividade¹³ e consistente navio dimensão comparável ao humana artéria coronária, permitindo a avaliação dos dispositivos fabricados comercialmente morfométricos e angiográficos pontos de extremidade. Métodos invasivos e não-invasivos têm sido investigados para analisar as placas nas artérias ilíacas de coelho no animal vivo. Relatórios anteriores descrevem o uso de ressonância magnética (MRI) com a ajuda de um senhor de 2,35-tesla sistema ¹⁴ além disso, o ultra-som intravascular (USIV) ou cateteres de coerência óptica (OCT) a tomografia podem ser devidamente aplicado à imagem ateroma nas artérias ilíacas coelho. A artéria ilíaca é acessível por ultra-sonografia quando usando uma ecografia de alta resolução e a aorta também pode ser explorada com esta técnica.

Na última década, este modelo de coelho de lesão de balão tem ajudado a entender melhor os mecanismos de progressão de placa¹⁵e regressão de placa¹⁶. Além disso, o modelo tem sido usado para estudar a influência de novos agentes terapêuticos como estatinas, agentes antiplaquetários padrão, antioxidante agentes^17,18 e stents farmacológicos tais como everolimus ou eluidor de Zotarolimus stent^19,20 em espessamento neointimal. Este modelo também serviu para investigar a imagem intravascular de fluorescência de infravermelho próximo da imagem latente do cateter²¹.

Protocolo

este protocolo experimental foi aprovado pelo veterinário Cantonal, Friburgo e o suíço Federal veterinária Office, Switzerland (FR-2015/58).

Nota: foram utilizados coelhos NZW masculino com peso entre 2,8 a 3,2 kg. Os animais estavam alojados em condições convencionais (12 h luz e ciclo escuro, fornecida comida e água ad libitum). Antes de desnudamento do balão, os animais foram aclimatados para 1 semana, durante o qual eles foram alimentados com dieta de comida normal. Após 1 semana de aclimatação, coelhos foram trocados para aterogênico dieta consistindo de alto teor de gordura (8,6%) e ácidos graxos saturados com dieta rica em colesterol (1%) 205 mg/kg para a duração inteira de estudo. Lesão de balão na artéria ilíaca esquerda foi realizada 1 semana após o início da dieta e os animais foram sacrificados após 2 semanas ou 4 semanas de lesão balão.

1. procedimentos pré-operatórios

1. esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos antes do uso com um esterilizador de grânulo de vidro ou outro instrumento apropriado.
2. Preparar e verificar o conjunto de cateter de balão.
   1. Anexar um conector luer-lock 1 mL seringa preenchida com solução salina normal para a parte do conector luer-lock do cateter balão. Monitorize cuidadosamente a ausência de ar. Verifique os vazamentos e garantir a inflação do balão apropriado pressionando o êmbolo da seringa.
3. Pesar o coelho e ligar o thermopad a 37 ° C.
4. Usar uma solução de buprenorfina em uma concentração de 0,3 mg / ml. injetar uma dose de 0,01 mg/kg por via subcutânea.
5. ANESTHETIZE o coelho com 5% de isoflurano e 5 L/min O ₂ em uma câmara de indução de 10-15 min.
6. Coloque o coelho anestesiado sobre a almofada de aquecimento, mantida na plataforma cirúrgica. Coloque o patch e clipes para monitorar a temperatura, respiração e eletrocardiograma.
7. Anexar o focinho do coelho para uma máscara facial conectada a uma máquina de anestesia adequada. Manter a anestesia com isoflurano (4,0% com 2,5 L/min O ₂). Confirmar anesthetization adequada (indicado por falta de tônus muscular e perda de reflexos de mordaça e transformam).
8. Aplicar a pomada oftálmica de ambos os olhos para impedir que as córneas de secagem. Cubra o coelho com uma folha cirúrgica estéril com apenas o membro inferior exposto.

2. Protocolo cirúrgico

1. remover o cabelo da zona ventral logo abaixo as articulações de joelho, usando a máquina de cortar cabelo animal.
2. Limpe a área com desinfetante apropriado para limpar a pele e remover pelos soltos.
3. Localizar a artéria safena e faça uma incisão de pele pequena de cerca de 1,5 cm de comprimento com um bisturi.
4. Expor uma pequena porção da artéria safena com pequenas pinças curvas sem danificar a veia femoral e o nervo femoral.
5. Coloque dois loops de ligadura solto (seda 5-0) sob a artéria safena e amarre um laço de ligadura em direção a extremidade distal da artéria. Coloque uma pinça microvascular acima a ligadura para parar o fluxo de sangue da artéria ilíaca.
6. Aplicar topicamente uma gota de papaverina para dilatar a artéria e prevenir vasoespasmo.
7. Levante a artéria safena com a ajuda da ligadura amarrada e fazem uma incisão pequena arteriotomia usando um 24 agulha de calibre.
8. Elevar as abas da incisão com pinça fina e inserir lentamente uma veia picareta ou uma guia de agulha no lúmen da artéria.
9. Inserir um cateter de embolectomia arterial 2 francês Fogarty a artéria safena. Remover os grampos microvasculares e escolher veia.
10. Avançar o cateter até a marca de sexto (20-25 cm) corresponde a uma posição de aproximadamente 2 a 5 cm acima da bifurcação ilíaca.
11. Insuflar o balão com soro fisiológico normal de 0,1 mL utilizando uma seringa de 1 mL ou a uma pressão nominal de 6 atm usando um compressor de ar manual regulamentado conforme descrito em ^{16 , 22}.
12. Mantenha o cateter de balão com fórceps e arraste volta por 6cm através da ilíaca arterytoward o ponto de inserção, enquanto girar o cateter.
13. Desinsuflar o balão puxando o êmbolo da seringa.
14. Repita os passos 2.10 a 2.13 três vezes para garantir o completo desnudamento endotelial.
15. Remover o cateter e imediatamente amarrar o laço de ligadura logo acima o site arteriotomia para parar o sangramento.
16. Aplicar todo anti-séptico adequado em torno da periferia da ferida e limpar afastado os coágulos de sangue. Fechar a incisão na pele com uma sutura de 5-0 e desinfectar o local da cirurgia com solução de iodo-povidona.
17. Repetir passos 2.1 a 2.16 sobre o contralateral ilíaca utilizando um cateter novo.
18. a pomada oftálmica de olhos um esfregaço.

3. Cuidados pós-operatórios

1. administrar sulfadoxine 40 mg/kg e trimetoprim 8 mg/kg ou a qualquer outro antibiótico adequado imediatamente após o procedimento cirúrgico.
2. Durante o período de recuperação de anestesia, manter o coelho sobre uma almofada de calor colocada em uma gaiola limpa autoclavada.
3. Remover o patch monitoramento e clipes.
4. Após a recuperação, retornar os coelhos para jaulas em casa. Injectar por via subcutânea buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/kg pós - operatório cada 6-12 h por 48 h. continuar aterogênico dieta por mais duas semanas ou quatro semanas.

4. Colheita de tecido e análise da composição da placa

1. depois de duas semanas (para cedo placa fina) ou três semanas de lesão de balão, anestesiar o coelho utilizando isoflurano em uma maneira similar como descrito acima.
2. Abrir a cavidade torácica e eutanásia os coelhos por exsanguinação intracardíaca.
3. Isolar as artérias ilíacas, conforme descrito em ²³.
   1. Brevemente, abrir o abdômen e expor o retroperitônio. Trace a aorta em direção a bifurcação ilíaca e amarrá-la acima da bifurcação. Retire com cuidado os tecidos circunvizinhos para expor e isolar ambas as artérias ilíacas.
4. Dissecar fora de ambas as artérias ilíacas e mergulhe-os em solução salina gelada tamponada de fosfato. Remova os coágulos com a ajuda de pinças. Divida cada artéria ilíaca em 4-6 segmentos para caracterizar a espessura da placa ao longo da artéria.
5. Imediatamente incorporar os segmentos arteriais em um molde contendo a temperatura ideal de corte composta, snap-congelamento com nitrogênio líquido e mantê-lo em-70 ° C. preparar 5 µm espessura seções usando um criostato, conforme descrito em ²⁴.
6. Executar histologia, imunofluorescência ou imuno-histoquímica mancha para morfometria, placa lipido e conteúdo celular conforme descrito em ^{10 , 25}.
   Nota: Brevemente, enxágue as seções arteriais com solução salina tamponada fosfato (PBS) e permeabilize usando 0,2% Triton. Enxagúe as seções com PBS e bloquear sites não específicas com albumina de soro bovino 2% por 30 min. Incubar as secções para 1 h a 37 ° C com anti actina α-SM (1: 200) ou anticorpo RAM11 (1: 200). Enxagúe as seções com PBS e incube-os com anticorpo secundário apropriado para 30 min a 37 ° C. Lave novamente com PBS e adicionar Hoechst (5 µ g/mL) por 10 min detectar núcleos.

Resultados

Lesão de balão da artéria ilíaca foi realizada com sucesso sem complicação (Figura 1). O tempo operacional total variou de 20 a 30 min para lesões executada apenas uma artéria ilíaca e 35 a 45 min para lesões em ambas as artérias. O coelho recuperado dentro de 1h após a lesão de balão. Todos os animais apareceram saudáveis sem perda significativa de peso. Sem infecção, edema ou trombose arterial foi encontrada. A área da ferida foi normal, a...

Discussão

O modelo de aterosclerose de artéria ilíaca coelho é amplamente utilizado na investigação de aterosclerose. Com este protocolo os coelhos rapidamente desenvolveram placas mais avançadas e graves em comparação com lesões espontâneas desenvolvidas com apenas dieta rica em colesterol. Importante, os animais se recuperar rapidamente da cirurgia.

O principal estímulo para atherogenesis é os danos mecânicos causados pelo cateter de balão que fere o endotélio e distende o vaso parede

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White rabbits	Charles River laboratories,France	Cre:KBL(NZW)
Cholesterol rich diet	Ssniff spezialdiäten	Ssniff EF K High Fat and Cholesterol
Glass bead sterilizer-Germinator 500	VWR, Leicestershire, UK	101326-488
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French	Edwards Lifesciences, Switzerland	120602F	For single use only
Luer Lock Syringe	Becton, Dickinson and Company, USA	309628
Thermopad Type 226	Solis, Switzerland AG	397387
Buprenorphine- Temgesic	Reckitt Benckiser AG, Switzerland	7.68042E+12
Isoflurane	Piramal Critical Care, Inc, Bethlehem, PA 18017	2667-46-7
Anaesthesia machine-combi-vet Base Anesthesia System	Rothacher Medical GmbH, Switzerland	CV 30-301-A
Cardell touch veterinary vital signs monitor	Midmark, Ohio, USA	8013-001
Ophthalmic ointment-Humigel	Virbac, France
Animal hair clippers	Aesculap AG, Germany	GT420
Disinfectant-Betadine solution	MundipharmaMedicalCompany, Switzerland	14671-1203
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
Medium and small microscissors	Medline International Switzerland Sàrl	UC4337
Microvascular clamps	FST, Germany	18051-28
Papaverine	ESCA chemicals, Switzerland	RE 356 803
Vein Pick	Harvard Apparatus, Cambridge, UK	72-4169	For single use only
Saline	Laboratorium Dr. G. Bichsel AG, , Switzerland	1330055
Polysorb 5-0 suture	Covidien AG, Switzerland	UL 202	Monofilament
Sulfadoxine and Trimethoprim-Trimethazol	Werner Stricker AG, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'361
Antiseptic- Octenisept	Schülke & Mayr AG, Switzerland	GTIN: 4032651214068
Phosphate Buffered Saline	Roth	1058.1
Isobutanol-2-Methylbutane	Sigma-Aldrich, Switzerland	M32631-1L
Optimum Cutting Temperature compound-Tissue-Tek	VWR Chemicals, Belgium	25608-930
Cryostat	Leica, Glattbrugg, Switzerland	Leica CM1860 UV
Glass slide- Superfrost Plus	Thermo Scientific	4951PLUS4
Mayer's Haematoxylin	Sigma-Aldrich, Switzerland	MHS32-1L
Eosin 0.5% aq.	Sigma-Aldrich, Switzerland	HT110232-1L
Oil Red O	Sigma-Aldrich, Switzerland	O0625-25G
α-smooth muscle actin antibody	Abcam, UK.	ab7817
Macrophage Clone RAM11 antibody	DAKO, Switzerland	M063301
Hoechst	Abcam, UK.	ab145596
Goat polyclonal Secondary Antibody (Chromeo 546)	Abcam, UK.	ab60316
Alexa Fluor 488/547	Abcam, UK.
Glycergel Mounting Medium, Aqueous	DAKO, Switzerland	C056330
Hematoxylin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	H3136-25G
Ferric chloride for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	157740-100G
Iodine for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	207772-100G
Potassium iodide for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	60400-100G-F
Alcian blue for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	A5268-10G
Strong Ammonia for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	320145-500ML
Brilliant crocein MOO for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	210757-50G
Acid Fuchsin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	F8129-50G
Sodium Thiosulfate for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	72049-250G,
Phosphotungstic acid for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	79690-100G
Crocin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	17304-5G
EUKITT for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	03989-100ML