Le modèle du lapin d’athérosclérose accélérée : un point de vue méthodologique de la blessure de ballon artère iliaque

Résumé

Des modèles animaux de l’athérosclérose sont essentielles pour comprendre le mécanisme et d’enquêter sur nouvelles approches pour empêcher le développement de la plaque ou la rupture, des principales causes de décès dans le monde industrialisé. Ce protocole utilise une combinaison de blessure de ballon et régime riche en cholestérol pour induire les plaques d’athérosclérose dans l’artère iliaque lapin.

Résumé

Syndrome coronarien aigu résultant de l’occlusion coronaire après rupture et le développement de la plaque d’athérosclérose est la principale cause de décès dans le monde industrialisé. Les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (NZW) sont largement utilisés comme modèle animal pour l’étude de l’athérosclérose. Ils développent des lésions spontanées lorsque nourris avec un régime athérogène ; Cependant, cette technique nécessite beaucoup de temps de 4 à 8 mois. Afin d’améliorer et accélérer l’athérogenèse, une combinaison de régime athérogène et lésion endothéliale mécanique est souvent utilisée. La procédure présentée pour induire les plaques d’athérosclérose chez les lapins utilise un cathéter à ballonnet pour perturber l’endothélium dans l’artère iliaque gauche de NZW lapins nourri avec la diète athérogène. Tels dommages mécaniques causés par le cathéter à ballonnet induit une chaîne de réactions inflammatoires initiant néointimale accumulation de lipides de manière dépendante de temps. Plaque d’athérosclérose après épaississement de néointimale Voir la bulle blessure avec infiltration lipidique vaste, la teneur en cellules des muscles lisses haute et présence de macrophages dérivés des cellules spumeuses. Cette technique est simple, reproductible et produit plaque de longueur contrôlé au sein de l’artère iliaque. L’ensemble de la procédure se termine dans 20-30 min. La procédure est sécuritaire à faible mortalité et propose également de réussite élevé à obtenir d’importantes lésions intimale. La procédure du cathéter à ballonnet induit des résultats de lésions artérielles dans l’athérosclérose dans les deux semaines. Ce modèle peut être utilisé pour l’étude de la pathologie de la maladie, imagerie diagnostique et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Introduction

Rupture des plaques athéroscléreuses vulnérables est l’une des principales causes de décès dans les pays industrialisés¹. Bien que les études effectuées au cours des dernières décennies s’est déroulée à plusieurs mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la progression de la plaque, a poursuivi des efforts sont encore nécessaires non seulement à élucider le mécanisme complex de la progression de la maladie, mais aussi pour tester de nouvelles thérapeutiques approches. Plusieurs modèles animaux ont été proposées pour l’étude de l’athérosclérose. La manipulation génétique, blessure de cholestérol alimentaire ou mécanique de l’endothélium sont les stratégies standards partagés par des modèles plus animales de l’athérosclérose, y compris des souris, des lapins et des porcs miniatures. Parmi ceux-ci, les lapins NZW sont sensibles aux régime cholestérol tandis que les souris et les rats normaux n’absorbent pas significativement le cholestérol alimentaire^2,3,4. Lapins développent spontanément des lésions aortiques riches en macrophages avec certains composant fibreux lorsqu’il est nourri avec cholestérol diète riche^5,6. Cependant, le temps préparatoire long de 4 à 8 mois pour induire l’athérosclérose plaquesby alimentation cholestérol diète seule^6,7 est un inconvénient majeur pour la plupart des paramètres expérimentaux. Dans la quête pour induire des lésions en relativement peu de temps, une combinaison de taux élevé de cholestérol diète et ballon de préjudice a été développée par Baumgarter et Studer⁸. L’objectif global de cette technique consiste à induire les plaques d’athérome composés de cellules spumeuses (semblables à la strie gras chez l’homme) chez des lapins hypercholestérolémiques dans les 2 semaines. La technique actuelle décrit la procédure de lésion de la paroi artérielle basée sur la méthode de Baumgarter à l’aide d’un cathéter à ballonnet avancé dans l’artère iliaque des lapins hypercholestérolémiques NZW.

Avec un régime riche en cholestérol, blessure résultant de ballon induite par dé-endothélialisation conduira à l’athérosclérose. Blessure de ballon accélère la formation des lésions athéroscléreuses et produit plaque de taille unique et de la distribution. Épaississement de l’intima augmente sur une période de temps et de la cellule intima infiltration commence dans quelques jours après une blessure. Stries gras avec des macrophages substantiels commencent à apparaître après 7-10 jours de blessure de ballon et sont représentés comme des lésions de Type II selon la classification de l’American Heart Association. Blessure de ballon chez le lapin est souvent réalisée dans l’aorte pour étudier la composition de la plaque. L’endothélium néointimale exprime des niveaux élevés de la molécule d’adhésion intercellulaire. Les plaques sont associées à la dissection médiale et changements adventitiels. Les lésions athéroscléreuses sont composées de lipides, prolifération cellules musculaires lisses (CML), fibres de collagène et des cellules inflammatoires qui s’accumulent sous l’endothélium régénérée et sont principalement de type II dans la nature. La distribution topologique des plaques de lapin était semblable à celle rapportée dans les aortes humaine ^9,10 , en principe, l’aorte est la plus grande taille par rapport aux artères iliaques et produirait une plaque plus grande longueur. Toutefois, l’avantage majeur de l’utilisation de l’artère iliaque comme le site de l’athérosclérose chez les lapins est son accessibilité, sa ressemblance avec contenu musculaire de l’artère coronaire humaine¹¹, lésion uniforme développement¹², facteur tissulaire élevée activité¹³ et dimension compatible navire comparable à l’artère coronaire humaine permettant l’évaluation des dispositifs fabriqués commercialement morphométriques et points de terminaison angiographiques. Méthodes invasives et non invasives ont été étudiés pour analyser les plaques dans les artères iliaques lapin dans l’animal vivant. Les rapports précédents décrivent l’utilisation de l’imagerie (IRM) à l’aide d’un système de MR tesla 2,35 ¹⁴ en outre par résonance magnétique, échographie intravasculaire (IVUS) ou cathéters tomographie par cohérence optique peuvent être convenablement appliquée à l’image plaques d’athérome dans les artères iliaques de lapin. L’artère iliaque est accessible pour l’échographie lorsque vous utilisez une échographie à haute résolution et l’aorte peut également être exploré avec cette technique.

Au cours de la dernière décennie, ce modèle de lapin de blessure de ballon a aidé à mieux comprendre les mécanismes de progression de plaque¹⁵et plaque régression¹⁶. En outre, le modèle a été utilisé pour étudier l’influence de nouveaux agents thérapeutiques tels que les statines, standards antiagrégants plaquettaires, antioxydant agents^17,18 et endoprothèses à élution de médicaments tels que l’évérolimus ou à élution de zotarolimus stent^19,20 sur néointimale épaississement. Ce modèle a également été utilisé pour enquêter sur l’imagerie intravasculaire de proche infrarouge fluorescence imaging cathéter²¹.

Protocole

ce protocole expérimental a été approuvé par l’Office vétérinaire Cantonal, de Fribourg et de la Suisse vétérinaire Office fédéral, la Suisse (2015 FR/58).

Remarque : on a utilisé les lapins NZW mâle pesant entre 2,8 à 3,2 kg. Les animaux étaient logés dans des conditions classiques (12 h de lumière et sombre cycle, fourni des vivres et eau ad libitum). Avant la dénudation de ballon, les animaux ont été acclimatés pendant une semaine au cours de laquelle ils ont été nourris avec le régime normal. Après 1 semaine d’acclimatation, lapins sont passés à la diète athérogène consistant à haute teneur en graisses (8,6 %) et en acides gras saturés avec 205 mg/kg d’aliment cholestérol (1 %) pendant la durée de l’étude de l’ensemble. Blessures du ballonnet dans l’artère iliaque gauche s’est déroulée une semaine après le début du régime et animaux ont été sacrifiés après 2 semaines ou 4 semaines de blessures ballon.

1. procédures préopératoires

1. stériliser tous les instruments chirurgicaux avant de l’utiliser avec un stérilisateur de perle de verre ou un autre instrument approprié.
2. Préparer et vérifier le cathéter à ballon.
   1. Fixez un raccord luer lock de 1 mL seringue remplie de soluté physiologique à la partie luer-lock du cathéter à ballonnet. Surveiller attentivement pour absence de l’air emprisonné. Vérifiez les fuites et ballonnet approprié en appuyant sur le piston de la seringue.
3. Peser le lapin et allumez le thermopad à 37 ° C.
4. Utiliser une solution de buprénorphine à une concentration de 0,3 mg / ml. injecter une dose de 0,01 mg/kg par voie sous-cutanée.
5. Anesthésier le lapin avec 5 % isoflurane et 5 L/min O ₂ dans une chambre à induction pendant 10-15 min.
6. Placer le lapin anesthésié sur le coussin chauffant conservé sur la plate-forme chirurgicale. Placez le patch et clips pour surveiller la température, la respiration et électrocardiogramme.
7. Fixer le museau du lapin à un masque relié à une machine d’anesthésie adapté. Maintenir l’anesthésie à l’isoflurane (4,0 % avec 2.5 L/min O ₂). Confirmer le bonne anesthetization (indiquée par manque de tonus musculaire et la perte des réflexes nauséeux et pennes).
8. Pommade ophtalmique à deux yeux pour éviter les cornées de l’évaporation. Drapez le lapin avec un drap stérile chirurgicale avec uniquement les membres inférieurs exposés.

2. Protocole chirurgical

1. enlever les poils de la zone ventrale juste en dessous de l’articulation du genou à l’aide de tondeuses à cheveux animaux.
2. Tamponner la zone avec un désinfectant approprié pour nettoyer la peau et enlever les cheveux dénoués.
3. Localiser l’artère saphène et pratiquer une incision de la peau petit d’environ 1,5 cm de longueur à l’aide d’un scalpel.
4. Exposer une petite portion de l’artère saphène externe avec une petite pince courbe sans endommager la veine fémorale et le nerf fémoral.
5. Placer deux boucles lâches ligature (soie de 5-0) sous l’artère saphène et attacher une boucle de ligature vers l’extrémité distale de l’artère. Placer une pince microvasculaire au-dessus du lien pour arrêter le flux sanguin de l’artère iliaque.
6. Par voie topique appliquer une goutte de papavérine pour dilater l’artère et empêcher vasospasme.
7. Soulever l’artère saphène à l’aide de la ligature liée et faire une petite artériotomie incision à l’aide d’un 24 aiguille de calibre.
8. Élever les volets de l’incision avec une pince fine et introduire doucement un pic de veine ou une guidage de l’aiguille dans la lumière de l’artère.
9. Insérer un cathéter d’embolectomie artérielle Français Fogarty 2 dans l’artère saphène. Retirer la veine pick et pinces microvasculaires.
10. Avancer le cathéter jusqu'à la sixième marque (20-25 cm), correspondant à une position plus ou moins 2 à 5 cm au-dessus de la bifurcation iliaque.
11. Gonfler le ballonnet avec physiologique de 0,1 mL à l’aide d’une seringue de 1 mL ou à une pression nominale de 6 atm en utilisant un gonfleur manuel réglementé tel que décrit dans ^{16 , 22}.
12. Tenez le cathéter à ballonnet avec une pince et faites glisser retour de 6 cm par l’intermédiaire de l’iliaque arterytoward le point d’insertion, tout en tournant le cathéter.
13. Dégonfler le ballonnet en tirant le piston de la seringue.
14. Répéter les étapes 2.10 à 2.13 trois fois pour assurer la complète dénudation endothéliale.
15. Retirer le cathéter et attacher immédiatement la boucle de ligature juste au-dessus du site de l’artériotomie pour arrêter le saignement.
16. Appliquer adapté tout antiseptique sur le pourtour de la plaie et essuyer de suite la formation de caillots sanguins. Refermer l’incision de la peau avec une suture de 5-0 et désinfecter le site de la chirurgie avec solution de povidone-iode.
17. Répéter les étapes 2.1 à 2.16 sur la controlatérale iliaque en utilisant un nouveau cathéter.
18. Effectuer un écouvillonnage de la pommade ophtalmique d’yeux.

3. Soins postopératoires

1. administrer sulfadoxine 40 mg/kg et le triméthoprime 8 mg/kg ou tout autre antibiotique approprié immédiatement après l’intervention chirurgicale.
2. Pendant la période de récupération anesthésie, garder le lapin sur un coussin chauffant placé dans une cage propre autoclavée.
3. Supprimer le correctif de la surveillance et des clips.
4. Après récupération, retourner les lapins de leur cage maison. Injecter par voie sous-cutanée buprénorphine 0,05 - 0,1 mg/kg post - opératoirement toutes les 6 à 12 h pendant 48 h. diète athérogène continuer pour un autre deux semaines ou 4 semaines.

4. La récolte de tissus et analyse de la Composition de la Plaque

1. après deux semaines (pour la plaque mince au début) ou trois semaines de blessures de ballon, anesthésier le lapin l’isoflurane de façon similaire, tel que décrit ci-dessus.
2. Ouvrir la cavité thoracique et euthanasier les lapins par exsanguination intracardial.
3. Isoler les artères iliaques décrits dans ²³.
   1. Brièvement, ouvrir l’abdomen et exposer le rétropéritoine. Tracer l’aorte vers la bifurcation iliaque et attachez-le au-dessus de la bifurcation. Retirez soigneusement les tissus environnants pour exposer et isoler les deux artères iliaques.
4. Dissect sortir les deux artères iliaques et les plonger dans une solution saline tamponnée au phosphate glacée. Retirer les caillots avec l’aide de pinces. Diviser chaque artère iliaque en 4 à 6 segments pour caractériser l’épaisseur de la plaque tout au long de l’artère.
5. Immédiatement incorporer les segments artériels dans un moule contenant la température de coupe optimale composée, clin d’oeil-gel à l’aide d’azote liquide et gardez-le à-70 ° C. préparer 5 µm coupes d’épaisseur à l’aide d’un cryostat comme décrit dans ²⁴.
L’histologie
6. Perform, immunofluorescence ou immunohistochemical souillant pour morphométrie, lipides de la plaque et le contenu cellulaire tel que décrit dans ^{10 , 25}.
   Remarque : En bref, rincer les sections artérielles avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) et permeabilize à l’aide de 0,2 % Triton. Rincez les sections avec du PBS et bloquer les sites non spécifiques avec 2 % d’albumine sérique bovine pendant 30 min. laisser incuber les sections pendant 1 h à 37 ° C avec anti actine α-SM (1 : 200) ou d’anticorps RAM11 (1 : 200). Rincer les sections avec du PBS et leur incubation avec l’anticorps secondaire approprié pendant 30 min à 37 ° C. Lavez à nouveau avec du PBS et ajouter Hoechst (5 µg/mL) pendant 10 min détecter les noyaux.

Résultats

Blessure de ballonnet de l’artère iliaque a été réalisée avec succès, sans complication (Figure 1). Le temps opératoire total varie de 20 à 30 min pour les blessures ne jouée qu’une seule artère iliaque et 35 à 45 min pour des blessures sur les deux artères. Le lapin récupéré moins de 1 h après la blessure de ballon. Tous les animaux est apparu en bonne santé, sans perte de poids significative. Aucune infection, œdème ou thrombose arté...

Discussion

Le modèle de l’athérosclérose de l’artère iliaque lapin est largement utilisé dans la recherche de l’athérosclérose. Avec ce protocole, les lapins a rapidement développement des plaques plus sévères et avancés par rapport aux lésions spontanées développées avec seulement le régime cholestérol. Ce qui est important, les animaux récupérer rapidement de la chirurgie.

L’impulsion principale pour l’athérogenèse est les dommages mécaniques causés par le cathéter à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White rabbits	Charles River laboratories,France	Cre:KBL(NZW)
Cholesterol rich diet	Ssniff spezialdiäten	Ssniff EF K High Fat and Cholesterol
Glass bead sterilizer-Germinator 500	VWR, Leicestershire, UK	101326-488
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French	Edwards Lifesciences, Switzerland	120602F	For single use only
Luer Lock Syringe	Becton, Dickinson and Company, USA	309628
Thermopad Type 226	Solis, Switzerland AG	397387
Buprenorphine- Temgesic	Reckitt Benckiser AG, Switzerland	7.68042E+12
Isoflurane	Piramal Critical Care, Inc, Bethlehem, PA 18017	2667-46-7
Anaesthesia machine-combi-vet Base Anesthesia System	Rothacher Medical GmbH, Switzerland	CV 30-301-A
Cardell touch veterinary vital signs monitor	Midmark, Ohio, USA	8013-001
Ophthalmic ointment-Humigel	Virbac, France
Animal hair clippers	Aesculap AG, Germany	GT420
Disinfectant-Betadine solution	MundipharmaMedicalCompany, Switzerland	14671-1203
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
Medium and small microscissors	Medline International Switzerland Sàrl	UC4337
Microvascular clamps	FST, Germany	18051-28
Papaverine	ESCA chemicals, Switzerland	RE 356 803
Vein Pick	Harvard Apparatus, Cambridge, UK	72-4169	For single use only
Saline	Laboratorium Dr. G. Bichsel AG, , Switzerland	1330055
Polysorb 5-0 suture	Covidien AG, Switzerland	UL 202	Monofilament
Sulfadoxine and Trimethoprim-Trimethazol	Werner Stricker AG, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'361
Antiseptic- Octenisept	Schülke & Mayr AG, Switzerland	GTIN: 4032651214068
Phosphate Buffered Saline	Roth	1058.1
Isobutanol-2-Methylbutane	Sigma-Aldrich, Switzerland	M32631-1L
Optimum Cutting Temperature compound-Tissue-Tek	VWR Chemicals, Belgium	25608-930
Cryostat	Leica, Glattbrugg, Switzerland	Leica CM1860 UV
Glass slide- Superfrost Plus	Thermo Scientific	4951PLUS4
Mayer's Haematoxylin	Sigma-Aldrich, Switzerland	MHS32-1L
Eosin 0.5% aq.	Sigma-Aldrich, Switzerland	HT110232-1L
Oil Red O	Sigma-Aldrich, Switzerland	O0625-25G
α-smooth muscle actin antibody	Abcam, UK.	ab7817
Macrophage Clone RAM11 antibody	DAKO, Switzerland	M063301
Hoechst	Abcam, UK.	ab145596
Goat polyclonal Secondary Antibody (Chromeo 546)	Abcam, UK.	ab60316
Alexa Fluor 488/547	Abcam, UK.
Glycergel Mounting Medium, Aqueous	DAKO, Switzerland	C056330
Hematoxylin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	H3136-25G
Ferric chloride for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	157740-100G
Iodine for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	207772-100G
Potassium iodide for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	60400-100G-F
Alcian blue for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	A5268-10G
Strong Ammonia for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	320145-500ML
Brilliant crocein MOO for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	210757-50G
Acid Fuchsin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	F8129-50G
Sodium Thiosulfate for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	72049-250G,
Phosphotungstic acid for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	79690-100G
Crocin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	17304-5G
EUKITT for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	03989-100ML