Identificação de Proteínas de gelo Planta de ligao por meio da avaliação da Inibição de gelo-recristalização e isolamento utilizando purificação por afinidade de gelo

Resumo

Este documento descreve a identificação de proteínas de ligação de gelo a partir de plantas freeze-tolerantes através da avaliação da actividade de inibição de recristalização de gelo e subsequente isolamento de IBPs nativas usando gelo purificação por afinidade.

Resumo

proteínas de ligação de gelo (IBPs) pertencem a uma família de proteínas induzidas por stress que são sintetizados por determinados organismos expostos a temperaturas abaixo de zero. Em plantas, danos causados ​​por congelamento ocorre quando os cristais de gelo crescem extracelulares, resultando na ruptura das membranas plasmáticas e possível morte celular. Adsorção de IBPs de cristais de gelo restringe ainda mais o crescimento de um processo conhecido como inibição de gelo-recristalização (IRI), reduzindo desse modo o dano celular. IBPs também demonstram a capacidade de diminuir o ponto de congelação de uma solução abaixo do ponto de fusão de equilíbrio, uma propriedade conhecida como actividade de histerese térmica (TH). Estas propriedades protectoras despertaram o interesse na identificação de novos IBPs devido ao seu potencial uso em aplicações industriais, médicas e agrícolas. Este artigo descreve a identificação de planta IBPs através de 1) a indução e extracção de IBPs em tecido vegetal, 2) o rastreio de extractos de actividade IRI, e 3) o isolamento e Purificação de IBPs. Após a indução de IBPs por exposição a baixa temperatura, extratos são testados quanto à actividade RII usando um 'ensaio de esmagamento', o que permite a observação do crescimento do cristal de gelo utilizando um microscópio de luz padrão. Este ensaio necessita de uma baixa concentração de proteína e gera resultados que são obtidos rapidamente e facilmente interpretadas, proporcionando uma tela inicial de actividade de ligação de gelo. IBPs pode então ser isolado a partir de proteínas contaminantes, utilizando a propriedade de IBPs para adsorver a gelo, por meio de uma técnica chamada de 'purificação de gelo-afinidade'. Utilizando lisados ​​de células recolhidos a partir de extractos de plantas, um hemisfério de gelo pode ser crescido lentamente em uma sonda de latão. Esta incorpora IBPs na estrutura cristalina do gelo policristalino. Que não requer um conhecimento ou bioquímica estrutural priori do IBP, este método permite a recuperação de proteína activa. fracções de proteína purificada de gelo pode ser utilizado para aplicações a jusante, incluindo a identificação de pepsequências de marés por espectrometria de massa e a análise bioquímica de proteínas nativas.

Introdução

Proteínas de ligação de gelo (IBPs) são uma família diversa de proteínas protectoras que foram descobertas em uma série de organismos, incluindo plantas, insectos ^{1 2, 3,} peixes e micróbios ^4. A principal característica destas proteínas é a sua capacidade única de adsorver especificamente e eficientemente a cristais de gelo, modificando o seu crescimento. IBPs têm várias propriedades documentados, com os dois mais bem caracterizado sendo histerese térmica (TH) e a inibição de gelo-recristalização (IRI). actividade TH é mais facilmente observado em IBPs produzidos em animais freeze-intolerante. Esta actividade resulta no abaixamento do ponto de congelação de fluidos intersticiais ou circulatórias dos organismos para evitar o congelamento. Em contraste, nos organismos freeze-tolerantes, que vai, inevitavelmente, congelar a temperaturas abaixo de zero, IBPs parecem ter baixa actividade TH. Apesar da baixa actividade TH, uma elevada actividade de IRI para restringir grito geloStal é freqüentemente observado com essas proteínas. Para o organismo tolerante ao congelamento, esta actividade IRI presumivelmente ajuda a proteger as células do crescimento descontrolado de gelo em compartimentos extracelulares.

O "botão de colchão" modelo pode ser usado para descrever o mecanismo pelo qual IBPs impedir o crescimento de cristais de gelo ⁵ . Sob este modelo, os IBPs adsorvem-se especificamente à superfície do cristal de gelo a intervalos, de tal modo que as moléculas de água só podem incorporar-se com a rede de cristais de gelo crescente no espaço entre os IBPs ligados. Isto cria uma curvatura que torna a incorporação de moléculas de água adicionais desfavoráveis, um evento que pode ser descrito pelo efeito Gibbs-Thomson ⁶ . A hipótese de águas de clatrato ancoradas proporciona um mecanismo para a ligação específica de IBPs à superfície de cristal de gelo, pelo que a presença de resíduos carregados, especificamente posicionada no local de ligação de gelo de proteína, resulta na reoRGANIZAÇÃO de moléculas de água assim que combinam um ou mais planos da estrutura de cristal de gelo ^7.

actividade TH pode ser quantificado através da medição da diferença entre a fusão e temperaturas de congelação de um único cristal de gelo na presença de um IBP. Embora a actividade TH é um método amplamente aceite de avaliar a actividade de IBPs, o fosso baixo TH produzido pela planta IBPs (normalmente apenas uma fracção de um grau) normalmente requer uma concentração de proteína elevada, equipamento especializado e experiência do operador. Embora não IBPs pode restringir o crescimento de cristais de gelo, que é uma propriedade partilhada por todos os IBPs e, assim, o teste para a actividade de IRI é uma tela inicial eficaz para a presença de IBPs, especialmente para aqueles com baixa actividade TH. A metodologia utilizada para testar esta actividade é conhecido como um 'ensaio de esmagamento', através do qual uma amostra de proteína é congelado rapidamente para produzir uma monocamada de pequenos cristais de gelo, os quais são observados durante um período de tempo para se determinarO crescimento do cristal de gelo é restrito. Ao contrário de outros métodos usados ​​para pesquisar uma amostra de tecido de origem para a presença de IBPs, esta técnica é aplicável a baixas concentrações de proteína no intervalo de 10-100 ng, utiliza equipamento facilmente fabricado e gera dados que são rápida e facilmente interpretados. No entanto, é importante ressaltar que este ensaio proporciona uma primeira tela para IBPs que deve ser seguida pela determinação de TH e formação de cristais de gelo.

O isolamento de proteínas nativas é desafiador, muitas vezes requerendo informação sobre as propriedades estruturais e bioquímicas de uma proteína de interesse. A afinidade de IBPs por gelo permite o isolamento destas proteínas utilizando gelo como substrato para fins de purificação. Uma vez que a maioria das moléculas são empurradas à frente da fronteira gelo-água durante o crescimento de cristais de gelo, o crescimento lento de um hemisfério de gelo na presença de uma amostra IBP resulta numa amostra altamente purificada, desprovida de grande quantits de proteínas contaminantes e solutos. Este método tem sido utilizado para identificar IBPs de insectos ^{8, 9, 10, 11} bactérias, peixes e plantas ^{12 13, 14.} Além disso, as fracções de IBP-enriquecidos obtidos através deste método também podem ser utilizados para análise bioquímica jusante. Este documento descreve a identificação de IBPs em plantas através da indução e extracção de IBPs, a análise da actividade IRI para confirmar a presença de proteínas, e o isolamento de proteínas utilizando a purificação por afinidade de gelo.

Protocolo

Configuração Aparelho 1. Splat

1. Encher um banho de água circulante de temperatura programável com etileno glicol (50% v / v em água).
   NOTA: Verde automóvel etileno-glicol pode ser usado.
2. Para montar a câmara externa, utilizar um tubo de plástico com isolamento para ligar o banho de água para uma bacia de vidro de parede dupla. Isolar a taça de vidro com espuma de poliestireno e cobrir com uma tampa de plástico prato de petri. Cortar um furo 4/3 polegada na parte inferior da câmara de poliestireno de modo a que a fonte de luz pode ser vista através da câmara de vidro.
3. Montar a câmara externa de um microscópio de dissecação, munido com uma porta de câmara e uma lente da objectiva de 4X polarizada com uma lente ocular 10x. Colocar uma peça adicional de película polarizada na parte inferior da câmara exterior.
4. Grampo um tubo de 1-1,5 m (aproximadamente 5 cm de diâmetro) para uma estante de retorta e lugar dentro de um grande recipiente de poliestireno, juntamente com um bloco de arrefecimento posicionado por baixo do tubo na base da estante de retorta.

2. Preparação de proteína nativa Extrai para Análise IRI

1. Para induzir a expressão de IBPs em gramas freeze-tolerantes ou de outras espécies de plantas freeze-tolerantes, plantas aclimatar frio para até 1 semana a 4 ° C, em condições de baixa luminosidade (6 h de luz / 18 horas de escuro). Isto não se aplica para amostras colhidas no campo que já tenham sido expostos a condições de baixa temperatura e períodos de aclimatação.
2. Obter, aproximadamente 0,1 g de tecido de folha através do corte na base do caule e, em seguida, colocar num tubo de 1,5 mL. piscar imediatamente congelar a amostra em azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
3. Para lisar as células, moer amostra de tecido em um pó fino usando um almofariz e pilão em azoto líquido. Certifique-se de que o azoto líquido não evapora durante o processo de homogeneização.
4. Colocar imediatamente amostras trituradas em gelo e permitir que o nitrogénio líquido se evapore completamente. Adicionar 1 ml de uma proteína nativa extractiem tampão contendo Tris-HCl a 10, NaCl 25 mM (pH 7,5), com dois comprimidos de inibidor de protease isento de EDTA adicionado imediatamente antes da utilização. Pipeta para misturar; não vórtice.
   NOTA: Aditivos adicionais podem precisar de ser utilizado se o ligado contém metabolitos secundários (ver discussão).
5. Agitar suavemente as amostras durante a noite (18-24 h) a 4 ° C. Realizar os passos restantes, a 4 ° C.
6. Remover os detritos celulares por centrifugação de amostras a ~ 16000 xg durante 5 min. Reter a fracção solúvel e centrifuga-se durante um adicional de 5 min, se os detritos celulares persistir. As amostras clarificadas pode ser armazenado a -20 ° C até à sua utilização.

3. Ensaio de splat Pré-configuração da experiência

1. Pour 100 mL de hexano para dentro da câmara externa configurada com o filme polarizada e adicionar 5-6 grânulos dessecação para evitar que a humidade acumular-se sobre as lâminas. Adicionar uma pequena quantidade de massa lubrificante de vácuo para a placa de cobertura e o banho de torcer para assegurar uma boa vedação e evitar a evaporação do hexano.
2. Arrefece-se o banho de hexano entre -4 ° C e -6 ° C usando banho de água programável aproximadamente 3/2 h antes de iniciar o experimento. Certifique-se verificar a temperatura do hexano com um termómetro, antes do inicio da experiência.
3. Colocar o bloco de arrefecimento numa caixa de poliestireno directamente abaixo do tubo de plástico e cobrir completamente com gelo seco, 40 min antes de se iniciar o experimento.
4. Antes de iniciar o ensaio, assegurar que o tubo está nivelado. Para determinar onde no bloco de arrefecimento da amostra vai cair, primeiro teste o procedimento com água e indicam onde a amostra de gotas com um marcador (como descrito abaixo).
5. Remover gelo seco a partir do topo do bloco de frio e colocar uma tampa de lâmina de microscópio de vidro sobre o ponto de gota que foi determinada com água.
6. Imediatamente antes de iniciar o ensaio, ligar a fonte de luz e raspe qualquer gelo que se tenha formado na parte inferior da câmara de vidro. Evite manter a fonte de luz a menos cristais de geloestão a ser visualizado para evitar o aquecimento do hexano.

4. Realização do Ensaio de Splat

1. Mergulhar a ponta descartável afixada a uma pipeta automática (1-20 uL) em óleo de imersão, utilizando uma toalha de papel remover qualquer excesso de óleo. Este passo permitirá que a amostra a cair em vez de aderir ao exterior da pipeta.
   Nota: remover o excesso de óleo da pipeta é fundamental para garantir que gotículas de óleo não formam sobre os cristais de gelo, tornando difícil visualização.
2. Pipetar 10 ul de amostra e pipeta lugar directamente sobre o tubo de plástico antes de libertar a amostra. Um som distinto 'splat' deve ser ouvida quando a amostra atinge a lâmina de vidro de cobertura, criando uma monocamada de cristais de gelo.
3. De forma rápida e cuidadosamente remover a lâmina de microscópio do bloco frio usando uma pinça e o lugar em banho de hexano em cima da película de polarização.
4. Olhando sob o microscópio, colocou a lâmina de microscópio para o campo de visão e adapenas a lente da objectiva de modo que a polarização cruzada permite a visualização de cristais de gelo de alto contraste. Ajuste a ampliação 40x.
5. Fixe a câmera ao microscópio e ajustar as configurações para "macro" para permitir a visualização clara de cristais de gelo e capturar a imagem.
   NOTA: À espera de até 1 h para permitir que os cristais de gelo a crescer pode dar uma imagem mais clara.
6. Repita os passos de 4,1-4,5 para todas as amostras. Tipicamente, coloca-se a 6 desliza com uma amostra diferente na câmara de hexano.
7. Desligar a fonte de luz e colocar uma placa de plástico por cima do banho de hexano, garantindo uma vedação estanque. Permitir que os cristais de gelo para hibridar durante a noite (12-24 h, mantendo um período de recozimento consistente dentro de um determinado ensaio). A seguir à incubação, as imagens de captura dos filmes de gelo tal como descrito acima.
   Nota: Algumas amostras podem recristalizar mais rapidamente do que outros. Se não recristalização é aparente depois de 12 h, deixar cristais para recozer durante até 24 h, para assegurar que nenhum recrystallização irá ocorrer.

Análise 5. Splat Ensaio de Dados

1. Enviar as fotos para o computador e comparar diretamente o tamanho dos cristais de gelo antes e após recozimento. As amostras com actividade gelo recristalização não irão crescer, enquanto que as amostras sem nenhuma actividade IRI recristalizar formação de cristais de gelo visivelmente maiores. interferência da luz vai fazer grandes cristais de gelo aparecer em ligeiramente diferentes matizes e, portanto, são fáceis de ver.

6. Ice-afinidade Setup Purificação Equipment

1. Encher um banho de água circulante de temperatura programável com etileno-glicol. Verde etileno glicol automóvel pode ser utilizado.
2. Ligar o banho de uma sonda oca, latão utilizando tubo de plástico com isolamento ^15.
3. Construir um contentor de poliestireno dentro do qual um copo de 150 mL pode estar apertado. Criar uma tampa para o recipiente com um buraco no centro para o dedo frio de bronze.

7.Preparação de amostras para a purificação por afinidade de gelo

1. aclimatar frio tecido da planta, tal como descrito na secção 2.1.
2. Recolhe ~ 100-150 g da biomassa do solo (passo 2.3) em 20 mL e tubos de flash imediatamente congelar. As amostras podem ser mantidos à temperatura de -80 ° C antes da utilização.
3. Prepare a amostra, tal como descrito nas secções 2,3-2,5. Usar uma proporção 1: 1 (mg de tecido: mL de tampão de extracção de proteína nativa) para a ressuspensão de tecido foliar. Use comprimidos inibidores da protease adicionais para evitar a degradação de IBPs por proteases endógenas.
   NOTA: Se a amostra de tecido é demasiado concentrada, para ajustar a relação de 1: 2 ou 1: 3 (mg de tecido: mL de tampão de extracção de proteína nativa).
4. Para remover os restos celulares, o lisado crivo através de 2 camadas de gaze, 3 vezes. Sedimentar os detritos por centrifugação a 30000 xg durante 40 min a 4 ° C.
5. Aumentar o volume da amostra para 120 ml usando tampão de extracção de proteína nativa. Usar o lisado imediatamente para purificação por afinidade de geloevitar qualquer perda de actividade de ligação ao gelo.

8. A realização de purificação de gelo-afinidade

1. Antes da purificação, definir o banho de água para arrefecer programável de -0,5 ° C a -3 ° C a uma taxa de -0,04 ° C / h.
   NOTA: A taxa de arrefecimento pode ser ajustada de acordo com o volume inicial da amostra.
2. Arrefece-se o dedo de gelo para -0,5 ° C e subsequentemente mergulhe para um tubo de 50 ml contendo água destilada fria. Adicionar alguns pedaços de gelo para facilitar a nucleação de gelo e deixa uma camada fina de gelo de modo a formar no dedo. Este processo geralmente leva entre 20 e 30 min.
   Nota: Todas as protuberâncias sobre o dedo revestido com gelo, deve ser alisada com uma mão enluvada antes de colocar em amostra. Se uma camada de gelo não se forma a -0,5 ° C, baixar a temperatura de -0,75 ° C.
3. Colocar a amostra em um copo de vidro de 150 ml contendo uma pequena barra de agitação magnética para uma caixa de poliestireno por cima de um agitador magnético. Certifique-se de que o dedo de gelo écentrado e reduzido, pelo menos, a meio caminho para o líquido amostra. Selar o recipiente.
4. Permitir que o programa seja executado por cerca de dois dias, verificando a cada 24 h. Uma vez que 50% da amostra é congelada, parar o programa. Incorporação de IBPs para o hemisfério de gelo irá resultar em "ice-ataque".
   NOTA: experiências de purificação pode ser feito usando maiores volumes de amostra com o comprimento de tempo no qual o programa é executado ajustada em conformidade.
5. A fim de remover o hemisfério de gelo, aquecer a sonda a 4 ° C, lavar o hemisfério com água destilada para remover a proteína não ligada, e então descongelar a 4 ° C.
   NOTA: A maioria dos IBPs não são estáveis em água e um tampão apropriado (por exemplo, Tris-HCl a 50, pH 8 ou 50 mM de bicarbonato de amónio, pH 8) terá que ser adicionado periodicamente durante o processo de descongelamento (cerca de 1 mL / 2 h) . hemisférios de gelo pode ser embrulhado em papel de alumínio e armazenadas a -20 ° C antes de descongelação.
6. Se o gelo do hemisfério ainda contêms pigmento, ou para aumentar a purificação da amostra, repetir os passos 8.1-8.5 2-3 vezes.
   Nota: Embora a concentração de IBP pode ser inferior a seguir várias rondas de purificação, a pureza é mais valioso do que o rendimento se as amostras purificadas serão analisadas usando o MS. Se o material está disponível suficiente, três ciclos de purificação de gelo-afinidade é recomendado.

9. Identificação de IBPs

1. Desde IBPs estão contidos em um grande volume seguinte descongelamento do gelo hemisférico, concentrar as amostras. Concentra-se amostras contendo ~ 100 g de tecido a ~ 1-3 ml utilizando tubos de concentração centrífugas com um 3000 Da de peso molecular de corte para evitar a perda de proteínas pequenas.
2. Antes de enviar amostras para MS, determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de quantificação de proteína, tais como um BCA ou ensaio de Bradford. Estimar a pureza das amostras por electroforese em gel, tais como SDS-PAGE. Testar as proteínas purificadas para a actividade antes de se IRInding para MS para assegurar que a proteína activa foi conservada ao longo das etapas de purificação e concentração.
3. Use amostras concentradas directamente para análise por espectrometria de massa ^10.

Resultados

Para facilidade de afinação, a Figura 1 e Figura 2 estão incluídos como representações visuais do equipamento utilizado para a análise e purificação de IRI gelo-afinidade, respectivamente. Os resultados da análise IRI usando extractos recolhidos a partir de plantas daninhas mostarda com e sem IBPs estão representados na Figura 3. Estes resultados mostram que os extracto...

Discussão

Para a análise bem sucedida e purificação de IBPs, é importante compreender a natureza sensível à temperatura de algumas destas proteínas. Determinada planta IBPs tornar-se instável a temperaturas acima de 0 ° C, resultando no desdobramento, precipitação e inactividade. A fim de obter IBPs activas, é muitas vezes crítico que as plantas são transformadas numa sala fria (~ 4 ° C) e as amostras são mantidas em gelo durante a experimentação. Outro factor a considerar quando se usa lisados ​​brutos de c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic Petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 µm particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic