זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

Summary

מאמר זה מתאר את זיהוי של חלבוני קושרי קרח מצמחי הקפאה-סובלנית דרך ההערכה של פעילות עיכוב-recrystallization הקרח והבידוד הבא של IBPs המקורית באמצעות טיהור זיקה-קרח.

Abstract

קרח מחייב חלבונים (IBPs) שייכים למשפחה של חלבונים-induced להדגיש כי מסונתזים על ידי אורגניזמים מסוימים חשופים לטמפרטורות שמתחת לאפס. בצמחים, ניזק הקפאה מתרחש כאשר גבישי קרח תאיים לגדול, וכתוצאה מכך פקיעת קרומי פלזמת תהליכי מוות תאי אפשרי. ספיחה של IBPs כדי גבישי קרח מגביל צמיחה נוספת על ידי תהליך המכונה עיכוב-recrystallization קרח (IRI), ובכך להפחית נזק הסלולר. IBPs גם להפגין את היכולת לדכא את נקודת הקיפאון של פתרון מתחת לנקודת היתוך שיווי משקל, בנכס הידוע היסטרזיס תרמית פעילות (TH). מאפייני הגנה אלו העלו עניין הזיהוי של IBPs הרומן עקב השימוש הפוטנציאלי שלהם ביישומים תעשייתיים, רפואיים וחקלאיים. מאמר זה מתאר את הזיהוי של הצמח IBPs דרך 1) והאימון החילוץ של IBPs ברקמת הצמח, 2) הקרנת תמציות לפעילות IRI, ו 3) בידוד purification של IBPs. בדומה להשפעת IBPs ידי חשיפה לטמפרטורה נמוכה, תמציות נבדקות לפעילות IRI באמצעות "assay מעיכה", המאפשר התצפית של צמיחת קריסטל קרח באמצעות מיקרוסקופ אור רגילה. assay זה דורש ריכוז חלבון נמוך ומייצר לתוצאות המתקבלות במהירות לפרש בקלות, מתן מסך ראשוני לפעילות מחייב קרח. IBPs ניתן לבודד אז את זיהום חלבונים על ידי ניצול רכושם של IBPs לספוג לקרח, באמצעות טכניקה הנקראת "טיהור קרח-זיקה". באמצעות lysates תא שנאסף תמציות צמח, חצי כדור ארץ קרח ניתן לגדל לאט על בדיקה פליז. זו משלבת IBPs לתוך המבנה הגבישי של קרח הגבישים. אין צורך בידע ביוכימיים או מבני אפריורי של IBP, שיטה זו מאפשרת התאוששות של חלבון פעיל. Ice-מטוהרים שברים חלבון יכול לשמש ליישומים במורד הזרם כולל זיהוי של PEPרצפים גאים ידי ספקטרומטריית מסה ואת לאנליזה ביוכימית של חלבונים מקומיים.

Introduction

קרח מחייב חלבונים (IBPs) הם משפחה מגוונת של חלבונים מגן כי התגלו מספר אורגניזמים כולל צמחים ^1, חרקים ^2, דגים ^3, חיידקים ^4. תכונת המפתח של חלבונים אלה היא היכולת הייחודית שלהם במיוחד וביעילות לספוג גבישי קרח, שינוי הצמיחה שלהם. יש IBPs כמה תכונות מתועדות, עם שתי היסטרזיס התרמית להיות המאופיין ביותר היטב (TH) והעיכוב-recrystallization הקרח (IRI). פעילות TH הוא ציינה ביתר קלות ב IBPs יוצר חיות הקפאה-סובלנות. תוצאות פעילות זו בהורדה של נקודת הקיפאון של נוזלי הדם או ביניים אורגניזמים כדי למנוע קפיאה. לעומת זאת, ב אורגניזמים הקפאה-סובלנית, שבהכרח יהיה להקפיא בטמפרטורות שמתחת לאפס, IBPs נראה כי פעילות TH נמוכה. למרות פעילות TH הנמוכה, פעילות IRI גבוהה להגביל זעקת קרחצמיחת Stal קרובות הוא ציין עם חלבונים אלה. עבור האורגניזם הקפאת-סובלנית, פעילות IRI זה כנראה עוזר להגן על התאים מפני צמיחה בלתי מבוקרת של קרח בתאים תאיים.

המודל "כפתור מזרן" יכול לשמש כדי לתאר את המנגנון שבאמצעותו IBPs למנוע הצמיחה של גבישי קרח ^5. לפי מודל זה, IBPs במיוחד לספוג אל פני השטח גביש הקרח במרווחים, כך מולקולות המים יכולים רק לשלב עם הסריג הגבישי קרח הגוברת במרחב שבין כבול IBPs. זה יוצר עקמומיות שעושה השילוב של מולקולות מים נוספות שלילי, אירוע זה יכול להיות מתואר על ידי האפקט גבס-תומסון ^6. השערת מי clathrate המעוגנים מספקת מנגנון הספציפי המחייב של IBPs אל פני שטח גביש הקרח לפיו הנוכחות של שאריות טעונות, מיקומו במיוחד על קרח חלבון האתר מחייב, תוצאות REOrganization של מולקולות מים כך שהם מתאימים מטוסים אחד או יותר של הסריג הגבישי קרח ^7.

ניתן לכמת פעילות TH ידי מדידת ההבדל בין התכה והקפאה לטמפרטורות של גביש קרח אחת בנוכחות של IBP. בעוד פעילות TH היא שיטה מקובלת של הערכת הפעילות של IBPs, פער TH הנמוך המיוצר על ידי המפעל IBPs (בדרך כלל רק חלק קטן של תואר) בדרך כלל דורש ריכוז חלבון גבוה, ציוד מיוחד וניסיון מפעיל. למרות שאינם IBPs עשויה להגביל צמיחה קריסטל קרח, זהו רכוש משותף לכל IBPs ובכך בדיקות לפעילות IRI הוא מסך ראשוני יעיל בנוכחות IBPs, במיוחד עבור אלה עם פעילות TH נמוכה. המתודולוגיה משמש לבדיקת פעילות זו ידועה בשם "assay מעיכה", לפי מדגם חלבון מוקפא פלאש לייצר בשכבה של גבישי קרח קטנים, אשר נצפו על פני תקופה של זמן כדי לקבוע אםצמיחת קריסטל קרח מוגבלת. בניגוד לשיטות אחרות לשמש מסך מדגם רקמות מקור בנוכחות IBPs, טכניקה זו ישימה ריכוזי חלבון נמוך בטווח של 10-100 ng, משתמש בציוד מפוברק בקלות, ומייצר נתונים במהירות ובקלות פרשו. עם זאת, חשוב להדגיש כי assay זה מספק מסך ראשוני IBPs שצריך ואחריו קביעת TH ועיצוב קריסטל קרח.

בידודו של חלבונים ילידי מאתגר, הדורש לעתים קרובות מידע לגבי תכונות מבניות ביוכימיים של חלבון של עניין. הזיקה של IBPs עבור קרח מאפשרת הבידוד של חלבונים אלה באמצעות קרח כמצע למטרות טיהור. מאחר ורוב המולקולות נדחפים קדימה של גבול קרח המים במהלך גדילת גבישי קרח, צמיחה איטית של חצי כדור ארץ קרח בנוכחות של תוצאות מדגם IBP במדגם פערים מטוהר, נטול quantit הגדולies של מזהם חלבונים מומסים. שיטה זו שימשה לזהות IBPs מפני חרקים ^{8, 9, 10, 11} חיידקים, דגים ¹² וצמחים ^{13, 14.} בנוסף, שברים מועשר IBP מושגת באמצעות שיטה זו יכולה לשמש גם עבור ניתוח ביוכימיים במורד הזרם. מאמר זה מתאר את זיהוי של IBPs בצמחים באמצעות האינדוקציה וסחיטה IBPs, ניתוח של פעילות IRI כדי לאשר את קיומו של חלבונים, ואת הבידוד של חלבונים באמצעות טיהור זיקת קרח.

Protocol

הגדרת Apparatus ספלאט 1.

1. מלאו אמבט מים במחזור-לתכנות טמפרטורה עם אתילן גליקול (50% v / v במים).
   הערה: אתילן גליקול הרכב הירוק יכול לשמש.
2. כדי להרכיב את התא החיצוני, להשתמש בצינור פלסטיק מבודד כדי לצרף את האמבטיה במי קערה מזכוכית דופן כפולה. לבודד את קערת זכוכית עם קצף פוליסטירן מכסים במכסה צלחת פטרי פלסטיק. חותכים חור אינץ 3-4 בבית התחתון של החדר פוליסטירן כך שמקור האור ניתן לראות דרך תא הזכוכית.
3. הר הקאמרי החיצוני על מיקרוסקופ לנתיחה, מצויד ביציאת מצלמת עדשה אובייקטיבית מקוטבת 4X עם עדשת עינית 10x. מניח פיסה נוספת של סרט מקוטב בתחתית התא החיצוני.
4. הצמד צינור מ 1-1.5 (~ 5 ס"מ קוטר) על דוכן הענות מקום בתוך מכולה פוליסטירן גדולה, יחד עם בלוק קירור מתחת לתפס צינור בבסיס המעמד הגבה.

2. הכנת חלבון Native תמציות ניתוח IRI

1. כדי לגרום לביטוי של IBPs עשבים הקפאה-סובלני או מיני צמחי הקפאה-סובלנית אחרים, צמחים לאקלם קרים עד 1 שבוע 4 ° C, בתנאי תאורה חלשים (6 h האור / 18 h כהה). זה אינו חל על דגימות שנאספו מהשטח שכבר נחשף לתנאי טמפרטורה נמוכים ותקופות הסתגלות.
2. השג כ 0.1 גרם של רקמת העלה ידי חיתוך בבסיס הגבעול ואז ומכניסים צינור 1.5 מ"ל. מיד להבהב להקפיא המדגם בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C עד השימוש.
3. כדי lyse התאים, לטחון דגימת רקמות לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי תחת חנקן נוזלי. ודא כי החנקן הנוזלי אינו להתאדות במהלך התהליך הומוגניזציה.
4. מייד למקום דגימות קרקע על קרח ולאפשר החנקן הנוזלי כדי להתאדות לגמרי. להוסיף 1 מ"ל של extracti חלבון ילידיעל מאגר המכיל 10 מ"מ טריס-HCl, 25 מ"מ NaCl (pH 7.5), עם שתי טבליות מעכב פרוטאז EDTA-free הוסיף מיד לפני השימוש. פיפטה לערבב; לא מערבולת.
   הערה: תוספים נוספים עשויים צריכים לשמש אם lysate מכיל מטבוליטים משניים (ראה דיון).
5. נער בעדינות דגימות לילה (18-24 שעות) בשעה 4 מעלות צלזיוס. נהל את הצעדים הנותרים 4 מעלות צלזיוס.
6. הסר פסולת הסלולר על ידי צנטריפוגה דגימות ב ~ 16,000 XG במשך 5 דקות. שמור את השבר צנטריפוגות המסיסים עבור 5 דקות נוספות אם פסולת הסלולר נמשכת. ניתן לאחסן דגימות בהירות -20 ° C עד שימוש.

3. ספלאט Assay טרום הניסוי הגדרת

1. יוצקים 100 מ"ל של הקסאן לתוך תא חיצוני להגדיר עם הסרט מקוטב ולהוסיף 5-6 חרוזים התייבשות כדי למנוע רטיבות לבנות בשקופיות. להוסיף כמות קטנה של שומן ואקום לצלחת המכסים באמבטיה ולסובב כדי להבטיח חותם חזק ולמנוע התאדות של הקסאן.
2. מצננים את האמבט הקסאן בין -4 ° C ו -6 ° C באמצעות אמבט מים לתכנות כ 2-3 שעות לפני תחילת הניסוי. הקפד לבדוק את הטמפרטורה של הקסאן עם מדחום לפני תחילת הניסוי.
3. מניחים את גוש הקירור בקופסה פוליסטירן ישירות מתחת לצינור פלסטיק לכסות לחלוטין עם קרח יבש, 40 דקות לפני תחילת הניסוי.
4. לפני תחילת assay, להבטיח כי הצינור הוא ברמה. כדי לקבוע היכן בשכונת קירור המדגם ירד, המבחן ראשון ההליך עם מים מציינים היכן המדגם יורד עם סמן (כמתואר להלן).
5. סר קרח יבש מחלק העליון של הבלוק הקר ומניח שקופית כיסוי זכוכית מיקרוסקופ על סימן הטיפה כי כבר נקבע עם מים.
6. מייד לפני תחילת assay, להדליק את מקור האור לגרד כל קרח שנוצר על החלק התחתון של חדר הזכוכית. הימנע שמירה על מקור האור, אלא אם גבישי קרחשמתבצע דמיינו למנוע חימום הקסאן.

4. עריכת Assay ספלאט

1. טובל את הקצה חד הפעמי מודבקים פיפטה אוטומטית (1-20 μL) בשמן טבילה, בעזרת מגבת נייר להסיר עודפי שמן. צעד זה יאפשר המדגם ליפול ולא לדבוק מחוץ פיפטה.
   הערה: הסרת עודפי שמן מן פיפטה היא קריטית כדי להבטיח כי טיפות שמן לא יוצרות על גבישי הקרח, מה שהופך להדמיה קשה.
2. פיפטה 10 μL של מדגם פיפטה במקום ישירות מעל צינורות פלסטיק לפני השחרור המדגם. צליל "מעיכה" נפרד צריך להישמע כאשר המדגם פוגע שקופיות כיסוי זכוכית, יצירה בשכבה של גבישי קרח.
3. במהירות ובזהירות להסיר את שקופית מיקרוסקופ מהגוש הקר באמצעות פינצטה מקום באמבטיה הקסאן על גבי הסרט המקטב.
4. במבט תחת מיקרוסקופ, לשים את השקופית מיקרוסקופ לתוך שדה הראייה ואת המודעהרק העדשה האובייקטיבית כך-קיטוב הצלב מאפשרת ההדמיה של גבישי קרח ניגודיות גבוהה. התאם הגדלה ל 40x.
5. צרף את המצלמה למיקרוסקופ ולהתאים את ההגדרות "מאקרו" כדי לאפשר להדמיה ברורה של גבישי קרח ו ללכוד את התמונה.
   הערה: מחכה עד 1 שעות כדי לאפשר גבישי קרח לגדול יכולים לתת תמונה ברורה יותר.
6. חזור על שלבים 4.1-4.5 עבור כל הדגימות. בדרך כלל, למקם עד 6 מגלשות עם מדגם שונה בתא הקסאן.
7. כבה את מקור האור ולמקם צלחת פלסטיק מעל האמבטיה הקסאן, הבטחת חותם חזק. אפשר גבישי קרח כדי לחשל לילה (12-24 שעות, שמירת תקופת חישול עקבית בתוך assay מסוים). לאחר דגירה, ללכוד תמונות של סרטי הקרח כמתואר לעיל.
   הערה: דגימות מסוימות עשויות recrystallize מהר יותר מאחרים. אם אין recrystallization ניכר לאחר 12 h, לאפשר גבישים כדי לחשל עד 24 שעות כדי לוודא ששום recrystallization תתרחש.

5. ניתוח נתונים Assay ספלאט

1. העלה את התמונות למחשב ישירות להשוות את הגודל של גבישי קרח לפני ואחרי חישול. דוגמאות לפעילות recrystallization הקרח לא תגדלנה, בעוד דגימות בלי שום פעילות IRI תהיינה recrystallize להרכיב גבישי קרח גדולים במידה ניכרת. התערבות אור תגרום גבישי קרח גדולים מופיעים בגוונים שונים במקצת ולכן קלים לראות.

הגדרת ציוד טיהור קרח-זיקה 6.

1. מלאו אמבט מים במחזור-לתכנות טמפרטורה עם אתילן גליקול. ניתן להשתמש אתילן גליקול הרכב הירוק.
2. חבר באמבטיה כדי בדיקה חלול, פליז באמצעות צינורות פלסטיק מבודד ^15.
3. לבנות מיכל קלקר שלתוכו מבחנה מ"ל 150 יכול להתאים מלבב. צור מכסה עבור המכל עם חור במרכז עבור אצבע פליז הקרה.

7.הכנת דוגמאות עבור טיהור קרח-זיקה

1. רקמת הצמח לאקלם הקרה כמתואר בסעיף 2.1.
2. אסוף ~ 100-150 גרם של ביומסה הקרקע (שלב 2.3) ב 20 צינורות מ"ל ומיד יהבהב להקפיא. אפשר לשמור דגימות ב -80 ° C לפני השימוש.
3. כן מדגם כמפורט בסעיפים 2.3-2.5. השתמש 1: יחס 1 (מ"ג של רקמה: מיליליטר של חיץ מיצוי חלבון מקורי) על resuspension של רקמת עלה. בעזרת טאבלטים מעכב פרוטאז נוסף, כדי למנוע הידרדרות של IBPs ידי פרוטאזות אנדוגניים.
   הערה: אם מדגם הרקמות הוא מרוכז מדי, להתאים את היחס אל 1: 2 או 1: 3 (מ"ג של רקמה: מיליליטר של חיץ מיצוי חלבון מקורי).
4. כדי להסיר פסולת הסלולר, מסננת lysate באמצעות 2 שכבות של אריג, 3 פעמים. גלולה פסולת על ידי צנטריפוגה ב 30,000 XG במשך 40 דקות ב 4 °.
5. הגבר את עוצמת הקול של מדגם 120 מ"ל באמצעות חיץ מיצוי חלבון הילידים. השתמש lysate מיד לטיהור זיקה-קרח כדילמנוע אובדן של פעילות מחייבת-קרח.

8. טיהור קרח-זיקת ניצוח

1. לפני טיהור, להגדיר את האמבטיה במים לתכנות כדי לקרר מ -0.5 מעלות צלזיוס כדי -3 ° C בשיעור של -0.04 מעלות צלזיוס / h.
   הערה: שיעור הקירור יכול להיות מותאם בהתאם לכמות הראשונית של המדגם.
2. מצננים את האצבע הקרח -0.5 מעלות צלזיוס ולאחר מכן submerse אותו לתוך צינור 50 מ"ל המכיל מים מזוקקים קרים. להוסיף כמה קוביות קרח כדי להקל התגרענות הקרח ולאפשר בשכבה דקה של קרח להיווצר על האצבע. תהליך זה בדרך כלל לוקח בין 20 לבין 30 דק '.
   הערה: כל גושים על האצבע מצופת קרח צריכה להיות מוחלקים ביד עם כפפה לפני הצבת במדגם. אם שכבת הקרח אינה להיווצר -0.5 מעלות צלזיוס, מנמיכים את הטמפרטורה ל -0.75 מעלות צלזיוס.
3. מקום מדגם בכוס זכוכית 150 מ"ל המכיל בר ומערבבים מגנטי קטן לתוך מיכל קלקר על גבי בוחש מגנטי. ודא כי אצבע הקרח היאמרוכז הוריד לפחות חצי דרך לתוך המדגם הנוזלי. חותם את המכל.
4. אפשר לתוכנית לרוץ יומיים לערך, בדיקת כל 24 h. לאחר 50% מהמדגם מוקפאים, לעצור את התכנית. התאגדות של IBPs לתוך חץ כדור הקרח תגרום "קרח-תחריט".
   הערה: בניסויי טיהור ניתן לעשות זאת באמצעות כרכי מדגם גדולים יותר עם משך הזמן שבו פועל התכנית בהתאם.
5. על מנת להסיר את חצי הכדור קרח, לחמם את החללית 4 ° C, לשטוף בחצי הכדור עם מים מזוקקים כדי להסיר חלבון מאוגד, ואז להפשיר ב- C 4 °.
   הערה: רוב IBPs אינם יציבים במים המאגר המתאים (כלומר 50 מ"מ טריס-HCl, pH 8 או 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 8) יצטרכו להתווסף מעת לעת במהלך תהליך ההפשרה (כ 1 מ"ל / 2 h) . ההמיספרות קרח יכולות להיות עטופות בנייר אלומיניום מאוחסן ב -20 ° C לפני הפשרה.
6. אם בחצי כדור הקרח עדיין מכיליםהפיגמנט של, או להגדיל את טיהור מדגם, חזור על שלבים 8.1-8.5 2-3 פעמים.
   הערה: למרות הריכוז של IBP עשוי להיות נמוך בא סבבים רבים של טיהור, טוהר יקר יותר להניב אם הדגימות המטוהרות תנותחנה באמצעות MS. אם מספיק חומר, שלושה סיבובים של טיהור קרח-זיקה מומלץ.

9. זיהוי IBPs

1. מאז IBPs מוכלים נפח גדול בעקבות הפשרה בחצי הכדור-הקרח, לרכז את הדגימות. תתרכז דגימות המכילות ~ 100 גרם של רקמות כדי ~ 1-3 מ"ל באמצעות צינורות ריכוז צנטריפוגלי עם חתוך מולקולרי 3000 Da משקל, כדי למנוע את אובדן חלבונים קטנים.
2. לפני שליחת דגימות עבור MS, לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות assay כימות חלבון כגון BCA או assay ברדפורד. הערך את הטוהר של דגימות ידי ג'ל אלקטרופורזה כגון SDS-PAGE. בדוק את החלבונים מטוהרים לפעילות IRI לפני sending עבור MS כדי להבטיח כי חלבון פעיל נשמר לאורך שלבי הטיהור וריכוז.
3. השתמשו בדגימות מרוכזת ישירות לניתוח ספקטרומטריית מסה ^10.

תוצאות

כדי להקל על הגדרת, איור 1 ו איור 2 כלולים בייצוגים חזותיים של הציוד המשמש לניתוח IRI וטיהור זיקה לקרח, בהתאמה. תוצאות של ניתוח IRI באמצעות תמציות שנאספו חרדל עשב עם ובלי IBPs מתוארים באיור 3 . תוצאו?...

Discussion

לניתוח והטיהור המוצלח של IBPs, חשוב להבין את טבעו רגיש לטמפרטורה של כמה חלבונים אלה. צמח מסוים IBPs ולהיות יציב בטמפרטורה מעל 0 מעלות צלזיוס, וכתוצאה מכך התגלגלות, משקע וחוסר פעילות. על מנת לקבל IBPs הפעיל, הוא לעתים קרובות קריטי כי צמחים מעובדים בחדר קר (~ 4 ° C) ודגימות נשמרות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic Petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 µm particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic