Identification des protéines végétales se liant à glace par l'évaluation de l'inhibition de recristallisation de glace et isolement utilisant purification Ice-affinité

Résumé

Le présent document décrit l'identification des protéines de liaison à la glace à partir de plantes tolérantes au gel grâce à l'évaluation de l'activité d'inhibition de la recristallisation de la glace et l'isolement subséquent de IBP natives en utilisant une purification par affinité de la glace.

Résumé

protéines se liant à glace (IBP) appartiennent à une famille de protéines de stress induit qui sont synthétisés par certains organismes exposés à des températures inférieures à zéro. Chez les plantes, les dommages se produit lorsque le gel des cristaux de glace extracellulaire se développent, entraînant la rupture des membranes plasmiques et la mort cellulaire possible. Adsorption de IBP à des cristaux de glace limite la croissance par un procédé connu sous le nom d'inhibition de la glace recristallisation (IRI), réduisant ainsi les dommages cellulaires. IBP démontrent également la capacité d'abaisser le point de congélation d'une solution en dessous du point de fusion d'équilibre, une propriété connue sous le nom de l'activité hystérésis thermique (TH). Ces propriétés protectrices ont suscité un intérêt dans l'identification de nouveaux IBP en raison de leur utilisation potentielle dans des applications industrielles, médicales et agricoles. Ce document décrit l'identification de la plante IBP par 1) l'induction et l'extraction de IBP dans le tissu végétal, 2) le criblage d'extraits pour l'activité IRI, et 3) l'isolement et la purification de IBP. Suite à l'induction de l'IBP par exposition à basse température, les extraits sont testés pour l'activité IRI en utilisant un « test de splat », qui permet l'observation de la croissance des cristaux de glace à l'aide d'un microscope optique standard. Ce test nécessite une faible concentration en protéine et génère des résultats qui sont obtenus rapidement et facilement interprétables, en fournissant un écran initial de l'activité de liaison de la glace. IBP peut ensuite être isolé à partir de protéines contaminantes en utilisant la propriété de IBP pour adsorber à la glace, par une technique appelée «purification par affinité de la glace. L'utilisation lysats de cellules recueillies à partir d'extraits de plantes, un hémisphère de glace peut être cultivé lentement sur une sonde en laiton. Celui-ci incorpore IBP dans la structure cristalline de la glace polycristallin. Ne nécessitant aucune connaissance biochimique ou structurelle a priori de l'IBP, ce procédé permet la récupération de la protéine active. fractions protéiques de glace purifiés peuvent être utilisés pour des applications en aval, y compris l'identification des pepséquences de marées par spectrométrie de masse et l'analyse biochimique des protéines natives.

Introduction

Des protéines de liaison glace (IBP) sont une famille diversifiée de protéines protectrices qui ont été découvertes dans un certain nombre d'organismes , y compris les plantes, les insectes ^{1 2 3,} les poissons et les microbes ^4. La principale caractéristique de ces protéines est leur capacité unique à adsorber spécifiquement et efficacement aux cristaux de glace, modifiant leur croissance. IBP possède plusieurs propriétés documentées, avec les deux plus bien caractérisés étant hystérésis thermique (TH) et l'inhibition de la recristallisation de la glace (IRI). l'activité TH est plus facilement observée dans IBP chez les animaux de gel intolérants. Cette activité se traduit par abaissement du point de congélation des fluides circulatoires ou interstitiel organismes pour éviter le gel. En revanche, dans les organismes de gel tolérant, qui inévitablement geler à des températures inférieures à zéro, IBP semblent avoir une activité faible TH. En dépit de la faible activité TH, une forte activité IRI pour limiter le cri de la glacela croissance Stal est souvent observée avec ces protéines. Pour l'organisme tolérant le gel, cette activité IRI permet vraisemblablement de protéger les cellules de la croissance incontrôlée de la glace dans les compartiments extracellulaires.

Le modèle « bouton de matelas » peut être utilisé pour décrire le mécanisme par lequel IBP prévenir la croissance des cristaux de glace ^5. Selon ce modèle, IBP adsorber spécifiquement à la surface des cristaux de glace à des intervalles, de telle sorte que les molécules d'eau ne peuvent incorporer avec le réseau cristallin de la glace de plus en plus dans l'espace entre IBP lié. Cela crée une courbure qui rend l'incorporation de molécules d'eau supplémentaires défavorables, un événement qui peut être décrit par l'effet Gibbs-Thomson ^6. L'hypothèse ancrée de l'eau de clathrate fournit un mécanisme pour la liaison spécifique de IBP à la surface des cristaux de glace de sorte que la présence de résidus chargés, en particulier placés sur le site de liaison de protéine de la glace, les résultats dans le reorganism des molécules d'eau afin qu'ils correspondent à un ou plusieurs plans du réseau cristallin de la glace ^7.

activité TH peut être quantifiée en mesurant la différence entre les températures de fusion et de congélation d'un seul cristal de glace en présence d'un IBP. Bien que l'activité TH est une méthode d'évaluation de l'activité de IBP, le faible écart de TH largement acceptée produite par l'usine IBP (typiquement seulement une fraction d'un degré) exige normalement une concentration élevée en protéines, un équipement spécialisé et de l'expérience de l'opérateur. Bien que non-IBP peut limiter la croissance des cristaux de glace, il est une propriété partagée par tous IBP et tester ainsi l'activité IRI est un écran initial efficace pour la présence de IBP, en particulier pour ceux qui ont une faible activité TH. La méthode utilisée pour tester cette activité est connu comme un « essai de floc », par lequel un échantillon de protéine est éclair congelée pour produire une monocouche de petits cristaux de glace, qui sont observées sur une période de temps pour déterminer sila croissance des cristaux de glace est limité. Contrairement à d'autres méthodes utilisées pour cribler un échantillon de tissu source pour la présence d'IBP, cette technique est applicable à de faibles concentrations de protéines dans l'intervalle de 10 à 100 ng, utilise un équipement facilement fabriqué, et génère des données qui sont rapidement et facilement interprétée. Cependant, il est important de souligner que cette analyse fournit un écran initial pour IBP qui devrait être suivi par la détermination de la TH et mise en forme de cristaux de glace.

L'isolement des protéines natives est difficile, ce qui nécessite souvent des informations sur les propriétés structurales et biochimiques d'une protéine d'intérêt. L'affinité des IBP pour la glace permet l'isolement de ces protéines en utilisant de la glace en tant que substrat à des fins de purification. Etant donné que la majorité des molécules sont poussés en avant de la limite de l'eau glacée pendant la croissance des cristaux de glace, la croissance lente d'une hémisphère de la glace en présence d'un échantillon des résultats d'IBP dans un échantillon hautement purifié, exempt de grande quantits de protéines contaminantes et des solutés. Cette méthode a été utilisée pour identifier des insectes IBP ^{8, 9, 10, 11} les bactéries, les poissons et les plantes ^{12 13, 14.} En outre, les fractions enrichies en IBP obtenus par ce procédé peuvent également être utilisés pour l'analyse biochimique en aval. Le présent document décrit l'identification de IBP dans les plantes par l'induction et l'extraction de IBP, l'analyse de l'activité IRI pour confirmer la présence de protéines, et l'isolement des protéines en utilisant une purification par affinité de la glace.

Protocole

1. Appareil d'installation Splat

1. Remplir un bain à circulation d'eau à température programmable avec l'éthylène glycol (50% v / v dans l'eau).
   REMARQUE: l'éthylène glycol automobile vert peut être utilisé.
2. Pour assembler la chambre externe, utiliser un tube en plastique isolant pour fixer le bain d'eau dans un bol en verre à double paroi. Isoler le bol en verre avec de la mousse de polystyrène et couvrir d'un couvercle de boîte de Pétri en plastique. Découper un trou 3-4 pouces dans le fond de la chambre de polystyrène de sorte que la source de lumière peut être vu à travers la chambre de verre.
3. Monter la chambre externe sur un microscope de dissection, muni d'un port d'appareil photo et un objectif polarisé 4X avec une lentille oculaire de 10x. Placer une pièce supplémentaire de pellicule polarisée dans le fond de la chambre externe.
4. Fixer un tube de 1 à 1,5 m (~ 5 cm de diamètre) sur un support de cornue et place à l'intérieur d'un grand récipient en polystyrène, avec un bloc de refroidissement placé en dessous du tube au niveau de la base du support de cornue.

2. Préparation de la protéine native extraits pour IRI Analyse

1. Pour induire l'expression de IBP dans les herbes de congélation à tolérance ou d'autres espèces de plantes tolérantes au gel, les plantes de s'acclimater à froid pendant 1 semaine à 4 ° C, dans des conditions de faible éclairage (6 h de lumière / 18 h d'obscurité). Cela ne concerne pas les échantillons prélevés sur le terrain qui ont déjà été exposés à des conditions de basse température et des périodes d'acclimatation.
2. Obtenir environ 0,1 g de tissu de feuille en coupant à la base de la tige et placer dans un tube de 1,5 mL. clignote immédiatement congeler l'échantillon dans l'azote liquide et stocker à -80 ° C jusqu'à utilisation.
3. Pour lyser les cellules, broyer l'échantillon de tissu en une poudre fine en utilisant un mortier et un pilon sous azote liquide. Assurez-vous que l'azote liquide ne s'évapore pas pendant le processus d'homogénéisation.
4. Immédiatement placer des échantillons de sol sur de la glace et de permettre à l'azote liquide à évaporer complètement. Ajouter 1 ml d'une protéine native de extractile tampon contenant du Tris-HCl 10 mM, NaCl 25 mM (pH 7,5), avec deux comprimés d'inhibiteur de protease exempt d'EDTA a été ajoutée immédiatement avant utilisation. Pipette à mélanger; ne pas vortexer.
   REMARQUE: Des additifs supplémentaires peuvent devoir être utilisés si le lysat contient des métabolites secondaires (voir la discussion).
5. Agiter doucement pendant une nuit échantillons (18-24 h) à 4 ° C. Effectuer les étapes suivantes à 4 ° C.
6. Retirer les débris cellulaires par centrifugation des échantillons à ~ 16 000 g pendant 5 min. Maintenir la fraction soluble et centrifuger pendant 5 min de plus si les débris cellulaires persiste. échantillons éclaircis peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation.

3. Splat dosage pré-montage expérimental

1. Verser 100 ml d'hexane dans la chambre externe mis en place avec le film polarisé et ajouter 5-6 perles de dessiccation pour empêcher l'accumulation d'humidité sur les diapositives. Ajouter une petite quantité de graisse à vide à la plaque de recouvrement du bain et de le tordre pour assurer un joint étanche et d'empêcher l'évaporation de l'hexane.
2. On refroidit le bain d'hexane entre -4 ° C et -6 ° C en utilisant un bain d'eau programmable environ 2-3 h avant de commencer l'expérience. Assurez-vous de vérifier la température de l'hexane avec un thermomètre avant de commencer l'expérience.
3. Placer le bloc de refroidissement dans une boîte de polystyrène directement en dessous du tube en matière plastique et recouvrir complètement avec de la glace sèche, 40 min avant de commencer l'expérience.
4. Avant de commencer l'essai, assurez-vous que le tube soit de niveau. Pour déterminer où le bloc de refroidissement de l'échantillon baissera, premier test de la procédure avec de l'eau et indiquer où l'échantillon tombe avec un marqueur (comme décrit ci-dessous).
5. Retirer la glace sèche de la partie supérieure du bloc froid et placer un couvercle microscope en verre coulissant sur la marque de baisse qui a été déterminée avec de l'eau.
6. Immédiatement avant le dosage de départ, allumer la source de lumière et gratter la glace qui est formé sur le fond de la chambre de verre. Evitez de garder la source de lumière à moins que des cristaux de glacesont visualisées pour empêcher le chauffage de l'hexane.

4. Effectuer le test Splat

1. Tremper l'embout jetable fixé à une pipette automatique (1-20 ul) dans de l'huile d'immersion, en utilisant une serviette en papier enlever tout excès d'huile. Cette étape permettra à l'échantillon à l'automne plutôt que d'adhérer à l'extérieur de la pipette.
   REMARQUE: Enlever l'huile en excès de la pipette est essentielle pour faire en sorte que des gouttelettes d'huile ne forment pas sur les cristaux de glace, ce qui rend la visualisation difficile.
2. Pipeter 10 uL de l'échantillon et de la pipette lieu directement au-dessus des tubes en plastique avant de libérer l'échantillon. Un son « Splat » distincte doit être entendu lorsque l'échantillon touche la lamelle de verre, créant ainsi une monocouche de cristaux de glace.
3. Enlever rapidement et soigneusement la lame de microscope à partir du bloc à froid en utilisant des pinces et les placer dans le bain d'hexane sur le dessus du film polarisant.
4. Regarder sous le microscope, mettre la lame de microscope dans le champ de vision et annoncejuste l'objectif de sorte que la polarisation croisée permet de visualiser des cristaux de glace de contraste élevé. Régler le grossissement de 40x.
5. Fixez l'appareil photo au microscope et régler les paramètres de « macro » pour permettre la visualisation claire des cristaux de glace et de capturer l'image.
   NOTE: En attente jusqu'à 1 h pour permettre des cristaux de glace se développer peut donner une image plus claire.
6. Répétez les étapes pour 04.01 à 04.05 tous les échantillons. Typiquement, placer jusqu'à 6 coulisse avec un autre échantillon dans la chambre d'hexane.
7. Éteindre la source de lumière et placer une plaque en matière plastique sur le bain d'hexane, assurant un joint étanche. Permettre aux cristaux de glace à hybrider pendant une nuit (12-24 h, en maintenant une période de recuit conforme dans un essai particulier). Après l'incubation, de capturer des images des films de glace comme décrit ci-dessus.
   NOTE: Certains échantillons peuvent recristalliser plus rapidement que d'autres. Si aucune recristallisation est apparente après 12 h, permettre aux cristaux de recuire jusqu'à 24 h pour veiller à ce qu'aucun recrystallisation se produira.

5. Splat Essai d'analyse des données

1. Téléchargez les photos sur un ordinateur et comparer directement la taille des cristaux de glace avant et après recuit. Les échantillons ayant une activité de recristallisation de la glace ne se développera pas, tandis que les échantillons sans aucune activité IRI recristalliser la formation de cristaux de glace beaucoup plus grands. interférence de la lumière fera de grands cristaux de glace apparaissent dans des teintes légèrement différentes et sont donc faciles à voir.

6. Ice affinité Configuration Matériel de purification

1. Remplir un bain à circulation d'eau à température programmable avec l'éthylène glycol. l'éthylène glycol automobile vert peut être utilisé.
2. Connecter le bain à une sonde creuse, de laiton en utilisant un tube en matière isolante ^15.
3. Construction d'un récipient en polystyrène, dans lequel un bécher de 150 ml peut adapter snuggly. Créer un couvercle pour le récipient avec un trou au centre pour le laiton doigt froid.

7.Préparation des échantillons pour la purification Ice-affinité

1. tissu végétal froid s'acclimater comme décrit dans la section 2.1.
2. Recueillir ~ 100-150 g de la biomasse aérienne (étape 2.3) dans des tubes de 20 ml et immédiatement congeler clignoter. Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C avant utilisation.
3. Préparer l'échantillon comme décrit dans les sections 2.3-2.5. Utilisez un rapport 1: 1 (mg de tissu: mL de tampon d'extraction de la protéine native) pour la remise en suspension du tissu foliaire. Utilisation des comprimés d'inhibiteur de protease supplémentaires pour éviter la dégradation de l'IBP par des proteases endogènes.
   REMARQUE: si l'échantillon de tissu est trop concentré, ajuster le rapport de 1: 2 ou 1: 3 (mg de tissu: mL de tampon d'extraction de la protéine native).
4. Pour éliminer les débris cellulaires, du lysat tamis à travers 2 couches de gaze, 3 fois. Sédimenter les débris par centrifugation à 30 000 xg pendant 40 min à 4 ° C.
5. Augmenter le volume de l'échantillon à 120 ml en utilisant un tampon d'extraction de la protéine native. Utiliser immédiatement le lysat pour la purification par affinité de la glaceéviter toute perte d'activité de liaison de la glace.

8. La conduite Purification Ice-affinité

1. Avant purification, mettre le bain d'eau pour refroidir programmable de -0,5 ° C à -3 ° C à une vitesse de -0,04 ° C / h.
   NOTE: La vitesse de refroidissement peut être ajustée en fonction du volume initial de l'échantillon.
2. On refroidit le doigt de glace à -0,5 ° C et immerger ensuite dans un tube de 50 ml contenant de l'eau distillée froide. Ajouter quelques morceaux de glace pour faciliter la nucléation de la glace et laisser une mince couche de glace se forme sur le doigt. Ce processus prend généralement entre 20 et 30 min.
   REMARQUE: Tous les morceaux sur le doigt enduit glace doivent être lissées avec une main gantée avant de placer dans l'échantillon. Si une couche de glace ne se forme pas à -0,5 ° C, abaisser la température de -0,75 ° C.
3. Placer l'échantillon dans un bêcher en verre de 150 ml contenant un petit barreau d'agitation magnétique dans un récipient en polystyrène au-dessus de l'agitateur magnétique. Assurez-vous que le doigt de glacecentré et réduit au moins à moitié dans l'échantillon liquide. Sceller le récipient.
4. Autoriser le programme à fonctionner pendant environ deux jours, vérifier toutes les 24 h. Une fois que 50% de l'échantillon est gelé, arrêtez le programme. L'incorporation de IBP dans l'hémisphère de glace se traduira par « la glace de gravure ».
   REMARQUE: les expériences de purification peuvent être effectuées en utilisant des échantillons plus volumineux avec la durée au cours de laquelle le programme se exécute ajustés en conséquence.
5. Afin d'éliminer l'hémisphère de glace, réchauffer la sonde à 4 ° C, rincer l'hémisphère avec de l'eau distillée pour éliminer la protéine non liée, puis décongeler à 4 ° C.
   REMARQUE: La plupart IBP ne sont pas stables dans l' eau et un tampon approprié ( par exemple Tris-HCl 50 mM, pH 8 ou 50 mM de bicarbonate d'ammonium, pH 8) doit être ajoutée périodiquement au cours du processus de décongélation (approximativement 1 mL / 2 h) . hémisphères de glace peuvent être enveloppés dans une feuille d'aluminium et conservés à -20 ° C avant la décongélation.
6. Si l'hémisphère de glace contiennent encores pigment, ou pour augmenter la purification de l'échantillon, répéter les étapes 2-3 8,1-8,5 fois.
   NOTE: Bien que la concentration IBP peut être inférieure à la suite de plusieurs cycles de purification, la pureté est plus précieux que le rendement si les échantillons purifiés seront analysés à l'aide de MS. Si le matériel disponible est suffisante, trois cycles de purification de la glace affinité est recommandée.

9. Identification des IBP

1. Depuis IBP sont contenus dans un grand volume après la décongélation de l'hémisphère de glace, concentrer les échantillons. échantillons concentré contenant ~ 100 g de tissu de ~ 1-3 ml en utilisant des tubes centrifuges de concentration avec un poids moléculaire de 3000 Da coupure pour éviter la perte de petites protéines.
2. Avant d'envoyer des échantillons de sclérose en plaques, déterminer la concentration de protéine en utilisant un essai de quantification de protéine tel qu'un BCA ou le dosage de Bradford. Estimer la pureté des échantillons par électrophorèse sur gel tels que le SDS-PAGE. Testez les protéines purifiées pour l'activité IRI avant sePour MS pour s'assurer que la protéine active a été conservée par les étapes de purification et de concentration.
3. Utiliser des échantillons concentrés directement pour l'analyse par spectrométrie de masse ¹⁰ .

Résultats

Pour faciliter l'installation, la figure 1 et Figure 2 sont inclus comme des représentations visuelles de l'équipement utilisé pour l' analyse et la purification IRI glace-affinité, respectivement. Résultats de l' analyse IRI en utilisant des extraits recueillis à partir des mauvaises herbes de moutarde avec et sans IBP sont représentés sur la figure 3. Ces...

Discussion

Pour l'analyse réussie et la purification de IBP, il est important de comprendre la nature sensible à la température de certaines de ces protéines. Certaines plantes IBP instable à des températures supérieures à 0 ° C, ce qui se déroule, les précipitations et l'inactivité. Afin d'obtenir IBP actifs, il est souvent indispensable que les plantes sont traitées dans une chambre froide (~ 4 ° C) et les échantillons sont maintenus sur de la glace pendant l'expérimentation. Un autre facteur à c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic Petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 µm particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic